Name: 높은 처리량 SHAPE를 사용하여 RNA 이차 구조 예측 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: 배우세요 높은 처리량 SHAPE 기술을 사용하여 RNA 이차 구조를 단일 뉴클레오티드 해상도로 예측하는 방법을. 화학적 수정, 역전사, 캐필러리 전기영동을 활용한 이 기법은 RNA 구조 생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, KJ Purzycka, JW Rausch의 및 SFJ 르 Grice는 국립 암 연구소, 건강의 국립 연구소, 미국의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 여기서 높은 처리량 SHAPE에 대한 자세한 프로토콜, 어떤 크기의 RNA를위한 단일 염기 해상도로 차 구조 결정을 할 수있는 기법을 제시한다. 또한, 이차 구조 예측 알고리즘을 실험 SHAPE 데이터를 결합하는 것은 혼자 두 방법으로 가능한 것보다 높은 정확도와 RNA 차원 모델의 생성을 촉진한다. 찬란 - 라벨 프라이머 및 자동 CE의 조합은 하나의 실험에서 긴 RNA 시퀀스의 해상도를 촉진 기존의 젤 기반의 모양에 비해 상당한 장점뿐만 아니라, 여러 실험 상당히 높은 속도와 처리량을 제공합니다. 적합한 데이터 분석 도구의이 방법과 가용성의 편의 구조적 이전에 어려운 바이러스, 손상 메신저의 분석 및 비 암호화 RNA를 위해 이상적으로 적합한 모양을 만든다. 이 흥미로운 RNA를의 2D 구조는 명확 해짐에 따라, 하이드 록실 라디칼의 사용을 통해 - 스파, 프로빙세륨 절단 방법과 분자 모델링은 복잡한 차 상호 작용을 명료하게하는 데 도움이 결국 연구진은 세 가지 차원에서 이들의 RNA 구조를 결정할 수 있도록해야한다...

접합, 번역, 바이러스 복제 및 암의 조절에 관여 촉매 및 비 코딩 RNA를의 기능을 이해하기 위해, RNA 구조의 상세한 지식은 1,2 필요합니다. 불행하게도, RNA 접이식의 정확한 예측은 강력한 도전을 선물한다. 고전 프로빙 에이전트는 고통과 같은 독성, 불완전 염기 범위 및 / 또는 실험 당 100 ~ 150 뉴클레오티드 제한 처리 등 많은 단점에서. 남의 차 구조 예측 알고리즘은 유사하게 불리한 효율적으로 정력적으로 유사한 구조를 구별하기 위해 무능력으로 인한 부정확성으로 인해 수 있습니다. 특히 큰 RNA를 또한 X-선 결정학과 구조적 유연성과 이러한 기술에 필요한 고순도 샘플을 대량으로 인해 분광법 (NMR) 공명 핵 자기와 같은 3D 구조를 결정하는 방법을 자주 내화물입니다. H고등학교의 처리량 모양의 단일 염기 해상도로 대형의 RNA 구조를 프로빙에 효과적인 간단한 방법을 제공함으로써 많은 문제를 해결합니다. 또한, 모양에 사용되는 시약 처리 안전, 쉽고, 시약 프로브 대부분의 다른 화학 대조적으로, 네 개의 리보 뉴클레오티드로 반응합니다. 이 시약은 또한 가능한 생체 컨텍스트 (들) 3 자신의 RNA를을 조사하기 위해 만들어 세포막을 통과 할 수 있습니다. 원래 주 실험실 4에서 개발, 모양의 RNA 다양한 ~ 9킬로바이트 HIV-1 RNA 게놈 5의 전체 차 구조 결정되는 가장 주목할만한 예제를 분석하는 데 사용되었습니다. SHAPE를 사용하여 다른 주목할만한 업적은 전염성 로이드 6, 인간의 긴 비 코딩 RNAs를 7, 효모 리보솜 8 및 리보 스위치 9뿐만 아니라 식별 할 수 virion의 관련되는 HIV-1 RNA 3 단백질 결합 부위의 구조의 해명이 ​​(가) 있습니다. WHSHAPE 프로토콜의 일 원본과 높은 처리량 변화는 다른 10-12 게시 된, 본 연구는 형광 올리고 뉴클레오타이드를, 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 CEQ 8000 유전자 분석기를 사용하여 높은 처리량의 형상에 의해 RNA 이차 구조 결정에 대한 자세한 설명을 제공하고, SHAPEfinder 및 RNAStructure (V5.3) 소프트웨어입니다. 이전에 발표되지 않은 기술적 인 세부 사항 및 문제 해결 조언도 포함되어 있습니다. 모양의 변형 SHAPE와 그 변화의 본질은 선택적으로 변형 사이트에서 부피 부가 물을 생산, 2&#39;-히드 록시 (2&#39;-OH) 리보오스 그룹을 acylate 전자 성 무수물로 수용액 RNA의 노출이다. 베이스 쌍 또는 구조적 생성자하는 동안이 화학 반응은 단일 가닥 핵산이 시약에 의한 전자 성 공격에 도움이되는 conformations에 채택하는 경향이기 때문에, 지역의 RNA 구조 역학을 심문하는 수단으로 역할을ained 뉴클레오티드가 작거나 10 반응성이다. 부가 생성물 형성의 사이트는 수정 된 RNA ( &quot;(+)&quot;프라이머 연장 반응)에 특정 사이트에 하이브리드 형광이나 방사성 동위 원소 프라이머에서 시작 역전사에 의해 감지됩니다. 역전사 효소 (RT)는 실화 리보 뉴클레오타이드를 통과하는 데 실패하면, cDNA를 제품의 풀은 그 길이 수정의 사이트와 일치 생산됩니다. 컨트롤은 &quot;(-)&quot;프라이머 확장 시약에 노출되지 않은 RNA를 활용 반응은 그렇게 수행되는 구조 특이 RNA 가닥 파손 등, 5 월을 RNA에 의한 DNA 합성 (예 : &quot;중지&quot;)의 조기 종료. 화학적 변형에 의해 생성 일시 중지 구분할 수. 마지막으로, 같은 프라이머에서 시작 두 dideoxy 시퀀싱 반응은 RNA 기본 순서가 전기를 다음과 같이 반응 뉴클레오티드의 상관 관계를 마커로 사용됩니다. SHAP의 원래 응용 프로그램에서(-), 두 개의 연속 반응 E, 같은 32 P-끝 레이블 프라이머 (+)를 위해 사용됩니다. 이러한 반응의 제품은 5-8 %의 폴리 아크릴 아미드 슬래브 겔에 인접 우물에로드 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE, 그림 1) 변성에 의해 분별하고 있습니다. 기존의 모양에 의해 생성 된 겔 이미지의 정량 분석은 사파, 반자동 배출량 측정 분석 소프트웨어 13를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 반면, 높은 처리량 모양 찬란 프라이머 및 자동화 모​​세관 전기 영동을 사용합니다. 특히, 조사 대상 RNA, 일반적인 순서 만 다른 5 &#39;형광 라벨을 합성하거나 구입해야하는 데 네 가지 DNA 프라이머 세트의 각 지역. 이러한 다르게 표지 된 올리고 뉴클레오티드는 주요 두 가지 모양의 반응과 두 개의 연속 반응, 풀링 그리고 분별 / 자동 모세관 전기 영동 (CE)에 의해 감지되는의 제품을 제공합니다. 실어EAS는 RNA의 100 ~ 150 NT의 반응 프로파일은 원래의 방법을 사용하여 네 가지 반응의 집합에서 얻을 수있는, 높은 처리량 SHAPE는 단일 풀링 된 샘플 3 300-600 NT의 해상도를 할 수 있습니다. 많은 96 샘플 12 연속 CE가 실행 (그림 2)의 과정을 통해 분별을 준비 할 수있는 동안, 동시에 분별 할 수 있습니다 최대 반응의 8 세트까지. 또한, CEQ와 다른 유전자 분석기에서 나오는 데이터를 처리하고 분석하기 위해 개발 SHAPEfinder 소프트웨어는 더 자동화 및 SAFA 13이나 젤 분석 패키지보다 훨씬 적은 사용자 개입이 필요합니다. 고급 높은 처리량 방법은 최근에 이러한 얻기 위해 기술을 시퀀싱 다음 세대와 함께 구조 특정 효소보다는 알킬화 시약을 사용 PARS (RNA 구조의 병렬 분석) 14 수류탄 - 시퀀서 (조각 시퀀싱) 15로 등장 정 보RNA 구조에 대한 N. 이러한 기술의 매력에도 불구하고, 프로브 핵산에 내재 많은 제한은 여전히 16 남아있다. 이러한 문제는 차세대 시퀀싱은 기존의 모양에서 수행하는 것과 유사한 방식으로 화학적 변형과의 RNA 역전사 앞에는 SHAPE 시퀀싱 (SHAPE-시퀀서) 17 프로토콜에서 회피 할 수있다. 이러한 방법은 RNA 구조 결정의 미래를 나타낼 수 있지만, 그것은 차세대 시퀀싱은 매우 고가이며, 많은 실험실에 사용할 수없는 상태 것을 기억하는 것이 중요합니다. 셰이프 데이터 분석 유전자 분석기에서 생산 데이터를 마이그레이션 시간의 인덱스에 그려지는 모세관 검출기를 통과하는 시료의 형광 강도 (들)을 상기, electropherogram의 형태로 제공됩니다. 이 그래프는 네 개의 형광 채널에 해당하는 중복 흔적의 형태를 취s는 서로 다른 형광 물질을 감지하는 데 사용되며, 각 추적은 개별 cDNA를 또는 시퀀싱 제품에 해당하는 봉우리 구성입니다. Electropherogram 데이터는 탭으로 구분 된 텍스트 파일로 유전자 분석기에서 보낸 ShapeFinder 변환 및 분석 소프트웨어를 18로 가져옵니다. ShapeFinder는 처음 마이그레이션 시간과 최대 볼륨이 정확하게 각각 반응 생성물의 ID 및 수량을 반영하도록 데이터를 수학적 일련의 변환을 수행하는 데 사용됩니다. 피크는 다음 정렬 및 통합, 결과는 기본 RNA 시퀀스와 함께 표로 있습니다. RNA의 관련 세그먼트에 대한 &quot;반응 프로파일은&quot;(+) 염기 각 RNA와 관련된 값과 제어 값을 빼서, 아래 설명 된대로 데이터를 정규화하여 얻을 수 있습니다. 이 프로필은 정규화 된 반응성 발을 변환 (V5.3) 소프트웨어 19,20에게, RNAstructure로 가져RNA 이차 구조의 접이식 알고리즘에 통합 의사 에너지 제약에 단말. 이 방법으로 알고리즘을 프로빙 및 접는 화학 물질을 결합하여 현저하게 혼자 12,21 두 방법에 비해 구조 예측의 정확성을 향상시킵니다. RNAstructure의 출력 (V5.3)은 낮은 에너지의 이미지가 포함되어 RNA 이차 구조의 텍스트 점 괄호 표기법 SHAPE 반응성 프로파일 (들)뿐만 아니라 동일한 구조를 색으로 구분. 후자는 이후 같은 바르나 22 PseudoViewer 23와 같은 RNA 이차 구조의 그래픽 디스플레이 전용 소프트웨어로 내보낼 수 있습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1.jpg" /> 그림 1. SHAPE 4,10를 통해 RNA의 구조 결정의 흐름도. (A) RNA M바깥은 생물 학적 샘플이나 시험 관내 전사하여 얻을 수. (B) 소스에 따라, RNA는 접하거나 처리 SHAPE 시약으로 변경됩니다. (C) 역 전사 형광이나 방사성 표시 프라이머를 사용하여. (D)의 cDNA 제품은 하나 모세관 또는 슬래브 겔 기반의 전기를 통해 분별. (E) 조각 분석. (F) RNA 구조 예측. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2.jpg" /> 그림 2. CE 기반 SHAPE의 높은 처리량 문자 신속한 여러 RNA를 분석, 및 / 또는 동일한 RNA의 여러 세그먼트를 할 수 있습니다. (A) </st룽&gt;는 RNA가 300-600 NT 섹션 (색, 녹색, 파란색과 빨간색으로 구분) (B) RNA의 섹션은 형광 프라이머의 집합을 (검은 색 화살표)를 사용하여 독립적으로 조사됩니다 (C)의 집합으로 나눌 수 있습니다 방법을 나타냅니다 반응은 ~ 3킬로바이트 RNA1에 대한 완전한 범위를 제공, 각각 우물 A1, B1, C1, 등으로 풀링 및로드됩니다. RNA를 2, 3, 4 등의 반응 제품은 유사하게 연속 전기 영동 실행의 분별을 준비 할 수 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAGENTS</</td></tr><tr><td>strong>N-methylisatoic anhydride (NMIA)</td><td>Life technologies</td><td>M25</td><td>Dissolve in anhydrous DMSO</td></tr><tr><td>1-methyl-t-nitroisatoic anhydride (1M7)</td><td>참조 22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transcriptase</td><td>Life technologies</td><td>18080044</td><td>10,000 units</td></tr><tr><td>Thermo sequenase cycle sequencing kit</td><td>Affymetrix</td><td>78500</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4 ">사용자가 제공 한 재료</td></tr><tr><td>RNA 반응</td><td></td><td></td><td>당 6 pmol (검출 한계는 기기에 의해 결정됨)</td></tr> <tr><td>4 개의 5 '라벨링 프라이머 세트 (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 및 WellRed D1 / Licor IR800)</td><td></td><td></td><td>프라이머는 RNA를 보완하며 역전사 및 염기서열분석 반응에 사용됩니다. 나열된 형광단은 Beckman Coulter 8000 CEQ에 최적입니다. 프라이머는 사내에서 구입하거나 합성할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DNA 주형</td><td></td><td></td><td>DNA는 염기서열분석 반응에 사용되며, 3' 말단 확장(존재하는 경우)을 포함하여 연구 중인 RNA의 염기서열을 포함해야 합니다. 해당되는 경우, RNA transcription template를 사용하는 것이 편리한 경우가 많습니다.</td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>10x RNA renaturation buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5X RNA 접힘 버퍼</td><td></td><td></td><td>200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (이 버퍼는 경우에 따라 변경될 수 있습니다 (예: pH, EDTA, Mg, RNase inhibitor)</td></tr><tr><td>2.5X RT mix</td><td></td><td></td><td>4 &mu; l 5X 버퍼, 1 &mu; l 100 mM DTT, 1.5 &mu; l 물, 1 &mu; l 10 mM dNTPs, 0.5 &mu; l 위첨자 III. 5X 버퍼 및 100mM DTT는 SuperScript III(Invitrogen) 구매 시 제공됩니다.</td></tr><tr><td>GenomeLab 시료 로딩 솔루션(Beckman Coulter)</td><td></td><td></td><td>Attention: 여러 번의 동결-해동 주기를 피하십시오<</td></tr><tr>td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Capillary 전기영동</td><td>Beckman</td><td>CEQ8000</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>는 다양합니다.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

높은 처리량 shape를 사용하여 rna 이차 구조 예측

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

생물 학적 과정에 관여 RNA의 기능을 이해하는 것은 RNA 구조의 철저한 지식이 필요합니다. 이를 위해, 불리는 방법은, 또는 모양 &quot;프라이머 확장하여 분석 높은 처리량의 선택 2 &#39;수산기 실화는&quot;단일 염기 해상도를 가진 RNA 이차 구조 예측을 할 수 있습니다. 이 방법은 우선적으로 수용액 RNA의 단일 좌초 또는 유연한 지역 acylate 화학 프로빙 에이전트를 사용합니다. 화학적 변형의 사이트는 수정 된 RNA의 역전사에 의해 감지하고,이 반응의 제품은 자동화 된 모세관 전기 영동 (CE)에 의해 분별입니다 수 있습니다. 역전사 효소는 SHAPE 시약에 의해 수정하는 RNA의 뉴클레오티드에서 일시 정지하기 때문에, 결과의 cDNA 라이브러리는 간접적으로 하나의 접힌 RNA의 맥락에서 좌초하는 리보 뉴클레오타이드를 매핑합니다. ShapeFinder 소프트웨어를 사용하여 자동화 CE에 의해 생성 된 electropherograms가 처리되고 뉴로 변환cleotide 반응성 테이블은 그 자체가 RNAStructure (V5.3) 예측 알고리즘에 사용 된 의사 에너지 제약 조건으로 변환됩니다. 실리코 RNA 이차 구조 예측에서와 프로브 형상을 결합하여 얻은 두 가지 차원 RNA 구조는 혼자 두 방법을 사용하여 얻은 구조보다 훨씬 더 정확한 것으로 판명되었다.

RNA가 존재 HIV-1 회전 반응 요소 (RRE)과는 3 &#39;말단 구조 카세트 4가 37 난방, 냉각, 및 배양 접힌 된 후, 관내 전사에 의해 선형화 된 플라스미드의 제조 하였다 ° C를 포함 MgCl 2. RNA는 NMIA에 노출 된 후 3 &#39;말단 구조 카세트에 하이브리드 말단 표지 된 DNA 프라이머로부터 역전사. 결과 모양의 cDNA 라이브러리를 함께 제어 및 시퀀싱 반응으로, 다음 그림 4에 나와 electropherogram을 생산하기 위해 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 CEQ 8000 자동화 된 모세관 전기 영동 시스템을 사용하여 분획 하였다. 다음과 같은 네 가지 중복, 컬러 코딩 된 흔적은 모세관을 통해 반응 생성물의 네 가지 세트의 이주에 의해 생성됩니다 : 블루 (NMIA - 수정의 RNA 역전사에서 생성 Cy5에 레테르를 붙인 RT 제품), 녹색 (Cy5.5-표지 에서 RT 제품은 접혀 있지만, 그...

프라이머 확장 (SHAPE)에 의해 분석 높은 처리량의 선택 2 &#39;수산기 실화는 단일 염기 해상도에서 수천 개의 뉴클레오티드로 수백에서의 RNA 구조를 결정하는 기술을 프로빙 소설 화학, 역전사, 모세관 전기 영동 및 이차 구조 예측 소프트웨어를 사용합니다.

높은 처리량 SHAPE를 사용하여 RNA 이차 구조 예측

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 단일 뉴클레오타이드 해상도로 RNA 2차 구조를 예측하는 것입니다. 이는 먼저 친전자성 시약을 사용하여 접힌 RNA의 단일 가닥 또는 유연한 영역을 선택적으로 화학적으로 변형함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 역전사 과정을 통해 화학적으로 변형된 RNA 부위를 검출하는 것입니다.다음으로, 역전사 과정을 통해 생성된 CD NA 생성물을 모세관 전기영동으로 분획합니다. 마지막 단계는 데이터 처리 및 정규화입니다. 최종적으로, shape 분석에서 도출된 유사 자유 에너지 제약 조건을 사용하여 RNA 구조 소프트웨어로 RNA 2차 구조를 예측합니다.이 방법은 RNA 구조가 촉매 RNA 및 비전형적 RNA의 기능을 어떻게 조절하는지, 그리고 바이러스 RNA 게놈이 게놈의 다기능성을 어떻게 제어하는지와 같은 분자생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. RNA 2차 구조에 대한 통찰력을 얻는 것이 구조 기반 약물 설계에 도움이 될 수 있으므로, 이 기술의 영향은 바이러스 질환이나 암의 치료 및 진단으로까지 확장됩니다. 이 방법은 시험관 내 전사(in vitro transcription)로 생성된 RNA의 구조에 대한 통찰을 제공하지만, 형상 시약(shape reagents)은 세포 투과성이 있으므로 생체 내(in vivo)에서도 적용할 수 있습니다.본 절차를 시작하기 전에, 상용 전사 키트를 사용하여 인 비트로 전사(in vitro transcription)로 RNA를 준비하십시오. RNA는 0.5 µL 마이크로 원심 분리 튜브에 담아 TE 버퍼 내에서 -20°C에서 -80°C 사이의 온도로 보관해야 합니다.12 pmol의 RNA를 물을 사용하여 18 µL로 희석한 다음, 10 x 재변성 버퍼 믹스(renaturation buffer mix) 2 µL를 첨가하고 튜브를 톡톡 두드린 후 짧게 원심 분리합니다. 튜브 내 혼합물을 85 °C에서 1분 동안 가열한 다음, 초당 0.1 °C의 속도로 4 °C까지 냉각합니다. 마이크로 원심 분리 튜브에 물 100 µL와 5 x 폴딩 버퍼(folding buffer) 30 µL를 첨가합니다. 그 후, 폴딩되는 RNA의 종류에 따라 튜브의 내용물을 37 °C에서 30~60분 동안 인큐베이션합니다.일반적으로, 길이가 더 길고 구조가 복잡한 RNA의 마그네슘 의존적 폴딩에는 더 긴 배양 시간이 필요합니다. 72 µL의 분주액을 각각 'modified'와 'control'로 라벨링한 두 개의 0.5 mL 미세 원심분리 튜브에 옮깁니다. 다음 단계로, control 혼합액에 무수 dimethyl sulfoxide 8 µL를 첨가하고 따로 둡니다. 그런 다음 modified 혼합액에 10 x 및 MIA 8 µL를 첨가합니다.변형된 혼합물과 대조군 혼합물을 37 °C에서 50분 동안 배양합니다. 변형된 RNA를 침전시키기 위해 변형된 혼합물 튜브에 3 M sodium acetate (pH 5.2) 8 µL, 100 mM EDTA 8 µL, 차가운 ethanol 240 µL, 그리고 10 mg/mL glycogen 1 µL를 첨가합니다. 튜브의 내용물을 -20 °C에서 2시간 동안 냉장 보관한 후, 4 °C에서 14,000 ×g로 30분 동안 원심분리합니다.그런 다음 차가운 70% ethanol로 펠렛을 두 번 세척하며, 이때 5분 동안 원심분리합니다. 매 세척 후 마이크로 파이펫으로 상층액을 제거하고 펠렛을 5분 동안 공기 건조합니다. 실온에서 0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 역전사 과정을 위한 변형 샘플과 대조군 샘플을 준비합니다.변형된 반응 혼합물을 만들려면 변형된 RNA 5 µL, 물 6 µL, 그리고 10 µM sci five 표지 프라이머 용액 1 µL를 혼합합니다. 대조군 반응 혼합물을 만들려면 대조군 RNA 5 µL, 물 6 µL, 그리고 10 µM sci 5.5 표지 프라이머 용액 1 µL를 혼합합니다. 튜브를 열 사이클러(thermal cycler)에 넣고 프라이머를 RNA에 어닐링(anneal)합니다.어닐링 중에 2.5x RT 믹스를 준비합니다. 각 RT 반응을 위해 잘 혼합하고, 어닐링 반응에 추가하기 전 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 어닐링 반응의 온도가 50 °C에 도달하면 2.5x RT 8 µL를 추가합니다.혼합 후 50 °C에서 50분 동안 배양합니다. 다음으로, 4 M 수산화나트륨 1 µL를 첨가하고 90 °C에서 3분 동안 가열하여 RNA를 가수분해합니다. 반응물을 얼음 위에서 냉각시킨 후, 2 M 염산을 2 µL 첨가하여 중화합니다.이제 변형된 반응물과 대조군 반응물을 혼합하고, 전체 반응 부피의 0.1배 또는 10분의 1 부피에 해당하는 3 M sodium acetate와 100 mM EDTA, 1.5배 부피의 차가운 ethanol, 그리고 10 mg/mL glycogen 1 µL를 첨가합니다. 이렇게 하면 cDNA가 용액에서 침전됩니다. 용액을 2시간 동안 냉장 보관한 후, 4 °C에서 14,000 xg로 30분 동안 원심분리합니다.침전물을 차가운 70% ethanol로 두 번 세척합니다. 침전된 CD NA를 40 µL의 탈이온 form amide에 재현탁시킨 후, 65 °C에서 10분 동안 가열하고, 최소 30분 동안 격렬하게 vortexing합니다. 시퀀싱 반응 준비를 위해 0.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 40 µL의 DDA termination mix, 5 pM의 DNA 템플릿, 4.6 µL의 10 x sease buffer 및 10 µL의 well-read D2 표지 프라이머를 혼합합니다. 이 혼합물에 4.6 µL의 QUIN A를 추가하고, 물로 희석하여 최종 부피를 82 µL로 맞춥니다.대신 DDT와 lycor IR 800 표지 프라이머를 사용하여 동일한 방식으로 두 번째 시퀀싱 반응을 준비합니다. 다음으로, 주어진 USB 권장 조건에 따라 PCR 증폭을 진행합니다. DNA를 침전시키기 위해 3 M sodium acetate pH 5.2 16 µL, 100 mM EDTA 16 µL, 10 mg/mL glycogen 1 µL 및 95% ethanol 480 µL를 첨가한 후, 4 °C에서 30분 동안 배양하고 4 °C에서 14,000 G로 30분 동안 원심분리합니다.펠릿 형태의 CD NA를 100 µL의 탈이온 포름아미드(form amide)에 넣고 65 °C에서 10분간 가열한 후, 최소 30분 동안 강하게 볼텍싱하여 재현탁합니다. 다음으로, 통합된 형태 샘플 40 µL와 통합된 시퀀싱 래더(sequencing ladders) 10 µL를 혼합하고, 샘플의 전체 부피를 96웰 샘플 플레이트 프로그램에 피펫팅합니다. 모세관 전기영동 장치를 준비하고 제조사의 지침에 따라 분석을 시작합니다. 네 가지 색상으로 구분된 중첩 트레이스는 모세관을 통해 이동하는 네 세트의 반응 생성물에 의해 다음과 같이 생성됩니다. 파란색 트레이스는 NMIA 변형 RNA의 역전사로부터 생성된 역전사 생성물을 나타냅니다.녹색 트레이스는 접혀 있지만 그 외에는 수정되지 않은 RNA의 역전사 생성물을 나타냅니다. 검은색 트레이스는 D-N-A-D-D-G 시퀀싱 래더를 나타내며, 빨간색 트레이스는 DDT 시퀀싱 래더를 나타냅니다. 가공되지 않은 모세관 전기영동 트레이스는 shape finder 소프트웨어를 사용하여 분리, 처리, 정렬 및 통합됩니다.데이터 분석은 모세관 전기영동 시스템에서 추출한 전기영동도를 shape finder로 가져오는 것으로 시작합니다. 중앙의 데이터 뷰 창은 각 데이터 처리 단계에 대한 그래픽 피드백을 제공합니다. 화면 왼쪽 하단에 위치한 툴 인스펙터 창은 스크립팅 인스펙터에서 선택한 툴의 파라미터를 보여줍니다.화면 상단의 스크립팅 검사기에는 데이터에 적용된 도구들이 표시되며, 여기서 형광 배경, 형광 채널 간의 스펙트럼 중첩, 서로 다른 태그가 붙은 프라이머로 인해 발생하는 이동도 변화, 역전사의 조기 종료로 인한 신호 감쇠, 그리고 서로 다른 형광체로 라벨링된 공통 산물의 형광 강도 차이를 보정하기 위해 전기영동도를 조정합니다. setup 기능을 사용하여 개별 피크에 정체성을 자동으로 할당하고, 이 정보를 사용자 입력 및 두 개의 시퀀싱 래더(ladder)로 정의된 RNA 서열과 상관시켜 RNAstructure 5.3 소프트웨어에서 사용하는 2차 구조 알고리즘에 뉴클레오타이드 반응성 프로필을 통합하거나, 밀접하게 연관된 RNA들의 프로필을 비교하십시오. SHAPE 데이터를 표준화된 방식으로 정규화하십시오.이를 위해, 이후의 계산에서 이상치를 제외하십시오. 유효 최대 반응성을 결정하고, 모든 반응성 값을 이 유효 최대값으로 나누어 정규화하십시오. SHAPE 분석의 가상 자유 에너지 제약 조건을 사용하여 실험적으로 뒷받침되는 RNA 2차 구조를 예측하는 데 RNA 구조 소프트웨어가 사용됩니다.이 소프트웨어는 DRNA 구조의 최저 에너지 상태에 대한 그래픽 표현과 텍스트 표현을 모두 제공합니다. 닷 브래킷 표기법(dot bracket notation)의 경우, 서열과 닷 브래킷 주석을 RNA 구조 뷰어(RNA structure viewer)에 불러와야 합니다. 여기에서 보여주는 것은 SHAPE 유래 반응성 프로파일을 사용하여 RNA structure 5.3에서 생성하고 Java 라이트웨이트 애플릿(Java lightweight applet)을 통해 시각화한 HIV rev 반응 요소 stem loop two 영역의 2D 구조입니다. 파란색으로 표시된 뉴클레오타이드는 반응성이 낮으며, 빨간색으로 표시된 뉴클레오타이드는 반응성이 더 높습니다. 숙련된 경우, 적절히 수행한다면 이 기법은 이틀 만에 완료할 수 있습니다.본 절차를 수행할 때, 결과로 도출된 RNA 모델을 바탕으로 RNA 2차 구조에 대한 최종 결론을 내리기 전에 해당 모델을 신중하게 해석해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 복잡한 3차 상호작용을 규명하고 궁극적으로 연구자가 이러한 RNA의 3차원 구조를 결정할 수 있도록 하기 위해, 공간 절단법을 통한 하이드록실 라디칼 프로빙과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

I - TASSER 파이프라인을 사용하여 단백질의 구조와 기능 특성화 기반 컴퓨터에 대한 지침이 설명되어 있습니다. 쿼리 단백질 시퀀스에서 시작, 3D 모델은 여러 스레딩 정렬을 사용하여 생성 및 구조 조립 시뮬레이션을 반복하고 있습니다. 기능성 inferences는 이후 알려진 구조와 기능을 가진 단백질 일치를 기반으로 그려져있다.

컴퓨터 기반의 단백질 구조 및 기능 예측을위한 프로토콜

ITS2 데이터베이스는 phylogenetic의 추론을 동시에 고려하여 시퀀스 및 내부 베꼈는데 스페이서 2 차 구조를위한 작업대입니다. 이것은 정확한 주석, 구조 예측, 다중 시퀀스 구조의 정렬 및 빠른 나무 계산과 데이터 수집을 포함한다. 간단히 말해서,이 작업대는 몇 번의 클릭 첫번째로 phylogenetic 분석을 단순화합니다.

ITS2 데이터베이스

3DNA 소프트웨어 패키지, 분석 구축, 3 차원 핵산 구조를 시각화하는 기능을 갖춘 인기있는 다양한 생물 정보학 도구입니다. 이 문서에서는 각각의 구조 및 관련 구조의 앙상블에 모두 적용 3DNA에서 사용할 수있는 새로운 대중적인 기능의 하위 집합에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

3DNA과 핵산의 구조를 분석하고 구축

우리는 단백질 설계의 몇 가지 중요한 영역을 다룰 수 있는 computational de novo 단백질 설계 방법을 개발했습니다. 이러한 방법을 보급하기 위해 단백질 설계를 위한 온라인 도구인 Protein WISDOM을 제시합니다(http://www.proteinwisdom.org). 구조적 주형에서 시작하여 안정성 향상을 위한 단량체 단백질과 결합 친화도 향상을 위한 복합체의 설계를 수행할 수 있습니다.

단백질 지혜 : 용 워크 벤치<em&gt; 실리코에</em&gt;<em&gt; 드 노보</em생체 분자의&gt; 디자인

이 논문은 자기 조립의 자연 프로세스에 의해 주문한 높은 펩타이드 기반 구조의 형성을 설명합니다. 이 방법은 시판 펩티드 및 일반적인 실험실 장비를 이용한다. 이 기술은 펩티드의 큰 다양성에 적용 할 수 있으며, 새로운 펩티드 어셈블리의 발견으로 이어질 수있다.

짧은 펩타이드의 자기 조립에 의해 주문 생체 고분자 구조의 형성

DNA 타일링은 프로그래밍 가능한 나노 구조를 만드는 효과적인 접근 방식입니다. 우리는 단일 가닥 DNA 타일의 자체 조립에 의해 복잡한 2차원 모양을 구성하는 프로토콜을 설명합니다.

단일 가닥 DNA 타일에서 단지 두 차원 모양의 자기 조립 (self-assembly)

우리는 큰 코일 영역의 특성화 및 결정화를 안내하기 위해 간단한 생화학 및 컴퓨터 분석을 통합한 프레임워크를 설명합니다. 이 프레임워크는 구형 단백질에 맞게 조정하거나 다양한 고처리량 기술을 통합하도록 확장할 수 있습니다.

습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

둘 다 생체 외에서 그리고 세포에서 선택적 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양) 실험 사전 mRNA 시퀀스는 RNA를 대상으로 작은 분자의 존재의 2 차 구조를 결정 하 여 분석에 대 한 자세한 프로토콜은 이 문서에서 제시 하는.

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

이 프로토콜은 돌연변이 프로파일링 실험을 위해 디메틸 설페이트로 RNA를 변형하기 위한 지침을 제공합니다. 여기에는 두 가지 대체 라이브러리 준비 방법을 사용한 시험관 내 및 생체 내 프로빙이 포함됩니다.

디메틸 설페이트를 사용한 RNA 구조 프로빙 시험관 내 및 세포에서 시퀀싱을 사용한 돌연변이 프로파일링

단백질 설계에는 아미노산 염기서열의 구축과 기능적 변이체를 만들기 위한 특정 모티프의 통합이 포함됩니다. 이 접근 방식은 항생제 내성 병원체와 싸우기 위한 항균 펩타이드(AMP)의 개발에 매우 중요합니다. 본 논문은 다양한 생물정보학 도구를 이용한 단백질 구축 절차를 제시합니다.

De Novo 및 In Silico 단백질 설계를 위한 I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK 서버 및 HEX loria 적용

배우세요 높은 처리량 SHAPE 기술을 사용하여 RNA 이차 구조를 단일 뉴클레오티드 해상도로 예측하는 방법을. 화학적 수정, 역전사, 캐필러리 전기영동을 활용한 이 기법은 RNA 구조 생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

높은 처리량 SHAPE를 사용하여 RNA 이차 구조 예측

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