높은 처리량 SHAPE를 사용하여 RNA 이차 구조 예측

이 절차의 전반적인 목표는 단일 뉴클레오티드 분해능을 가진 RNA 2차 구조를 예측하는 것입니다. 이는 먼저 S가 RNA의 단일 가닥 또는 유연한 영역을 분리하는 친전자성 시약으로 접힌 RNA를 화학적으로 변형함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 역전사를 사용하여 화학적으로 변형된 RNA 부위를 검출

다음으로, 역전사의 CD NA 생성물은 모세관 전기영동에 의해 분획됩니다. 마지막 단계는 데이터 처리 및 정규화입니다. 궁극적으로 RNA 구조 소프트웨어는 형상 분석에서 파생된 유사 자유 에너지 제약 조건을 사용하여 RNA 2차 구조를 예측하는 데 사용됩니다.

이 방법은 RNA 구조가 촉매 및 비전류 RNA의 기능을 어떻게 제어하는지, 바이러스 RNA 게놈이 게놈의 다중 기능을 어떻게 조절하는지와 같은 분자 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 RNA 2차 구조에 대한 통찰력을 얻는 것이 구조 기반 약물의 설계에 도움이 될 수 있기 때문에 바이러스성 질병 또는 암의 치료 및 진단으로 확장됩니다. 이 방법은 체외 전사에 의해 생성된 RNA의 구조에 대한 통찰력을 제공하지만, 형상 시약은 세포 투과성이 있기 때문에 in vivo에도 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시작하기 전에 in vitro transcription으로 RNA를 준비합니다. 상업용 전사 키트 사용. RNA는 0.5마이크로리터 마이크로 원심분리기 튜브에서 섭씨 영하 20도에서 영하 80도 사이의 TE 완충액에 보관해야 합니다.

RNA 12 피코 몰을 18 마이크로 리터에 물로 희석하고 튜브를 두드려 10 x 재 성숙 버퍼 믹스 2 마이크로 리터를 첨가 한 다음 튜브의 혼합물을 1 분 동안 섭씨 85 도로 가열 한 다음 초당 섭씨 0.1 도의 속도로 섭씨 4 도로 냉각합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에 100마이크로리터의 물과 30마이크로리터의 5x 접힘 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 접히는 RNA에 따라 섭씨 37도에서 30-60분 동안 튜브의 내용물을 배양합니다.

일반적으로 더 길고 더 구조화된 RNA의 마그네슘 의존적 접힘은 더 긴 배양 시간을 필요로 합니다.72마이크로리터 분취액을 두 개의 0.5ml 마이크로 원심분리 튜브 각각에 전달하며, 각각 변형 및 대조로 라벨링되어야 합니다. 다음 단계는 8마이크로리터의 무수 디메틸 설폭사이드를 대조군 혼합물에 첨가하고 따로 보관하는 것입니다. 그런 다음 10 x 및 MIA의 8 마이크로 리터를 수정 된 혼합물에 추가합니다.

변형 및 대조군 혼합물을 섭씨 37도에서 50분 동안 배양합니다. pH 5.28마이크로리터의 아세트산나트륨 8마이크로리터, 100밀리몰 EDTA 240마이크로리터의 콜드 에탄올, 1밀리리터당 10밀리그램 1마이크로리터를 추가합니다. 변형된 RNA를 침전시키기 위해 변형된 혼합관에 글리코겐을 넣고, 튜브의 내용물을 영하 20도에서 2시간 동안 냉장 보관한 후, 14, 000G에서 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리한다.

그런 다음 펠릿을 차가운 70% 에탄올 원심분리로 5분 동안 두 번 세척합니다. 세척할 때마다 마이크로 피펫으로 상층액을 제거하고 펠릿을 5분 동안 자연 건조시킵니다. 실온에서 0.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에서 역전사를 위해 변형 및 대조 샘플을 준비합니다.

변형 반응을 위해 5마이크로리터의 변형 RNA, 6마이크로리터의 물과 1마이크로리터의 10마이크로몰 sci 5 표지 프라이머 용액을 혼합합니다. 대조 반응을 위해 5마이크로리터의 control RNA, 6마이크로리터의 물 및 1마이크로리터의 10마이크로몰 sci 5.5 표지된 프라이머 용액을 혼합합니다. 튜브를 열 순환기에 넣고 프라이머를 RNA에 무릎을 꿇습니다.

무릎을 꿇고 있는 동안 2.5 x RT 믹스를 준비합니다. 각 RT 반응에 대해 잘 혼합하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양한 후 무릎 꿇기 반응을 추가합니다. 무릎 꿇기 반응의 온도가 섭씨 50도에 도달하면 8 마이크로 리터의 2.5 XRT를 첨가합니다.

섞어서 섭씨 50도에서 50분 동안 배양합니다. 다음으로, 1마이크로리터의 4몰 수산화나트륨을 첨가하고 섭씨 90도에서 3분 동안 가열하여 RNA를 가수분해했습니다. 얼음 위에서 반응을 식힌 다음 2 마이크로 리터의 2 몰 염산을 첨가하여 중화하십시오.

이제 변형 반응과 대조 반응을 결합하고 3 몰 아세트산 나트륨과 100 밀리 몰 EDTA 1.5 부피의 차가운 에탄올 및 1 밀리리터 당 10 밀리 그램의 1 마이크로 리터의 총 반응 부피의 0.1 부피 또는 10 분의 1을 추가합니다. 글리코겐. 이로 인해 CDNA가 용액에서 침전됩니다. 2 시간 동안 해결책을 냉장하고십시오, 그 후에 14, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 000 G에 분리기

펠릿을 차갑게 70% 에탄올로 두 번 재현탁시키고, 펠릿화된 CD NA를 40마이크로리터의 탈이온화 형태 아미드로 10분 동안 가열하여 세척한 후, 0.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브 믹스 40 마이크로리터의 DDA 종단 혼합물에서 시퀀싱 반응의 준비를 위해 최소 30분 동안 격렬하게 와류화합니다. DNA 템플릿의 5 개의 PICA 몰, 4.6 마이크로 리터의 10 x sease 버퍼 및 10 마이크로 리터의 잘 판독 된 D 2 개의 표지 된 프라이머. 이 혼합물에 4.6 마이크로 리터의 QUIN A를 넣고 물로 희석하여 총 부피를 82 마이크로 리터로 만듭니다.

대신 DDT 및 lycor IR 800 표지 프라이머를 사용하여 동일한 방식으로 두 번째 염기서열분석 반응을 준비합니다. 그런 다음 주어진 USB 권장 조건을 사용하여 PCR 증폭을 진행합니다. 3 몰 아세트산 나트륨 pH 16 마이크로 리터, 100 밀리 몰 EDTA 16 마이크로 리터, 글리코겐 밀리리터 당 10 밀리그램 1 마이크로 리터, 95 % 에탄올 480 마이크로 리터를 첨가하여 DNA를 침전시킨 다음 섭씨 4도에서 30 분 동안 섭씨 4도에서 배양하고 섭씨 4도에서 30 분 동안 14, 000G에서 원심 분리합니다.

펠릿화된 CD NA를 100마이크로리터의 탈이온화 형태 아미드에 10분 동안 섭씨 65도로 가열한 후 최소 30분 동안 격렬하게 와류화하여 재현탁합니다. 다음으로, 40마이크로리터의 풀링된 형상 샘플을 10마이크로리터의 풀링된 염기서열분석 래더와 혼합하고, 샘플의 총 부피를 96웰 샘플 플레이트로 피펫팅하여 모세관 전기영동 기기를 프로그래밍 및 준비하고 제조업체의 지침에 따라 실행을 시작합니다. 4개의 겹치는 색상으로 구분된 트레이스는 다음과 같이 모세관을 통한 4세트의 반응 생성물의 이동에 의해 생성되며, 블루 트레이스는 NMIA 변형 RNA의 역전사에서 생성된 역전사 생성물을 보여줍니다.

Green Trace는 접혔지만 그렇지 않으면 변형되지 않은 RNA의 역전사 산물을 보여줍니다. 블랙 트레이스는 D-N-A-D-D-G 염기서열분석 래더를 나타내고 레드 트레이스는 DDT 염기서열분석 래더를 나타냅니다. 원시 모세관 전기영동 트레이스는 형상 탐지기 소프트웨어를 사용하여 분리, 처리, 정렬 및 통합됩니다.

데이터 분석은 모세관 전기영동 시스템의 전기영동을 형상 찾기로 가져오는 것으로 시작됩니다. 중앙 데이터 보기 창은 각 데이터 처리 단계에 대한 그래픽 피드백을 제공합니다. 화면 왼쪽 하단에 있는 툴 인스펙터 창에는 스크립팅 인스펙터에서 선택한 툴에 대한 파라미터가 표시됩니다.

화면 상단의 스크립팅 검사기는 데이터에 적용된 도구를 표시하고, 형광 배경, 형광 채널 간의 스펙트럼 중복, 이동성 이동을 보정하기 위해 전기표도를 조정하고, 역전사의 조기 종료로 인한 쇠퇴 신호 및 형상 측정기 정렬 및 통합 도구에서 다른 형광단으로 라벨링된 일반 제품의 형광 강도 차이에 의해 전달됩니다. 설정 기능을 사용하여 개별 피크에 ID를 자동으로 할당하고 이 정보를 사용자 입력 및 두 개의 염기서열분석 래더에 의해 정의된 RNA 염기서열과 상호 연관시켜 뉴클레오티드 반응성 프로파일을 RNA 구조 5.3 소프트웨어에서 사용하는 2차 구조 알고리즘에 통합하거나 밀접하게 관련된 RNA의 프로파일을 비교할 수 있습니다. 표준화된 방식으로 형상 데이터를 정규화합니다.

이렇게 하려면 후속 계산에서 이상값을 제외합니다. 유효 최대 반응성을 결정하고 모든 반응성 값을 유효 최대값으로 나누어 정규화합니다. RNA 구조 소프트웨어는 형상 분석의 유사 자유 에너지 제약 조건을 사용하여 실험적으로 지원되는 RNA 2차 구조를 예측하는 데 사용됩니다.

이 소프트웨어는 DRNA 구조에 대한 가장 낮은 에너지의 그래픽 표현과 이러한 구조의 텍스트 표현을 제공합니다. 점 괄호 표기법에서, 시퀀스와 점 괄호 주석은 RNA 구조 뷰어에서 가져와야 하며, 여기에 표시된 것은 모양에서 파생된 반응성 프로파일을 사용하여 RNA 구조 5.3에서 생성되고 Java 경량 애플릿을 사용하여 시각화된 HIV rev 반응 요소 줄기 루프 두 영역의 2D 구조입니다. 파란색으로 표시된 뉴클레오티드는 반응성이 낮은 반면, 빨간색으로 표시된 뉴클레오티드는 반응성이 더 높았습니다.일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 RNA 2차 구조에 대한 최종 결론에 도달하기 전에 결과 RNA 모델을 주의 깊게 해석해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 공간 분할 방법을 통한 하이드록시 라디칼 프로빙의 사용과 같은 다른 방법은 복잡한 3차 상호 작용을 규명하고 궁극적으로 연구자가 이러한 RNA의 구조를 3차원으로 결정할 수 있도록 하기 위해 수행할 수 있습니다.