동시 사전 및 사후 신경 Electrophysiological 녹화에서 Xenopus 신경 근육 공동 문화

이 절차의 전반적인 목표는 xenopus 배아에서 시냅스로 결합된 척추 뉴런과 근육 세포의 1차 배양을 얻는 것입니다. 이것은 먼저 인간 융모막의 아트로폰을 수컷과 암컷 개구리에 주입하고 수정란을 수집하여 xenopus에서 번식을 유도함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 22기 배아에서 젤리 코트와 파텔 및 막을 제거하는 것입니다.

다음으로, 척추 뉴런과 근육을 배아에서 분리하고 피부를 제거하고 폐기합니다. 마지막 단계는 분리된 세포를 배양 접시에 플레이트화하고 기능적 신경근 접합부를 형성하는 것입니다. 궁극적으로, 기능적 시냅스 연결은 배양 중인 뉴런과 근육 세포의 동시 쌍 패치 클램프 기록으로 입증될 수 있습니다.

이 기술의 장점은 쉽게 접근할 수 있는 척추동물 시냅스 제제를 얻을 수 있다는 것입니다. 시냅스후 전기생리학적 기록으로 신경전달물질 방출을 모니터링하는 동시에 시냅스전 이온 발생을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 이 방법은 명확하고 간단하여 해부 현미경 외에 특별한 장비가 필요하지 않으며, 배양물을 간단한 배양 배지에 실온에서 보관할 수 있습니다.

이 제제는 시냅스 전(pre-synaptic), 생화학적(biochemical) 및 생물물리학적 사건(biophysical events)이 신경전달물질 방출과 어떻게 결합되는지를 포함하여 시냅스 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 유용할 수 있습니다. 또한 신경 조절 시냅스 형성 및 시냅스 가소성 연구에도 유용합니다.이 절차를 시작하려면 함께 제공되는 원고에 따라 필요한 솔루션을 준비하십시오. 그런 다음 유리 페이스트리 피펫 끝에 미누친 핀을 붙여서 최소 두 개의 마이크로 해부 도구를 제작합니다.

Sano 아크릴 접착제를 사용하여 핀의 날카로운 끝이 피펫 끝을 지나 약 0.5cm 확장되도록 합니다. 배양을 준비하기 이틀 전에 암컷의 눈에 띄는 붉은색 발톱 아이카와 수컷의 앞발 평면 표면에서 어두운 색소를 관찰하여 번식 준비가 된 XUS 쌍을 식별합니다. 다음으로 각 개구리를 그물로 잡고 그물과 함께 싱크대에 복부 쪽을 아래로 향하게 하여 탈출할 수 있도록 합니다.

그물을 통해 HCG 1ml를 주입하고 등쪽 림프 자루 중 하나에 피하로 주입하여 동물이 새로 낳고 수정된 난자를 짓밟지 않도록 합니다. 탱크 바닥에 1-2 인치의 메쉬 크기가 장착 된 차폐 바닥을 설치하십시오. 그런 다음 번식 쌍을 덮개가 있는 10갤런의 물 탱크에 함께 놓습니다.

스크린 아래 바닥에서 수정란이 관찰될 때까지 12시간에서 48시간 동안 개구리를 방해하지 않고 그대로 두십시오. 그런 다음 수조에서 동물을 제거하되 알은 최소 24시간 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 이 한 쌍의 개구리는 6주 후에 다시 교배할 수 있습니다.

다음으로, 탱크 바닥에서 배아를 풀고 10% 식염수가 함유된 60 x 15mm 배양 접시 4개 또는 5개로 옮깁니다. 새로운 쿠페의 계획에 따라 배아를 단계별로 정렬하고 왼쪽과 같이 가볍고 갈색 및 흰색 모델링으로 외관이 부드러운 Faber 배아가 이상적입니다. 반면에, 오른쪽과 같이 큰 검은색 또는 흰색 반점이 있는 배아는 일반적으로 건강하지 않고 사용할 수 없다.

층류 후드 라벨 내부에는 360 x 15mm 멸균 배양 접시의 약 절반을 10% 식염수와 CMF로 채웁니다. 멸균 유리 페이스트리 피펫을 사용하여 5-10 단계를 사용하여 22-24 개의 배아를 후드 내부의 스테레오 줌 해부 현미경 8 개를 사용하여 10 % 식염수가 함유 된 접시 중 하나에 넣고 두 쌍의 멸균 집게를 사용하여 각 배아에서 젤리 코트와 viel membrane을 제거합니다. 10% 식염수가 함유된 나머지 두 접시를 통해 한 번에 하나씩 배아를 통과시켜 맨 배아를 씻고 마지막으로 CMF가 들어 있는 접시에 넣습니다.

다음으로, 한 쌍의 집게로 각 배아를 부드럽지만 단단히 잡고 미세 해부 도구를 사용하여 동물의 가장 등쪽에 위치한 신경관 및 관련 근종을 제거합니다. 이렇게 하려면 세 개의 조각을 만드는데, 하나는 신경관 위치의 양쪽 끝에 있고 세 번째는 신경관 바로 복부에 있습니다. 그런 다음 절개된 각 신경관 근절제를 난황자 과립 및 기타 파편이 없는 접시의 깨끗한 부분으로 이동합니다.

CMF에서 약 15분 후 집게를 사용하여 색소가 침착한 피부를 절개된 조직에서 들어 올리고 피부를 버립니다. 추가로 30분에서 60분 후에 세포는 서로 해리되면서 모래 더미를 형성합니다. 이 절차에서 10 밀리리터 배양 배지 튜브를 해동시킨 다음 70 마이크로 리터의 ITS 35 나노 그램 당 BDNF 라벨을 만들고 35 밀리미터 멸균 배양 접시를 L 15 배양 배지로 약 절반 정도 채 웁니다.

해부한 각 배아에 대해 하나의 배양 접시를 사용하십시오. 도금 피펫을 제작하려면 유리 페이스트리 피펫의 양쪽 끝을 잡고 테이퍼 부분을 화염 위에 놓습니다. 그런 다음 끝을 약 10cm까지 당깁니다.

그 후 약 0.2mm의 팁에 양보하기 위해 끝을 끊습니다. 그 후, 도금 피펫을 사용하여 한 배아에서 쌓인 모래를 빨아들입니다. 추출되는 용액의 양을 최소화하도록 주의하십시오.

다음으로, 세포를 배양 접시의 바닥으로 배출하고 여러 줄로 플레이트합니다. 그런 다음 세포가 접시에 부착될 시간을 허용하기 위해 도금된 세포의 접시를 최소 15분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 배양에서 12-24시간 후, 도금된 세포는 뚜렷한 형태학적 특성을 발달시킵니다.

예를 들어, 근육 세포는 방추 모양이 되고 척추 뉴런은 긴 과정을 발달시킵니다. 요산염, 정맥류 및 근육 세포 사이의 기능적 시냅스 접촉은 동시 쌍을 이룬 전기생리학적 기록으로 확인할 수 있습니다. 이를 위해 기록을 위한 두 개의 패치 전극을 준비하는데, 하나는 시냅스전 정맥류를 위한 것이고 다른 하나는 근육 세포를 위한 것입니다.

그런 다음 시냅스전 전극을 인포테린(info terin) 함유 용액으로 채우고 시냅스후 전극을 칼륨 내부 용액으로 채웁니다. 그런 다음 배양 접시의 배지를 NFR로 교체하십시오. 그런 다음 얼굴 조영 광학 장치가 장착된 도립 현미경으로 옮기고, 암포테리신이 함유된 전극으로 시냅스전 정맥류를 패치하고 다른 전극으로 시냅스후 근육 세포를 패치하여 시냅스의 기능을 확인하고, 패치 클램프 증폭기로 정맥류를 탈분극하고, 동시 시냅스전 및 시냅스후 전류를 관찰합니다.

이 그림은 도금 직후의 세포 및 배양에 대한 5배 파워 뷰를 보여주며, 이는 40배에서 동일한 배양입니다. 다음은 배양에서 신경근 접합부(neuromuscular junction)로, 뉴런 소마(neuronal soma), 시냅스전(presynaptic), 정맥류(varicosity) 및 시냅스후 근육 세포(postsynaptic muscle cell)를 보여줍니다. 여기에 표시된 것은 시냅스전(presynaptic) 및 시냅스후(postsynaptic) 전류입니다.

마이너스 30 밀리 볼트에서 플러스 40 밀리 볼트까지 시냅스 전 정맥류에 제시된 10 밀리 볼트 증분 전압 단계의 적용에 대한 응답으로 두 셀의 유지 전위는 마이너스 70 밀리 볼트였습니다. 일단 마스터하면이 기술을 약 2 시간 안에 완료 할 수 있습니다. 그런 다음 생존 가능한 세포 배양은 빠르면 24시간 내에 얻을 수 있으며 며칠 동안 유지할 수 있습니다. 이 제제는 이미 수년 동안 사용되어 신경근 전달의 기본 특성 중 일부를 설명하는 데 도움이 됩니다.

이 비디오를 통해 연구자들이 이 강력하고 간단한 기술에 더 익숙해질 수 있도록 도와줌으로써 발견을 지속할 수 있기를 바랍니다.