Name: 울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 배우세요 혈청 대규모 비타겟 대사체 프로파일링을 위한 UPLC-MS 방법을 통해 신뢰할 수 있는 대사체 추출 및 분석 기술을 습득하세요. 이 프로토콜은 생체 내 소분자 바이오마커 식별에 활용됩니다.

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제시된 튜토리얼은 콜로라도 주립 대학의 단백질체학 및 대사체학 시설(Proteomics and Metabolomics Facility)에서 수행 및 개발되었으며, 이 시설은 CSU Research Administration Resources for Scholarly Projects에서 부분적으로 자금을 지원합니다.

1. 샘플 구성
<ol>
	<li>스프레드시트에서 샘플 준비를 위한 플레이트 맵을 만들려면 첫 번째 열에 로딩 순서대로 샘플 목록을 입력합니다. 두 번째 열에서 오토샘플러 소프트웨어에 대한 올바른 명명법을 사용하여 96개의 웰 플레이트 위치를 입력합니다.</li>
	<li>QC 샘플을 위해 각 플레이트에 하나의 우물을 저장하십시오.</li>
	<li>LC 자동시료주입기가 한 번에 두 개의 플레이트를 처리할 수 있는 경우, 시료 목록을 190개의 배치로 분리하고 이 정보를 두 번째 워크시트에 저장하십시오.</li>
	<li>이러한 각 배치 내에서 randomize 함수[참고: Excel의 "=rand()"]를 사용하여 주입 순서를 임의화합니다. 이제 주입 주문을 복사하여 LC-MS 시료 대기열 소프트웨어 시스템에 붙여넣습니다. 무작위 추출은 배치 간, 배치 내에서 발생해야 하며 주입 반복 전반에 걸쳐 고유해야 합니다.</li>
</ol>
2. 혈청 및 품질 관리(QC) 샘플 준비 절차
<ol>
	<li>실험의 크로마토그래피 용출에 걸쳐 알려진 질량 및 머무름 시간의 화합물 4개 이상을 포함하는 QC 샘플 10ml 스톡을 준비합니다. (참고: 카페인, 레세르핀, 설파디메톡신 및 테르페나딘은 각각 2μg/ml 농도).</li>
	<li>혈청 샘플을 얼음 위에서 해동하고 ~5초 동안 부드럽게 소용돌이칩니다.</li>
	<li>12채널 피펫터의 팁을 메탄올로 미리 적셔 시료 분주 중 팁이 떨어지는 것을 방지합니다. 그런 다음 370 μl의 차가운 메탄올을 96 웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>각 샘플의 100μl를 플레이트 맵에서 해당 플레이트 위치로 이동합니다. 플레이트를 덮고 -80 °C에서 30 분 동안 배양하여 단백질을 침전시킵니다.</li>
	<li>3,200 x g의 4°C 원심분리기에서 30분 동안 플레이트를 회전시키고 250μl의 상등액을 새로운 96웰로 옮기고 원심분리를 반복합니다.</li>
	<li>이제 60μl의 상등액 분취액을 UPLC 또는 LC 자동시료주입기에 적합한 3개의 96웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
	<li>100μl의 QC 샘플 혼합물을 플레이트의 예약된 웰 위치에 추가합니다.</li>
	<li>각 플레이트를 접착 필름으로 밀봉하십시오. 용제는 웰을 뚫은 후 빠르게 증발할 수 있으므로 주입은 각 플레이트에서 한 번만 수행해야 합니다. 샘플 대기열의 플레이트는 -20°C에서 단기적으로 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>
3. UPLC-MS 데이터 수집
<ol>
	<li>오토샘플러를 4°C로 설정하고 처음 두 개의 플레이트를 오토샘플러에 넣습니다.</li>
	<li>두 가지 대안적인 역위상 구배(reverse phase gradients) 중 하나를 사용하여 획득 방법을 설정합니다. 그래디언트 A는 비극성 분자에 편향되어 있는 반면 그래디언트 B는 중간 극성 분자에 대한 향상된 적용 범위를 제공합니다.
	<ol>
		<li>그라디언트 A: 
		<테이블 테두리="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>시간(분)</td>
					<td>%ᅡ</td>
					<td>%비</td>
					<td>커브</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0.0</td>
					<td>100</td>개
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0.1</td>
					<td>100</td>개
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1.0</td> 호
					<td>60</td>의
					<td>40</td>의
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>3.0</td> 호
					<td>30</td>분
					<td>70</td>의
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>11.0</td>년
					<td>0</td>
					<td>100</td>개
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17.0</td>년
					<td>0</td>
					<td>100</td>개
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17.1</td>년
					<td>100</td>개
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>23.0</td>
					<td>100</td>개
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>그라디언트 B 
		<테이블 테두리="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>시간(분)</td>
					<td>%ᅡ</td>
					<td>%비</td>
					<td>커브</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0.0</td>
					<td>100</td>개
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1</td> 개
					<td>100</td>개
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>13</td>세
					<td>5</td> 개
					<td>95</td>의
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16</td>세
					<td>5</td> 개
					<td>95</td>의
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16월 5</td>일
					<td>100</td>개
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20</td>분
					<td>100</td>개
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>50-1,200m/z의 포지티브 모드 스캔에서 데이터를 수집하도록 질량 분석기를 설정합니다. 추가 특정 기기 조건은 사용하는 시스템에 따라 다릅니다. 다음은 Waters Xevo G2 Q-TOF 질량 분석기에서 사용되는 조건을 나타냅니다. 충돌 에너지 = 6V; 스캔 시간 = 스캔당 0.2초; 모세관 전압 = 2,200V; 소스 온도 = 150 °C 탈용매화 온도 = 350 °C 탈용매화 가스 유량 (N2) = 800 L/hr).</li>
	<li>샘플의 각 2-플레이트 배치의 시작 부분에 QC 샘플을 5회 주입합니다. 처음 두 번의 주입으로 UPLC-MS 시스템을 컨디셔닝한 후 세 번째에서 다섯 번째 주입의 피크 면적(<25% RSD), 머무름 시간(+/- 0.05분) 및 질량 정확도(+/- 3ppm)를 모니터링합니다. 이러한 매개변수는 데이터 수집에 사용되는 기기의 사양에 맞게 조정해야 할 수 있습니다.</li>
	<li>QC 샘플이 통과하면 이 두 플레이트의 혈청 샘플에 대한 데이터를 획득합니다. QC 샘플이 실패하면 문제가 해결되고 QC 샘플이 통과할 때까지 샘플 데이터가 수집되지 않습니다. 우리 실험실에서 우리는 이러한 매개변수가 주입 3일 동안(즉, 2개의 96웰 플레이트 주입) 일관되게 안정적이라는 것을 발견했습니다. 이 기간 동안 시스템이 불안정한 것으로 확인되면 더 자주 QC 주입이 적절할 수 있습니다. QC 샘플은 저품질 데이터를 수정하는 것이 아니라 저품질 데이터가 수집되는 것을 방지하는 데 사용됩니다.</li>
</ol>
4. 피크 감지, 통합, 정렬 및 정규화
프리웨어 및 공급업체별 도구를 포함하여 이러한 단계를 수행할 수 있는 다양한 옵션이 있습니다. 이 단계는 비디오 자습서에서 건너뛰었지만 아래 접근 방식은 예로 설명되어 있습니다.
각 샘플에 대해 이러한 유형의 실험에서 생성된 분석 데이터는 머무름 시간, m/z 값 및 스펙트럼 강도로 설명되는 이온 프로파일입니다. 비표적 대사 산물 프로파일링 실험은 많은 샘플로 구성되므로 데이터 세트의 후속 통계 분석을 가능하게 하기 위해 피크 검출, 머무름 시간 정렬 및 정규화를 수행해야 합니다.
<ol>
	<li>Waters DataBridge 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 .cdf 형식으로 내보냅니다. XCMS 소프트웨어 패키지 10 (프리웨어는 <a href="http://metlin.scripps.edu/xcms/" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/xcms/)에서 사용 가능하며</a> R 통계 환경11에서 실행됨)을 사용하여 피크 감지 및 체류 시간 정렬을 수행합니다. 웹 사이트에는 소프트웨어를 다운로드하고 실행하는 방법에 대한 설명서가 포함되어 있습니다.</li>
	<li>XCMS 내에서 다음 파라미터와 함께 "matchedfilter" 방법을 사용합니다: 최대 절반에서 전체 너비 = 8초, S/N 비율 = 3, 추출된 각 이온 크로마토그램에 대해 최대 100개의 피크. 특징 그룹화, 머무름 시간 보정, 재그룹화 및 fillPeaks 단계를 수행합니다. XCMS 소프트웨어의 출력은 검출 가능한 모든 특징이 행으로 나열되고, 각 실험 샘플이 열로 나열되며, 셀은 각 샘플에서 각 특징의 피크 영역으로 채워지는 데이터 매트릭스입니다. 이 데이터 세트의 전치는 다운스트림 통계 워크플로우에 통합하기 위해 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>주어진 샘플에서 각 특징의 피크 면적을 추출된 이온 피크 면적의 합으로 나누어 R에서 데이터 매트릭스를 정규화합니다(총 이온 전류 또는 해당 샘플에 대한 TIC라고 함(시각적 데이터 해석을 위해 숫자를 더 쉽게 만들기 위해 100,000을 곱함).</li>
	<li>이상값을 제거합니다. 데이터의 이상치는 양호한 표본의 잘못된 주입 또는 잘못된 표본의 양호한 주입으로 인해 발생할 수 있습니다.
	<ol>
		<li>(1) TIC 값 및 (2) 99.9% 신뢰도의 PC 점수와 함께 outliers 패키지를 사용하여 R에서 이상치 감지를 수행합니다.</li>
		<li>이상치가 있는 경우 해당 데이터 파일이 제거되고 피크 감지, 정렬 및 정규화 절차가 다시 수행됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>샘플 식별자를 기준으로 정규화된 피크 면적의 평균을 구합니다(여러 주입을 평균화하기 위해). 이는 통계 분석을 수행하기 전에 수행해야 합니다(참고: 주입 복제는 분석 변동을 설명하지만 실제 생물학적 복제물로 사용할 수는 없음).</li>
</ol>
5. 통계 분석
대사체학 실험의 경우 데이터 해석을 위해 다변량 및 일변량 통계 기법이 모두 필요합니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 기법으로는 주성분 분석(Principal Component Analysis)과 분산 분석(ANOVA)이 있습니다. 데이터의 통계 분석에 접근하는 방법에는 여러 가지가 있으며 오픈 소스 및 상용 소프트웨어 도구를 모두 사용할 수 있습니다. 이 단계는 비디오 자습서에서 건너뛰었지만 아래 접근 방식은 예로 설명되어 있습니다.
<ol>
	<li>R의 데이터셋에 aov 함수를 적용하여 ANOVA를 수행합니다.</li>
	<li>Benjamini-Hochberg 조정(R의 p.adjust 함수)을 사용하여 거짓 긍정을 고려합니다.</li>
	<li>파레토 스케일(단위 분산도 적용 가능) 및 평균 중심 데이터 세트로 PCA를 수행합니다. PC 점수와 로드는 모두 R의 pcaMethods 패키지를 사용하여 계산됩니다.</li>
	<li>ANOVA p-값, 적재 점수 및 폴드 변화 매개변수를 사용하여 실험 처리와 관련된 변동을 가장 잘 설명하는 분자 특징을 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>관심 있는 각 분자 특징을 수동으로 조사하여 분자 이온, 부가물(예: 나트륨, 칼륨 또는 이량체) 또는 중성 손실에 해당하는지 확인합니다.</li>
</ol>
6. 대사 산물 식별
여기에 제시된 워크플로우는 매우 일반적이며 모든 기기 플랫폼의 결과에 적용할 수 있습니다. 대안 전략은 토론 섹션에 나와 있습니다.
<ol>
	<li>통계적으로 유의한 모든 특징(6단계의 분석을 통해 결정됨)에 대해 원시 데이터를 검토하고 모 이온, 나트륨 부가물, 동위원소 및 단편이 데이터 세트 전체에서 유사한 추세를 따르는지 확인합니다. 예를 들어, 모 이온에 대한 ANOVA에서 파생된 p-값은 동위원소와 유사해야 합니다. 이는 두 분자 특징이 동일한 대사 산물에 해당한다는 것을 나타냅니다.</li>
	<li>다음과 같은 사내(사용 가능한 경우) 또는 공개적으로 사용 가능한 대사 산물 데이터베이스와 비교하여 통계적으로 유의한 분자 특징(여러 동위원소가 유의한 경우 C12 동위원소 선택)의 정확한 질량 측정 및/또는 중립 손실을 검색합니다.
	<ol class="lroman">
		<li>인간 대사체 데이터베이스(<a href="http://www.hmdb.ca/" target="_blank">http://www.hmdb.ca/</a>)</li>
		<li>메틀린 (<a href="http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php</a>)</li>
		<li>대량 은행 (<a href="http://www.massbank.jp/?lang=en" target="_blank">http://www.massbank.jp/?lang=en</a>)</li>
		<li>지질 맵(<a href="http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html" target="_blank">http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html</a>)</li>
		<li>미국 국립표준기술연구소(National Institute of Standards and Technology) MS 검색(<a href="http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/" target="_blank">http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/</a>)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>소프트웨어를 사용하여 중요한 분자 특징의 정확한 질량 및 동위원소 분포에서 분자 공식을 예측하십시오. Waters 소프트웨어에서는 MassLynx 패키지의 Elemental Comp 도구를 사용하여 이 작업을 수행합니다.</li>
	<li>질량 오류(기기 플랫폼에 적합), 예측된 분자식, 실험 설계와 관련하여 관찰된 추세의 생물학적 관련성 및 머무름 시간(예: 역상 크로마토그래피를 사용할 때 지질 및 기타 비극성 화합물의 머무름 시간이 더 길어짐)을 기준으로 후보 대사산물 식별을 필터링합니다.</li>
	<li>통계적으로 유의미한 분자 특징에 대한 MS/MS 단편화를 얻기 위해 후속 실험을 수행합니다. 가능한 경우, 대사 산물 식별은 실험적 단편화 피크 및 머무름 시간을 동일한 기기에서 획득한 실제 표준물질과 일치시키는 것을 기반으로 해야 합니다. 또는 실험적 단편화를 스펙트럼 데이터베이스와 일치시킬 수 있습니다.</li>
	<li>대사체학 표준 이니셔티브 권장 사항12. 에 따라 보고된 모든 대사 산물 식별에 식별 신뢰도를 할당해야 합니다.
	레벨 1: 실제 화합물을 기준으로 직교 분석 매개변수(정확한 질량, 머무름 시간 및 MS/MS 단편화)를 기반으로 신뢰할 수 있는 분자 식별. 
	레벨 2는 물리화학적 특성 및/또는 문헌 또는 스펙트럼 라이브러리와의 스펙트럼 유사성에 대한 추정 식별 기반을 나타냅니다. 
	레벨 3은 물리화학적 특성 또는 스펙트럼 유사성을 기반으로 화합물 등급의 추정 식별을 나타냅니다. 
	레벨 4는 알려지지 않은 화합물을 나타냅니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 튜토리얼은 UPLC-MS를 통해 대규모 비표적 대사산물 프로파일링을 수행하기 위한 출발점 역할을 하기 위한 것입니다. 워크플로우는 수성 메탄올 용매로 추출하고 C8 또는 C18 UPLC 컬럼에 유지되며 양이온으로 검출될 수 있는 대사산물에 중점을 둡니다. 특정 대사산물 종류에 대해 미리 결정된 편향이 없고 글로벌 프로파일을 생성하는 가설이 필요한 상황에서 이 프로토콜은 다양한 화학 종류(즉, 적당히 극성에서 비극성 화합물). 예산과 시간이 허락하는 경우, 다양한 추출 방법, 크로마토그래피 분리 및 이온화 모드의 통합으로 대사 산물 범위를 쉽게 확장할 수 있습니다 13,14 15.
시간 경과에 따른 데이터 안정성은 데이터가 몇 주 또는 몇 달에 걸쳐 수집될 수 있는 대규모 실험에서 중요한 분석 고려 사항입니다. 접근 방식의 편견 없고 전체론적인 특성을 감안할 때 데이터 정규화를 목적으로 내부 표준(또는 내부 표준 패널)을 통합하는 것은 적절...

"대사체학"이라는 용어는 많은 것을 포괄할 수 있습니다. 예를 들어, 대사체학 실험은 NMR 및 기체 및/또는 액체 크로마토그래피와 같은 다양한 분석 플랫폼을 사용하여 질량 분석법과 결합되어 수행할 수 있습니다. 또한 대사체학 실험은 표적 또는 비표적 방식 또는 두 가지 모두의 조합으로 수행할 수 있습니다. 표적 대사체학 실험에는 당면한 생물학적 문제에 중요한 분자 패널에 대한 지시 분석이 포함됩니다(예: TCA 회로에 관여하는 작은 분자는 해당 경로의 정확한 정량화를 가능하게 함). 이 상황에서 생물학적 가설은 분석에서 표적으로 삼을 대사 산물의 선택을 지시하고 분석 단계는 이러한 분자의 검출을 위해 최적화됩니다. 또는 비표적 대사체학 실험이 가설 생성입니다. 이 경우 실험은 가능한 한 많은 대사 산물을 검출할 수 있도록 광범위하고 편향되지 않은 방식으로 수행됩니다. 비표적 실험의 결과는 연구의 다음 단계를 주도할 것입니다(많은 경우 표적 대사체학 워크플로우가 포함될 수 있음). 또한 두 가지 접근 방식을 결합할 수도 있으며, 이 경우 실험은 비표적 방식으로 수행되며 동시에 데이터 내에서 알려진 분자 패널을 모니터링합니다. 
여기에 제시된 튜토리얼은 특히 혈청의 비표적 대사 산물 프로파일링에 중점을 둡니다. 위에서 설명한 바와 같이, 비표적 접근법은 검출 가능한 대사 산물에 대한 편향되지 않은 관점을 제공하고, 많은 양의 정보를 생성할 수 있으며, 궁극적으로 새로운 발견을 가능하게 합니다. 특히 질량 분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하는 이 접근 방식의 사용은 널리 보급되고 있으며 1, 2, 3 단계를 포함합니다: (1) 실험 설계 (2) 시료 채취 (3) 시료 준비 (4) UPLC-MS에 의한 데이터 수집 (5) 데이터 전처리(피크 검출, 적분, 정렬 및 정규화) (6) 통계 데이터 분석(단변량 및 다변량 모두) (7) 대사 산물 식별 및 (8) 생물학적 해석. 
현재 UPLC-MS 기반 비표적 대사 산물 프로파일링 및 후속 데이터 전처리 단계에 대해 확립된 표준 방법은 없습니다. 이러한 표준화의 부족은 부분적으로 대사 산물 프로파일링의 주요 분석 과제 중 하나에 기인합니다. 대사체의 화학적 다양성. 이러한 다양성으로 인해 단일 추출 방법 또는 질량 분석 수집 방법으로는 단일 분석에서 모든 대사 산물을 포괄적으로 포괄할 수 없습니다. 개념적으로 대사 산물 커버리지는 다양한 크로마토그래피 조건(예: 역상, HILIC 등) 및 다양한 이온화 모드(예: 양이온, 음이온, 화학적 이온화 등)와 결합된 다중 추출(예: 수성, 메탄올, 클로로포름:메탄올 등)을 사용하여 최대화할 수 있습니다.). 그러나 연구자들은 특정 화학 물질군에 대해 미리 결정된 편향을 가지고 있지 않은 경우가 많기 때문에 특히 대규모 실험의 경우 여러 추출 및 기기 획득을 수행하는 데 드는 비용이 보증되지 않습니다. 따라서 여기에 제시된 비디오 튜토리얼은 UPLC-MS에 의한 혈청의 대규모 비표적 대사 산물 프로파일링을 위한 일반적인 절차를 제공하도록 설계되었습니다. 이를 통해 신규 및 기존 실험실은 이러한 유형의 실험을 수행할 수 있으며 다양한 샘플 유형, 특정 화학 등급 또는 표적 분석에 대한 접근 방식을 확장할 수 있는 구성 요소를 구축할 수 있습니다. 구체적으로 이 프로토콜에는 혈청 시료 준비, 대규모 연구를 위한 시료 조직, UPLC-MS 데이터 수집, 품질 관리(QC) 절차 및 대사 산물 식별 단계가 포함됩니다. 데이터 전처리 및 통계 분석을 위한 전략도 제시됩니다.
프로토콜은 이 튜토리얼의 범위를 벗어나므로 실험 설계, 샘플 수집 또는 생물학적 데이터 해석 단계에 초점을 맞추지 않습니다. 그러나 이러한 주제에 대한 문헌에는 많은 자료가 존재하며, 저자는 대사체학을 처음 접하는 연구자들이 이러한 주제를 철저히 탐구할 것을 권장합니다 4, 5, 6, 7, 8, 9. 특히, 실험 설계는 매우 중요하며 비표적 대사체학 실험의 성공에 매우 중요합니다. 적절한 생물학적 복제 및 샘플 채취 절차의 일관성(예: 벤치에서의 시간, 보관 온도, 보관 시간, 동결-해동 등)과 같은 요소를 고려하여 실행 가능한 연구를 보장하고 데이터의 적절한 생물학적 해석을 용이하게 해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>96웰 플레이트 - 500 &mu; l 웰</td><td>VWR</td><td>40002-020</td><td>이들은 샘플 준비에 사용됩니다</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트 매트</td><td>VWR</td><td>89026-514</td><td>이들은 샘플 준비에 사용됩니다</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트 - 350 &mu; l wells</td><td>Waters Corporation</td><td>WAT058943</td><td>샘플 주입에 사용됩니다</td></tr><tr><td>96웰 플레이트 매트</td><td>Waters Corporation</td><td>186000857</td><td>샘플 주입에 사용됩니다</td></tr><tr><td>96웰 플레이트 히트 씰</td><td>Waters Corporation</td><td>186002789</td><td>샘플 주입 또는 장기 보관에 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>96웰 플레이트 히트 씰러 </td><td>Waters Corporation</td><td>186002786</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS 등급 메탄올</td><td>Fluka</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS 등급 아세토니트릴</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS 등급 아터</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS 등급 포름산</td><td>Fluka</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>다채널 전자 피펫</td><td>VWR</td><td>89000-674</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Eclipse(Light Labs를 통해 구매)</td><td>B-5061/B-4061</td><td></td></tr><tr><td>냉각 원심분리기 - Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter</td><td>해당 없음 - 문의: Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Ultra performance Liquid Chromatography (UPLC) System</td><td>: Waters Corporation</td><td>해당 없음 - 문의: Waters Corporation</td><td></td></tr><tr><td>UPLC C8 컬럼(그래디언트 옵션 a)</td><td>Waters Corporation</td><td>186002876</td><td></td></tr><tr><td>UplC T3 컬럼(그래디언트 옵션 b), </td><td>Waters Corporation</td><td>186003536</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF 질량분석기</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - Contact Waters Corporation</td><td></td></tr></tbody></table>

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (uplc-ms)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 metabolomic 프로파일

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

질량분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링은 대사를 조사하는 강력한 기술입니다. 이 접근 방식은 진단 테스트, 새로운 치료법의 개발 및 질병 과정에 대한 이해를 높일 수 있는 편견 없고 심층적인 분석을 제공합니다. 대사체에 내재된 화학적 다양성은 상당한 분석적 문제를 야기하며 모든 대사체를 검출할 수 있는 단일 실험 접근 방식은 없습니다. 또한 개별 신진대사의 생물학적 다양성과 환경 요인에 대한 신진대사의 의존성으로 인해 의미 있는 생물학적 해석에 필요한 적절한 통계적 능력을 얻기 위해 많은 수의 샘플이 필요합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 이 튜토리얼에서는 UPLC-MS에 의한 혈청의 대규모 비표적 대사 산물 프로파일링을 위한 분석 워크플로우를 간략하게 설명합니다. 이 절차에는 시료 구성 및 준비, 데이터 수집, 품질 관리 및 대사 산물 식별에 대한 지침이 포함되어 있으며, 대규모 실험을 위한 신뢰할 수 있는 데이터 수집을 가능하게 하고 UPLC-MS에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링을 처음 접하는 실험실을 위한 시작점을 제공합니다.

UPLC-MS를 이용한 비표적 대사체 프로파일링 실험의 기본 분석 단계가 그림 1에 요약되어 있습니다. 각 샘플의 원시 데이터는 베이스 피크 크로마토그램으로 시각화할 수 있습니다. 그림 2는 튜토리얼의 기울기 옵션 (a)로 분석한 혈청 샘플의 베이스 피크 크로마토그램 예시를 보여줍니다. 위에서 설명한 통계 분석에 따라, 통계적으로 유의미한 모든 분자 특징에 대해 대사체 식별을 시도합니다. 확신 수준이 높은 식별(레벨 1)을 위해서는 동일한 분석 장비에서 획득한 실험적 분자 특징과 추정 대사체의 표준품 사이의 크로마토그래피 머무름 시간, 정확한 질량 및 파편화 패턴이 일치해야 합니다. 그림 3은 인간 혈청 내 카페인의 레벨 1 대사체 식별 예시를 보여줍니다.
본 프로토콜은 시료 정리 및 준비, UPLC-MS 데이터 획득 및 품질 관리, 그리고 분석적 대사체 식별에 중점을 둡니다. 피크 검출,...

질량분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링은 대사를 조사하는 강력한 기술입니다. 이 문서에서는 시료 조직 및 준비, 데이터 수집, 데이터 분석, 품질 관리 및 대사 산물 식별을 포함하여 혈청의 비표적 대사 산물 프로파일링에 사용되는 일반적인 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

본 절차의 전반적인 목표는 대규모 실험에서 혈청의 강건한 비표적 대사체 프로파일링을 수행하는 것입니다. 먼저, 플레이트 형식으로 대사체를 추출합니다. 시간이 경과함에 따라 분석적 안정성을 보장하기 위해 강건한 QC 샘플 및 방법을 설정합니다.그 후 QC 및 무작위 혈청 샘플에 대해 반복적으로 질량 분석 데이터를 획득하고, 데이터 전처리, 통계 분석 및 대사체 식별을 진행합니다. U-P-L-C-M-S를 이용한 비표적 대사체 프로파일링 결과는 혈청 내 저분자 바이오마커를 식별하는 데 활용될 수 있습니다. 본 프로토콜은 혈청 분석을 위해 제시되었습니다.하지만 이 방법은 소변, 조직 및 세포 배양 추출물과 같은 다른 생체 시료 분석으로 쉽게 확장할 수 있습니다. 시료 준비를 위한 플레이트 맵을 만들려면 스프레드시트를 엽니다. 첫 번째 열에는 로딩 순서대로 시료 목록을 입력하십시오. 두 번째 열에는 사용하는 오토샘플러 소프트웨어의 정확한 명명법에 따라 96웰 플레이트의 위치를 입력하십시오.각 플레이트에서 웰 하나를 QC 샘플용으로 남겨두십시오. LC 오토샘플러가 한 번에 두 개의 플레이트를 처리할 수 있는 경우, 샘플 목록을 190개씩 배치로 나누어 이 정보를 두 번째 워크시트에 저장하십시오. 각 배치 내에서 주입 순서를 무작위로 설정하십시오.이제 주입 순서를 LCMS 시료 큐 소프트웨어 시스템에 복사하여 붙여넣으십시오. 시료 큐의 처음 세 줄은 컬럼 컨디셔닝 주입을 위해 비워 둡니다. 실험의 크로마토그래피 용리 범위를 포괄하며 질량과 머무름 시간이 알려진 화합물을 최소 4종 포함하는 10 milliliter의 QC 시료 스탁을 준비하십시오.혈청 샘플을 얼음 위에서 해동하고 약 5초 동안 부드럽게 볼텍싱합니다. 샘플 분주 시 팁에서 용액이 떨어지는 것을 방지하기 위해 12채널 피펫 팁을 메탄올로 미리 적십니다. 그런 다음 96웰 플레이스 트랜스퍼(96 Well plate transfer)의 각 웰에 차가운 메탄올 370 µL를 넣고, 플레이트 맵에 따라 각 샘플 100 µL를 해당 플레이트 위치에 추가합니다.플레이트를 덮고 -80 °C에서 30분 동안 배양합니다. 단백질을 침전시키기 위해 플레이트를 3,200 ×g, 4 °C에서 30분 동안 원심분리합니다. 그 다음 상층액 250 µL를 새로운 96웰 플레이트로 옮기고 원심분리 단계를 반복합니다.이제 snat의 60 µL 분주액을 UPLC 또는 lc 오토샘플러에 적합한 3개의 96웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트의 예약된 웰 위치에 QC 샘플 믹스 100 µL를 추가합니다. 각 플레이트를 접착 필름으로 밀봉합니다.자동 시료 주입기의 온도를 4 °C로 설정하십시오. 처음 두 개의 플레이트를 자동 시료 주입기에 넣으십시오. 두 가지 대안적인 역상 그래디언트 중 하나를 사용하여 분석 방법을 설정하십시오.구배 A는 비극성 분자에 치우쳐 있습니다. 반면 구배 B는 중간 정도의 극성을 띤 분자들에 대해 향상된 커버리지를 제공합니다. 질량 분석기를 양이온 모드로 설정하여 질량 대 전하비 50에서 1200까지 스캔하여 데이터를 수집하십시오.추가적인 특정 기기 조건은 각 분석 시작 시 사용되는 시스템에 따라 달라질 수 있습니다. 시료 플레이치를 준비하여 QC 시료를 수동으로 5회 주입하십시오. 세 번째부터 다섯 번째 QC 주입 결과에서 피크 면적의 RSD가 25% 미만인지, 머무름 시간(retention time)이 ±0.05분 이내인지, 그리고 질량 정확도가 ±3 ppm 이내인지를 모니터링하십시오.이러한 파라미터들은 데이터 획득에 사용되는 기기의 사양에 맞게 조정해야 할 수도 있습니다. QC 샘플이 통과하면, 전체 데이터셋의 획득이 완료되었을 때 해당 두 플레이트의 혈청 샘플에 대한 데이터를 획득하십시오. 전체 데이터셋에 대해 질량 분석 데이터의 피처 검출, 정렬 및 정규화를 수행하십시오.그런 다음 통계 분석을 수행하여 생물학적으로 유의미한 분자 특성을 결정합니다. 이러한 단계들은 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 다음 워크플로우는 대사체 식별 과정에 대한 개념적 개요입니다.텍스트 프로토콜에 대안적인 전략이 제공되어 있습니다. 소프트웨어를 사용하여 주요 분자 특징의 정확한 질량(accurate mass)과 동위원소 분포로부터 분자식을 예측하십시오. 다음으로, 측정된 정확한 질량을 내부 또는 공공 대사체 데이터베이스와 대조하여 검색하십시오.데이터베이스는 질량 오차로 예측된 분자식, 머무름 시간, 인소스 분절(insource fragmentation), 그리고 실험 설계와 관련하여 관찰된 경향의 생물학적 관련성을 바탕으로 후보 대사물을 필터링하여 식별합니다. 이를 통해 추정 대사물 식별 결과가 도출됩니다. 절대적 식별을 위해서는 실험 화합물의 정확한 질량 머무름 시간 및 분절 양상을 추정 대사물의 표준품과 대조하여 일치시켜야 합니다.마지막으로, Metabolomic Standards Initiative 권고안에 따라 보고된 모든 대사체 식별 결과에 식별 신뢰도를 할당합니다. 이 워크플로우는 U-P-L-C-M-S를 이용한 비표적 대사체 프로파일링 실험 수행의 기본적인 분석 단계들을 보여줍니다. 로우 데이터는 베이스 피크 크로마토그램으로 시각화할 수 있습니다.이 예시는 통계 분석 후 그래디언트 분석을 통해 분석된 혈청 샘플을 보여줍니다. 생물학적으로 중요하고 통계적으로 유의미한 모든 분자 특성에 대해 대사체 식별이 시도됩니다. 여기서는 실험적 분자 특성과 추정 대사체의 표준 물질 간의 크로마토그래피 머무름 시간, 정밀 질량 및 파편화 패턴을 매칭하여 인간 혈청에서 Caffeine을 식별하였습니다.이것은 레벨 1 대사체 식별의 예시입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 UPLC ms를 이용한 혈청의 대규모 비표적 대사체 프로파일링 과정에서 분석 안정성을 보장하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 하지만 분석 안정성은 성공적인 대사체 프로파일링 실험의 여러 중요한 측면 중 하나일 뿐입니다. 실험 설계와 이후의 데이터 분석 및 해석 또한 매우 중요합니다.하지만 본 비디오 튜토리얼의 범위를 벗어난 이러한 주제들은 텍스트 프로토콜에서 소개되고 논의됩니다.

large-scale-non-targeted-metabolomic-profiling-serum-ultra

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

대사 체학 실험 결과의 신뢰성은 시료 준비의 효율성과 재현성에 따라 달라집니다. 이후 화합물의 수천까지 분석, 또는 관심의 단지 화합물의 클래스의 옵션을 사용하여 생체 액에서 대사 산물의 추출을 가능하게하는 엄격하고 심도있는 방법입니다 설명.

심층하고 유익한 대사 체 분석을위한 여러 대사 산물 화합물 클래스를 복구하려면 여러 단계의 제조 기술

쉬스 다공질 팁 인터페이스 설계를 이용하여 모세관 전기 영동 - 질량 분석법에 의한 생체 시료의 대사 프로파일 링을위한 프로토콜이 제시된다.

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

자세한 프로토콜 분리, 식별 및 모 세관 지역 전기 이동 법-분무 이온화 탠덤 질량 분석 (CZE-ESI-MS/MS)를 사용 하 여 단백질 샘플에서 proteoforms의 특성에 대 한 설명 합니다. 프로토콜은 단순 단백질 샘플에서 proteoforms의 고해상도 특성화 및 복잡 한 프로테옴 샘플에서 proteoforms의 대규모 식별에 사용할 수 있습니다.

모 세관 지역 전기 이동 법 탠덤 질량 분석을 사용 하 여 대규모 하향식 단백질

여기 멀티 주입-모 세관에 따라 품질 관리와 향상 된 해상도 및 약물 남용 및 그들의 대사 산물의 대형 패널의 검출에 대 한 허용 하는 포괄적인 약물 감시 하는 높은 처리량 방법 설명 전기 이동 법 질량 분석입니다.

멀티 주입-모 세관 전기 이동 법 질량 분석을 사용 하 여 높은 처리량 및 포괄적인 약물 감시

밀 곡물 대사 산물 및 지질의 비표적 분석을위한 방법이 제시된다. 이 프로토콜에는 아세토니트릴 대사산물 추출 방법 및 역위상 액체 크로마토그래피 질량 분광법 방법이 포함되며, 양극 및 음전소 이온화 모드로 수집됩니다.

밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석

프로토콜은 복잡한 lysate 기반 세포 없는 시스템에서 대사 반응을 연구하기 위한 굴절 지수 또는 질량 분광 검출에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 설명합니다.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

이 프로토콜의 목표는 반표적 크로마토그래피-질량 분광법을 사용하여 혈장에서 페놀 대사 산물을 검출하는 것입니다.

노인의 혈장에서 페놀 대사 산물의 질량 분광법 분석에 결합 된 반 표적 초고성능 크로마토그래피

배우세요 혈청 대규모 비타겟 대사체 프로파일링을 위한 UPLC-MS 방법을 통해 신뢰할 수 있는 대사체 추출 및 분석 기술을 습득하세요. 이 프로토콜은 생체 내 소분자 바이오마커 식별에 활용됩니다.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

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