마우스의 단기 및 장기 전위의 활동은 영상 추적 소프트웨어에 의해 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 실험적으로 처리된 서로 다른 마우스 그룹 간의 단기 및/또는 장기 운동 활성 차이를 검출하는 것입니다. 이는 마우스 홈 케이지 내의 활동을 실시간으로 비디오 녹화함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 동물의 운동 활성을 실시간으로 분석하거나 녹화된 영상을 통해 분석합니다.

다음으로, 점수가 매겨진 운동 능력 파라미터를 통계 분석을 위해 보조 소프트웨어로 가져옵니다. 이러한 절차를 통해 이동 거리, 이동 속도 및 이동 지속 시간과 같이 평가된 파라미터를 기반으로 처치나 조건이 단기 및 장기 운동 능력에 미치는 영향을 규명할 수 있습니다. 라인 크로싱(line crossing)이나 이미터 식립(emitter implantation)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 침습적이며 잠재적으로 혼란 변수가 될 수 있는 수술 과정 없이도 마우스의 운동 능력을 더욱 철저하게 검토할 수 있다는 점입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 후속 비디오 추적을 위한 최적의 이미지 품질을 확보할 수 있도록 케이지와 장비를 설정하는 과정이 까다롭고 습득하는 데 시간이 걸리기 때문입니다. 단기 운동 활성도는 동물의 코드 색상과 대비가 높은 깔짚이 깔린 격리된 마우스의 홈 케이지에서 테스트합니다. 실험 전, 동물들은 최소 24시간 동안 해당 깔짚에 적응해야 합니다.

테스트실을 준비하려면 먼저 최소 120 gigabytes의 메모리가 탑재된 야간 투시 가능 비디오 카메라를 기록 영역 상단에 설치하십시오. 실험실 내의 주변 소음은 70 decibels를 초과해서는 안 됩니다. 간헐적인 배경 소음을 피할 수 없는 경우에는 화이트 노이즈 발생기를 사용하여 해당 소음을 상쇄하십시오.

또한 테스트실의 환경 조건이 동물의 일반적인 사육 조건과 유사한 것이 중요합니다. 새로운 실험군을 배치하기 전에 기록 영역을 청소한 다음, 케이지 바닥재와 비슷한 색상의 정육지나 실험대용 종이로 표면을 덮으십시오. 다음으로, 0.5인치 플라스틱으로 제작된 불투명한 케이지 구분대를 배치하십시오. 테스트 표면 위의 구분대는 바닥재와 비슷한 색상이어야 하며 깨끗한 상태여야 합니다.

이제 마우스를 테스트 구역으로 옮기고 케이지를 구분벽 사이에 배치합니다. 분석의 편의를 위해 케이지는 항상 동일한 방식으로 배치하십시오. 테스트를 위해 케이지를 1/4인치 두께의 투명 플렉시글라스로 덮습니다.

적절한 환기를 위해 플렉시글라스에 최소 11개의 1/4인치 구멍을 뚫어야 합니다. 다음으로, 케이지를 비추기 위해 적색 전구를 장착한 브루더 클램프 라이트를 설치하십시오. 이제 비디오 추적 시스템의 성능 범위를 초과하지 않도록 카메라의 시야를 테스트 케이지 중앙에 맞추십시오.

이 시스템은 최대 8마리의 마우스를 실시간으로 추적하는 것으로 제한됩니다. 이제 비디오 카메라 디스플레이를 보면서, 플렉시글라스 케이지 상단의 눈부심이나 반사를 제거하도록 조명의 각도와 위치를 조정하십시오. 시각적 아티팩트가 없는 깨끗한 마우스 영상을 확보하는 것이 좋은 결과를 얻기 위한 가장 중요한 단계입니다.

LMA의 시간적 차이로 인한 잠재적 영향을 최소화하기 위해 각 그룹에 실험군과 대조군 피험자를 항상 모두 포함하십시오. 테스트 직전에 케이지에서 둥지 재료와 풍부화 재료를 제거하십시오. 이러한 재료들이 마우스의 시야를 가릴 수 있기 때문입니다. 비디오 촬영 시, 관련 실험 정보가 기재된 슬레이트와 함께 녹화를 시작하십시오.

비디오를 정확하게 식별하려면 카메라 디스플레이의 타이머를 사용하여 테스트 지속 시간을 추적하고, 동물의 시야 밖으로 벗어나십시오. 녹화 시간 동안 주의하십시오. 테스트가 완료되면 모든 재료를 각 케이지에 다시 넣으십시오.

동물을 다시 테스트해야 하는 경우, 테스트 사이에 먹이와 물을 다시 제공하십시오. 테스트 세션의 비디오 녹화본을 하드 디스크 드라이브와 같이 비디오 추적 시스템과 호환되는 보관용 매체에 저장하십시오. 비디오 추적 시스템에서 비디오를 실시간으로 분석하십시오. 처음에는 케이지 바닥 전체를 추적을 위한 관심 영역 또는 ROI로 설정하십시오.

Figma tax 평가와 같은 심층 분석을 위해, 고처리량 연구를 위한 다수의 케이지 내 ROI를 생성하십시오. 개별 케이지 바닥 ROI를 사용하여 비디오 내의 모든 케이지를 동시에 분석하십시오. VTS가 총 이동 거리, 이동 속도 및 이동 지속 시간을 계산하도록 설정하십시오. 계산이 완료되면 데이터를 스프레드시트 파일로 내보내어 저장하고 추가 분석을 수행하십시오.

장기 테스트는 단기 테스트와 동일한 방식으로 수행됩니다. 다만, 먹이와 물을 공급하기 위한 새로운 진입점이 마련된 수정된 케이지가 필요합니다. 먼저, 표준 케이지의 짧은 쪽 끝벽에 직경 5.5 centimeter의 구멍을 뚫습니다.

다음으로, 1/4인치 아연 도금 강철 망에 1/2인치 크기의 개구부를 내고, 동일한 망을 사용하여 날카로운 모서리를 다듬어 매끄럽게 만든 뒤, 개구부 위의 망에 연결할 수 있는 사료 펠릿용 외부 호퍼를 제작합니다. 그다음 리벳용 구멍을 뚫습니다. 이후 알루미늄 리벳과 스테인리스 스틸 와셔를 사용하여 케이지의 구멍을 망과 연결된 호퍼로 덮어 고정합니다.

수분을 공급하기 위해, 표준 50 milliliter 삼각 플라스크와 노드립 흡입 튜브를 삽입할 수 있도록 구멍을 크게 뚫은 1구 고무 마개를 사용하여 급수병을 제작하십시오. 이 급수병을 케이지에 고정하십시오.

벨크로 테이프를 사용하여 시퍼 튜브(sipper tube)를 메시로 덮인 개구부를 통해 삽입해야 합니다. 이제 케이지를 플렉시글라스 덮개로 덮어두면, 단기 운동성 분석(short term locomotor assay)에서 설명한 것과 동일한 절차에 따라 마우스가 음식과 물을 계속 섭취할 수 있습니다. 장기 분석은 보통 12시간 동안 또는 현재 명암 주기의 해당 단계가 끝날 때까지 진행됩니다.

장기 운동 능력 테스트는 일반적으로 비디오 녹화를 하지 않고 실시간으로 분석합니다. 하지만 보조 카메라를 사용하거나 주 카메라에 연결된 DVD 레코더를 통해 녹화가 가능합니다. 비디오 추적 시스템의 처리 용량이 허용하는 한 마우스를 계속 테스트할 수 있으며, 단기 테스트와 마찬가지로 옥수수 속대나 톱밥 깔개는 그대로 두고 둥지 재료로 사용된 풍부화 물질만 케이지에서 제거합니다.

VTS에서 실시간 분석을 위해 비디오 추적 시스템을 설정합니다. 기록되는 각 케이지의 바닥 전체를 포함하도록 추적 ROI를 설정합니다. 단기 분석과 마찬가지로, 총 이동 거리, 이동 속도 및 이동 시간을 계산하도록 시스템을 설정합니다.

그 다음 분석 후, 데이터를 스프레드시트로 내보내 저장하고 반복적인 단기 운동 능력 분석을 통해 분석하십시오. 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide) 주입 후, 개별 환기 케이지(IVC)에서 사육된 마우스가 일반 환경 케이지(EC)에서 사육된 마우스보다 주입으로 인한 단기 LMA 손실로부터 더 빠르게 회복되는 것으로 나타났습니다. LPS가 주입된 그룹 간의 초기 운동 능력 손실은 비슷했으나, 기저 운동 능력으로의 회복은 더 빠르게 나타났습니다. IVC에서 사육된 마우스의 경우, 이동 속도와 이동 지속 시간 또한 더 빠르게 회복되었습니다.

본 분석에서는 검출 변수를 사용하여 초당 2cm의 움직임이 감지되면 추적을 시작하고, 초당 1.75cm가 되면 추적을 중단하도록 설정하였습니다. 2회 연속의 12시간 활동 주기에 걸쳐 이동성에 대한 소규모 테스트를 수행하였습니다. 정상 마우스에서는 이동 거리, 이동 속도 또는 이동 지속 시간에서 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다.

측정 가능한 차이가 없는 추세가 큰 표본 크기로 반복했을 때도 계속된다면, 해당 데이터는 이 분석법이 장기 운동 능력 분석에 사용되는 이식형 송신기를 대체하여 사용될 수 있음을 시사할 것입니다. 이 절차를 시도할 때는 실험 전 사육 조건에 특히 유의하는 것이 중요합니다. 모든 실험군 및 대조군 동물은 특히 광주기, 실내 온도 및 상대 습도와 관련하여 유사한 환경 조건에 있어야 합니다.

또한, 이 절차를 마친 후에는 소음 및 냄새 자극에 대한 노출을 최소화해야 합니다. 특정 실험의 처리가 전반적인 운동 능력에 영향을 주지 않으면서 우울증 유사 행동을 유발하는지 등 추가적인 질문에 답하기 위해 강제 수영 검사와 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다.