Name: 예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 배우세요 생쥐 태아 전뇌 반구 전체 explant를 이용한 초기 대뇌피질 발달 연구 방법입니다. 이 기술은 유전자 조작 및 약리학적 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NINDS (NS066071)과 NIAAA의 보조금을 지원했다. (P50AA017823) ECO합니다. 저자는 박사 로버트 퀸과 동물 보호를위한 실험실 동물 자원학과에서 직원을 감사드립니다. 우리는 여름 학부 연구원 (서핑) 등 지원, 기술 지원 니콜 Belletier을 저드슨 벨몬트 감사드립니다. 우리는 또한 의견 박사 데이비드 카메론 감사하고 원고의 이전 버전에 수정할 수 있습니다.

플라스미드 녹색 형광 단백질 표현 1. 예를 자궁에 Electroporations <ol><li> 플라스미드 DNA 주입 솔루션은 ddH 2 O.에서 0.33 MG / ML의 최종 작업 농도로 희석 편대의 편대장-eGFP DNA 27와 함께 준비가되어 있습니다 Qiagen 엔도 - 무료 맥시 - 최상의 상태로 준비가 변형 박테리아의 플라스미드를 정화하는 데 사용됩니다. ~ 0.02 % (w / V 최종)에서 고속 녹색 염료는 주입 추적과 DNA 솔루션에 추가됩니다. </li><li> 외과 영역을 준비하려면 70 % 에탄올 솔루션으로 벤치 상단과 해부 현미경 단계를 스프레이 건조 닦으십시오. 이전 해부 70 %의 에탄올과 수술 가위와 집게를 뿌려서 건조 닦으십시오. </li><li> 모든 운동은 적어도 1 분 동안 중단 될 때까지 시간이 초과되었습니다 임산부 스위스 / 웹스터 댐은 가압 실린더에서 CO 2로 가득하고 댐이 모니터링되는 챔버 내로 송금 E13에 희생되어 있습니다. CO 2 흡입에 의해 희생 한 후에 태아는 자궁에서 제거하고에 배치10cm 페트리 접시가 포함 된 얼음 차가운 행크스 균형 잡힌 생리 식염수 (HBSS). </li><li> 조심스럽게 주변 extraembryonic 멤브레인의 각 배아를 해부하고 얼음처럼 차가운 HBSS에 유의하시기 바랍니다. </li><li> 차가운 HBSS를 포함하는 두 번째 10cm 페트리 접시에 각각 배아를 전송합니다. 향후 분석을 위해 대뇌 피질의 지역에서 spatially 별도의 대뇌 피질의 영역에 주입 관리하고, 왼쪽 대뇌 반구의 심실에 DNA 빠른 녹색 혼합물로부터 2-3 μl를 삽입하기 위해 해밀턴 주사기를 사용하십시오. </li><li> electroporate하려면, 포셉으로 부드럽게 배를 잡고 가볍게 머리의 등 중간 선에 트위터 전극의 긍정적 인 패들 넣고 가볍게 배아 턱 아래에있는 부정적인 패들 놓습니다. Electroporations는 950 밀리 초 간격으로 구분 된 50 밀리 초 기간 다섯 30 V 펄스를 제공하는 프로그램 BTX830 electroporator으로 달성된다. 이러한 설정은 BTX830 모델입니다. 다른 시스템은 제조업체의 instructio에 따라 사용할 수 있습니다NS. </li></ol> 2. 전체 반구의 Explant 준비 <ol><li> electroporation 후 배아는 얼음처럼 차가운 HBSS에 다시 배치됩니다. 뇌는 배아의 머리에서 피부와 연골 성의 두개골을 제거하는 두 # 5 보석의 집게를 사용하여 제거됩니다. forcep는 다음 두개골에서 그대로 뇌를 제거하는 뇌 아래에 하락하고 있습니다. electroporated 반구는 (왼쪽)가 뇌에서 떨어져 해부되고 첨부 된 중간 뇌 조직은 제거됩니다. 분해 절차 관리를 통해 왼쪽 대뇌 피질 반구를 놓인 meninges을 손상하지 않도록 이루어집니다. </li><li> 일단 각 배아는 절단 한 ML 피펫 팁과 pipettor를 사용하여 HBSS에 전송됩니다 해부 했어요. 반구는 부드럽게 콜라겐 코팅 문화 삽입에 퇴학하고 있습니다. 최대 6 개의 반구의 explants에 각 24mm 삽입에 안쪽면을 아래로 배열된다. 일단 배치, 초과 HBSS는 삽입에서 제거되고 삽입 나서 잘 6 잘 요리 중 하나가 35mm에 배치됩니다. 잘은 EXA가 포함되어 있습니다미디어 ctly 2.7 ML : DMEM-F12 미디어 Glutamax을 포함하고있는 2 % B-27, 1 % G5와 1% 페니실린 - 패 혈성 보충. 잘에서 미디어의 몇 방울은 각 explant의 상단에 pipetted 수 있지만 잘 따라 원래의 2.7 ML를 초과 미디어를 추가하지 않습니다. </li><li> explants가 콜라겐 필터에 배치 한 후 explants를 포함하는 6도 요리는 Billups 로텐 버그 (BR) 챔버 (또한 물을 증발 접시를 포함)에 배치됩니다. 95 % / 5 %의 산소 / CO 2 가스 혼합물은 챔버 시스템 종료를 밀폐하고 95 % / 5 % 산소 / CO 2 가스 공급 튜브를 분리하기 전에 적어도 1 분 동안 챔버 내로 주입된다. BR 챔버는 다음 문화 시대, 1-2 DIV의 나머지 부분에 대해 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 배치됩니다. </li></ol> 3. 조직학에 대한 Explant 조직의 고정 <ol><li> 연기 후드에 preheated (~ 80 &amp; 드의 100 ML에 paraformaldehyde의 첫 solubilizing 8g하여 Pagano 고정 솔루션을 준비g, C) ddH 2 O. NaOH는 solubilization을 홍보하고 부드럽게 저어하는 집중 1-3 방울을 추가합니다. 일단 500 밀리미터 자당, 100 밀리미터 Hepes, 산도 7.4, 50 MM MgCl 2, 250 밀리미터 자당 50 밀리미터 Hepes의 4 % paraformaldehyde의 최종 농도 5 밀리미터 KCl이 그 솔루션을 8 % paraformaldehyde 솔루션 1:1 혼합 solubilized , 25 MM MgCl 2, 2.5 MM KCl, pH를 7.4. </li><li> explants이 37 ° C.에 Pagano 수정 솔루션을 따뜻하게 해결하려면 신속하게 잘 각 문화에서 DMEM/F12 미디어의 대부분을 제거하고 explants의 각 잘에 Pagano의 수정의 5 ML을 추가합니다. 수정에 완전히 각 explant를 커버해야합니다. RT에서 1 시간 수정. 이전 고정 1 시간에 필터에서 explants를 제거하지 마십시오. </li><li> 고정은 Pagano 수정 솔루션을 제거하고 수정없이 Pagano 솔루션 (250 밀리미터 자당 50 밀리미터 Hepes, 25 MM MgCl 2, 2.5 MM KCl, pH를 7.4)로 교체 한 후. 삽입 될 때까지 4에 10 %의 나트륨 azide 및 매장 ° C의 몇 방울을 추가합니다. </li></ol> 4. 삽입 및 S조직학에 대한 ectioning <ol><li> 따뜻한 물 (55-60 ° C)의 100 ML에 종아리 피부 젤라틴 10g을 solubilizing하여 10 % 송아지 가죽 젤라틴 솔루션을 준비합니다. solubilized까지 ° C와 소용돌이 정기적으로 60로 설정 핫 플레이트에 젤라틴 용액을 넣습니다. </li><li> 10cm 페트리 접시의 바닥에 10 % 젤라틴 용액의 약 10 ML을 넣어 30 분 더욱 강화 할 수 있습니다. 이 explants를 삽입하기위한 &quot;패드&quot;를 형성합니다. 이 패드는 사전에 준비 일이, 4 ° C.에 저장 할 수 있습니다 페트리 접시의 바닥에 격자를 이끌어 그리드의 각 상자에 개별 explants를 전송하는 통치자를 사용합니다. 잔여 Pagano 솔루션을 제거하고 pipettor를 사용하여, 따뜻한 10% 젤라틴 솔루션으로 각 explant를 커버하고 더욱 강화 할 수 있습니다. 각 explant이 완전히 너무 한 번에 젤라틴 따뜻하게을 추가로 패드를 용해하지 돌보는, 젤라틴으로 둘러싸여 될 때까지 젤라틴 솔루션의 느린 또한을 다시 시작합니다. ~ 1 시간에 굳어 젤라틴을 위해 수 있습니다. 일단 individ 찼어, 무슨 일을 explants는 젤라틴의 작은 단위로 잘라 수 있습니다. 블록이 다음 사전 vibratome으로 sectioning에 24-48 시간에 대한 해결 Pagano에 게시 - 해결됩니다. </li><li> 젤라틴 블록에서 Explants는 후각 망울을 위치 100 μm 두께의 코로나 비행기에서 sectioned 있습니다. 섹션 수집 및 저장됩니다 PBS 4시 + 0.1 % 나트륨 azide ° C immunohistochemical 처리까지. </li><li> Immunohistochemical 감지가 24 잘 플레이트 (물론 당 2 ~ 3 개의 섹션)로 섹션을 전송하여 수행됩니다. 첫 번째 블록이 아닌 특정 항체 0.5 ML PBST를 추가하여 바인딩 + B 완만 한 진동 각 잘 길러 1 시간에 (PBS + 0.5 % 트리톤 X 100 2퍼센트 BSA). 적절한 기본 항체 그런 다음 PBST + B에 희석되어 잘 당 0.4 ML은 RT에서 하룻밤 배양에 추가됩니다. 기본은 3 배 PBS은 적어도 10 분마다 씻어 함께 씻어 수 있습니다. 차 항체와 2 μg / ML Hoechst 33342 얼룩 핵 그 다음 PBST + B에 희석되고 샘플은 RT에서 2 시간에 incubated 아르부드러운 진동과. 세 PBS 세차 (10 분마다)가 수행 된 다음 섹션은 90% 글리세롤 50 ㎜ 트리스, pH7.4, 장착 미디어를 사용 슬라이드에 장착되어 있습니다. </li></ol>

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</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

우리는 개선하고 실험 모델을 평가 한 - 전체 반구의 explants - 초기 대뇌 피질의 개발 연구를 (E13-E15). 모델은 대뇌 피질 25,37의 레이어 6 구성 흥분성의 신경 세포의 계보 (Lineage)의 이전과 차별화의 분석에 유용 입증되었습니다. 시스템의 주요 장점은 준비 간단하고, 뇌 발달의 초기, 중요한 기간 동안의 electroporation, 약리 조작 및 이미징을위한 뉴런 3) 실험 접속) 2) DIV에 대한 organotypic 성장, 2 1입니다. 우리는 형태, 방향 및 preplate 분할 기간 동안 층 6 대뇌 피질의 뉴런 7,38의 수지상 성장의 미묘한 차이를 문서화하는 시스템을 사용했습니다. 레이어 6을 입력 흥분성의 뉴런은 크게 등쪽 시상 39,40에 상호 입력을 제공 corticothalamic 프로젝션 뉴런으로 구성되어있다 </sup&gt;와 피질 41 신경 ...

연속 생성 뉴런의 공동 확산, 이전과 차별화를 통해 포유류의 대뇌 피질 양식. 각 신경 세포는 심실 구역 (VZ)에서 태어나 대뇌 피질 판 (CP) 1을 형성 중간 영역 (IZ)로 VZ에서 마이그레이션합니다.합니다 그들은 다른 대뇌 피질의 도메인을 통과으로, 마이그레이션 뉴런은 개발 조직 내의 세포 환경 및 기타 휴대 요소 (예 : 반경 glia)에 따라 마이그레이션 2,3의 여러 모드를 표시합니다. 대뇌 피질의 뉴런는 neuronal 마이그레이션 체포와 dendritogenesis (4)의 일치 과정에있는 성형 대뇌 피질 판의 상단에있는 마이그레이션을 체포. 대뇌 피질의 개발은 배아 일 원시 plexiform 계층 6 preplate (PP), 그 overlies VZ 선구자 뉴런의 층의 설립을 통해 11-13 (E11-13) 5 사이에 시작됩니다. 예기되는그런 다음 레이어 6 대뇌 피질의 뉴런 (VZ에서 태어난 즉, 첫 번째 대뇌 피질의 뉴런) 방향이 틀에 박힌 패턴의 somata와 PP 7 ~ 뚜렷한 층으로 뭉쳤다. 이러한 이벤트는 얕은 한계 (미래 대뇌 피질의 레이어 1)과 깊은 구역, subplate 세포 (과도 대뇌 피질의 레이어 7)로 구성 후자에 preplate를 나누었습니다. 이 과정은, preplate 분할이라고한다, 대뇌 피질 (8)의 미래 성장의 기초 행사입니다. 많은 유전자 변이는 대뇌 피질의 발달 9의 다양한 측면을 방해하는 확인되었습니다. 대뇌 피질의 개발은 또한 부정적인 등 코카인 10 술 11 등의 섭취 독소에 노출에 의해 영향을 수 있습니다. 개발하는 동안 발생하는 대뇌 피질의 기형은 신경 장애 (예 : 자폐증, 정신 분열증)에 가능성이 참여자 때문에, 대뇌 피질의 발달에 섭동의 경험적 조사는 고유 아르중요한 그겁니다. 그것은 유전이나 독소 효과의 빠른 assays을 허용뿐만 아니라 두뇌 개발 12이 초기 기간 동안 차별화 뉴런, 다른 세포 유형과 세포 외 기질 (ECM) 사이의 가능한 상호 작용을 보존 그 대뇌 피질의 개발을 공부하는 방법을 설정하는 데 상당한 중요성을 따라서입니다 . 슬라이스 explants 13 이러한 시스템을 제공하고 광범위하게 분석 대뇌 피질의 신경 세포 개발에 14-16로 사용되었습니다. 그러나, 슬라이스 assays는 neuronal 마이그레이션 및 적층이 가능 개발 뇌와 앵커 반경 glial 비계를 둘러싼 수막 세포에 손상으로 인해 17 이상이 될 수있는 단점으로 고생 할 수 있습니다. 레이디 얼 glial 섬유가 썰기하여 기저 얇은 판의 대뇌 피질의 신경 세포 이주 18 혼란의 중요한 기판 있으므로 로컬 반경 glial 아키텍처를 중단시키고 변경된 대뇌 피질의 마이그레이션 될 수 있습니다. 또한 SLI에게의explants의 ced 표면이 분야에서 ECM의 일반적인 구성을 변경할 수 있습니다 죽은 세포의 영역을 제공합니다. 최근 접근법은 적절한 건강 셀 유형 및 ECM으로 둘러싸여있는 통에 깊숙히 자리 세포에 자신의 분석을 집중하고 있습니다. 그러나 경우에 이러한 새로운 접근법은 슬라이스의 비교적 정상적인 내부는 분석 19-21에 사용할 수 있습니다 있도록 원래의 두꺼운 교양 슬라이스 고정 후 cryo-sectioned 또는 파라핀-sectioned 할 것을 요구 할 수 있습니다. 문화뿐만 아니라 분석을위한 고정 슬라이스의 후속 cryosectioning의 라이브 조각을 준비하는 sectioning 원래 vibratome 모두는 이러한 assays에 대한 관심과 노력이 작동해야합니다. 초기 대뇌 피질의 개발 연구 간단한 보완 접근 방식을 제공하기 위해, 우리는 초기 대뇌 피질의 개발 연구를 촉진하기 위해 기존 슬라이스 방식이 13으로 바뀌 었습니다. 우리는 대체를 개발65분 당 회전하고 16-18 시간 22,23에 대한 허용 organotypic 성장에 떨고 문화를 포함하여 기존 E14 전체 반구의 모델과 비슷한 OLE 반구의 explant 모델입니다. 우리의 접근 방식에 전체 반구의 explants은 48 시간에 organotypic 대뇌 피질의 성장을 확장하는 높은 산소 문화 분위기 21,24에서와 반 투과성 막 13에 표시됩니다. 이 방법은 또한 대뇌 피질의 뉴런을 개발 일관된 electroporation 할 수 있습니다. 태아는 자궁에서 제거 플라스미드 DNA를 소개 electroporated과 telencephalon 그 다음 해부되어 있습니다. 각 반구의 고립과 콜라겐 코팅 필터 안쪽면을 아래로 배치됩니다. explant 그런 다음 48 시간, preplate 분할 8 포함 기간 동안 배양하고 있습니다. 문화 기간 동안 L6 뉴런은 대뇌 피질 판에서 올바른 위치에 차별화 된 뉴런 25 일에 구체에서 개발할 수 있습니다. 이 기간 개발 전반에 걸쳐신경 세포는 생체의 해당 셀을 직면 것이다 적절한 ECM과 세포 유형으로 둘러싸여 있습니다. 이 시스템은 이미 에탄올 독성 26 층 6 형성과 preplate 분할 7,25를 기초 세포 사건을 해독에서 중요한 입증했다.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>10565</td><td></td></tr><tr><td>G5 Supplement 100X</td><td>Invitrogen</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td><td>Invitrogen</td><td>1504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pen / Strep Liquid 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 500 ml</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>문화 삽입 콜라겐 코팅 </td><td>Costar</td><td>3492</td><td></td></tr><tr><td>소 가죽 젤라틴 </td><td>시그마</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree 플라스미드 맥시 키트</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX 830 Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>핀셋 전극 10mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450166</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Billups Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기 (5uL)</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기 바늘</td><td>Hamilton</td><td>7803-04</td><td>1" 및 스타일 4</td></tr><tr><td>지정 Dumont #5 집게</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위 터프 컷 9cm</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr></tbody></table>

예 자궁 electroporation 및 전체 반구의 explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

대뇌 피질의 개발은 뉴런과 전구체 세포, 혈관, meninges 및 관련 세포 외 기질 등의 비 neuronal 요소들 간의 복잡한 상호 작용을 포함한다. 그들은 적절한 organotypic 환경을 제공하기 때문에, 대뇌 피질의 슬라이스 explants는 종종 neuronal 차별화 및 개발을 제어 이러한 상호 작용을 조사하는 데 사용됩니다. 이익이지만, 슬라이스 explant 모델은 비정상 세포 적층 및 마이그레이션 등의 단점으로 고생 할 수 있습니다. 여기 대뇌 피질의 조각과 쇼 일관 organotypic 마이그레이션 및 적층보다 준비하는 것이 더 쉽습니다 초기 대뇌 피질의 개발 연구 전체 대뇌 반구의 explant 시스템을보고합니다. 이 모델 시스템에서 초기 적층 및 마이그레이션 패턴, preplate 분할의 기간을 포함하여, 체외에서 2 일 동안 일반적으로 미래의 대뇌 피질 층 중 여섯 양식을 진행합니다. 우리는 전 자궁의 electroporation (EUEP)를 개발등쪽 내측 피질에서 개발 뉴런에 GFP 표현을 타겟팅 ~ 80 %의 성공을 달성 접근. 전체 반구의 explant 모델은 electroporation, 약리 개입 및 라이브 영상 방식의 접근이 초기 대뇌 피질의 개발을합니다. 이 방법은 transfection 및 면적 타겟 일관성을 모두 개선하면서 자궁 electroporation (IUEP) 접근 방식에서 요구 생존 수술을 방지합니다. 이 방법은 neuronal 확산, 이전과 차별화의 실험 연구를 촉진합니다.

배아 쥐 대뇌 피질의 발달 기간에 걸쳐 가로 neurogenetic 기울기를 전시 등 그 옆 네크로는 등쪽 내측 네크로 28 약 1 하루가 발전되어 있습니다. 레이어 6 뉴런의 일괄 따라서 측면 피질에 E12에 (또한 필드 40 5이라고도 함)과 E13의 등쪽 내측 피질 (또한 필드 1 5이라고도 함)에 (S-단계의 마지막을 전시 IE) 생성됩니다. Preplate 분류 레이어 6 신경 세포 생성 후 약 1 일 시작하므로 E13의 측면 피질과 E14의 등쪽 피질에서 시작됩니다. preplate 분할 및 대뇌 피질 판 개발의 개시를 연구하기 위해, 우리는 슬라이스 explant 분석 21,24으로 바뀌 었 전체 대뇌는 E13에서 E15 (그림 1)에 일반적으로 배양 된 있도록. 우리는 전체 반구의 explants D의 성장을 조사하여 대뇌 피질의 expl...

이 프로토콜은 관련 개선 explant 절차를 설명합니다<em&gt; 예 자궁</em&gt; 배아 마우스에서 전체 대뇌의 electroporation, 해부 및 문화. 준비 초기 대뇌 피질의 개발 기간 동안 유전자 기능의 약리 연구와 assays을 용이하게한다.

예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

본 절차의 전체적인 목표는 초기 피질 발달 연구를 위해 대뇌 반구 전체 설명편(explan)을 준비하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배아 13일 차에 마우스 배아를 채취합니다. 그다음, 플라스미드 DNA 혼합물을 대뇌 뇌실에 주입하고 자궁 외 전기천공법(ex utero electroporation)을 수행합니다.그 다음, 전기천공된 배아로부터 전체 반구 외편(whole hemisphere explan)을 준비합니다. 마지막 단계는 조직학적 분석을 위해 전체 반구 외편을 고정하고 절편을 만드는 것입니다. 최종적으로, GFP를 발현하는 뉴런의 면역 조직학적 분석을 통해 돌연변이 또는 독소 노출이 피질 뉴런 발달에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.제 이름은 Eric Olson입니다. 저는 이곳 시러큐스에 있는 SUNY Upstate Medical University의 신경과학 및 생리학과에 소속되어 있으며, 오늘은 저희가 개발한 whole Hemisphere X explan이라는 방법을 소개해 드리겠습니다. 슬라이스 explan과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 whole hemisphere X explan의 준비 과정이 간단하며 2일 동안의 기관 유사 성장이 가능하다는 점입니다.이 방법은 특정 돌연변이나 독소가 초기 피질 발달을 어떻게 방해하는지와 같이 신경 발달 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 뇌막을 손상시키지 않고 대뇌 반구 전체를 적출(explan)하는 준비 과정에 숙련되기까지 다소 어려움을 겪을 수 있습니다. 조직이 기계적 손상에 매우 민감하여 해부 및 적출물 전이 단계를 익히기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.시연은 제 실험실의 박사후 연구원인 Theresa Ozzi 박사가 진행하겠습니다. 본 프로토콜에서는 상용 키트를 사용하여 플라스미드를 정제하십시오. 플라스미드 DNA를 물에 0.33 mg/mL 농도로 준비하고, 주입 추적자로 fast green 염료를 약 0.02% w/v로 첨가하십시오. 수술 도구, 작업 공간 및 현미경은 항상 소독하십시오.70% ethanol로 소독한 후, 임신 13일(E 13)차의 Swiss Webster 모묘를 필요한 수만큼 이산화탄소 흡입법으로 희생시킵니다. 배아를 적출할 때, 얼음처럼 차가운 HBSS가 담긴 10cm 디쉬에 넣고 계속해서 냉장 상태를 유지하십시오. 주변의 배외막으로부터 각 배아를 조심스럽게 분리합니다.이제 각 배아를 HBSS가 담긴 차가운 깨끗한 디쉬로 개별적으로 옮깁니다. Hamilton 주사기를 사용하여 준비된 DNA 2~3 µL를 좌측 대뇌 반구의 뇌실에 주입합니다. 향후 분석 예정인 피질 영역 내부나 그 주변으로는 주입하지 마십시오.DNA를 전기천공하기 위해, 핀셋으로 배아를 조심스럽게 잡고 트위저 전극의 양극 패들을 머리의 등쪽 정중선에 살짝 놓습니다. 음극 패들을 배아의 턱 아래에 살짝 놓습니다. BTX 830 모델을 사용하여 1초 간격으로 각각 50 ms 동안 30 V 펄스를 5회 가하는 프로그램을 실행하거나, 다른 시스템의 경우 제조사의 지침에 따라 설정할 수 있습니다.각 배아를 얼음처럼 차가운 HBSS로 다시 옮기고, 5번 보석 세공용 핀셋 두 개를 사용하여 해부 현미경 하에서 전체 반구 분리 준비를 진행합니다. 배아 머리에서 피부와 연골성 두개골을 제거합니다. 그다음, 핀셋을 뇌 아래로 밀어 넣습니다.두개골에서 온전한 뇌를 제거하려면, 부착된 중뇌 조직을 포함하여 전기천공법을 시행한 반구를 절개하여 분리하십시오. 이때 절개된 피질 반구 위에 있는 뇌수막이 손상되지 않도록 주의하십시오. 뇌수막을 손상시키지 않고 전기천공 반구를 절개 및 제거하는 과정이 가장 숙달하기 어려운 단계였습니다.박리한 후, 넓힌 1 mL 피펫 팁을 사용하여 각 반구를 5 mL의 얼음처럼 차가운 HBSS로 옮깁니다. 필요한 경우, 배아를 12웰 조직 배양 접시의 개별 웰에 보관할 수 있습니다. 다음으로, 최대 6개의 반구를 24 mm 콜라겐 코팅 배양 접시 위로 조심스럽게 옮깁니다.인서트를 내측면이 아래로 향하게 삽입하고 배치합니다. 이제 6-웰 플레이트의 35 mm 웰에 보충 배지 2.7 mL를 채웁니다. 인서트에서 과량의 HBSS를 제거하고 배지가 담긴 웰에 인서트를 넣은 후, 웰 내의 배지를 피펫으로 몇 방울 취해 각 외세편(explant) 상단에 떨어뜨립니다.배지의 부피를 늘리지 마십시오. X 외식편 위에 배지를 몇 방울 떨어뜨려 X 외식편이 배지로 완전히 덮이지 않도록 하는 것이 중요하다는 점을 발견했습니다. 이는 X 외식편 위의 배지 2.7 ml에 최대 400 µL까지 추가하는 것을 의미할 수 있습니다.가습용 물 접시가 들어 있고 최소 1분 동안 95% oxygen이 주입된 billups rothenberg chamber로 dish를 옮깁니다. chamber를 밀폐하고 가스 공급 튜브를 분리합니다. 이 chamber를 37 °C 인큐베이터에 2일 동안 보관하며, 이 기간 동안 prepl splitting이 진행됩니다.준비 단계입니다. explan 매립을 위한 패드를 제작합니다. 60 °C에서 10% 송아지 피부 젤라틴 용액을 제조합니다.가용화가 완료되면, 용액 약 10 milliliters를 10 centimeter 디쉬에 붓습니다. 남은 용액은 나중에 사용할 수 있도록 60 °C로 유지합니다. 필요한 경우 패드가 응고될 때까지 30분 정도 둡니다.4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있으나, 사용 전에는 반드시 상온으로 가온해야 합니다. 고정 작업을 수행하는 당일에 흄 후드 내에서 Pagano 고정액과 고정액이 포함되지 않은 Pagano 용액을 준비하십시오. 고정 용액을 37°C로 가온하십시오.조직이 손상되지 않도록 주의하며 배양기에서 외식편을 신속하게 꺼냅니다. 배지를 대부분 제거하고, 가온된 고정액 5 mL로 교체합니다. 각 외식편이 완전히 잠겼는지 확인합니다.조직을 상온에서 1시간 동안 고정합니다. 그 후 고정액을 제거하고 Pagano 용액으로 교체합니다. 고정액은 사용하지 않습니다.각 웰에 10% sodium azide를 몇 방울씩 첨가합니다. 이제 조직을 임베딩 패드에 포매할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. 자를 사용하여 디쉬 바닥에 그리드를 그립니다.2~3cm 크기의 정사각형 조각을 만듭니다. 개별 외식편을 매립 패드로 옮깁니다. 잔류 용액을 피펫으로 제거하고 각 외식편을 따뜻한 10% gelatin 용액으로 덮습니다.이를 응고시킵니다. 천천히 응고되면, 각 절편이 완전히 둘러싸일 때까지 젤라틴 용액을 더 추가합니다. 젤라틴을 한꺼번에 너무 많이 추가하면 패드가 녹을 수 있으므로 주의하십시오.이제 젤라틴이 약 한 시간 동안 굳도록 둡니다. 젤라틴이 굳으면, 절편을 만들기 전에 개별 explan을 작은 젤라틴 블록으로 자를 수 있습니다. 이 블록들을 Pagano 고정액에 하루나 이틀 동안 후고정(post fix)하는 것이 중요합니다.절편 제작 시, 외측구(olfactory bulb)가 위를 향하도록 외식편을 배치하고 관상면(coronal plane)을 따라 100 µm 두께로 절단합니다. 절단된 절편은 0.1% sodium azide가 포함된 냉각된 PBS에 수집합니다.설명된 기법을 사용하여 염색할 때까지 절편을 4 °C에서 보관하십시오. 전판 분할 전에 E 13 단계에서 뇌반구 전체 외식편을 준비했습니다. 등쪽 신피질에서.해당 조직에는 흥분성 피질 계통의 미성숙 뉴런을 보고하는 트랜스진이 포함되어 있었습니다. 동일한 리터에서 얻은 피질 외식편을 in vitro에서 2일에 걸쳐 순차적으로 drop fixed 처리한 후, 후속 조직학적 분석을 위해 프로세싱하였습니다. 초기 분석 시점인 DIV 0에는 필드 1x1에서 prepl splitting이 아직 발생하지 않았습니다.CP가 뚜렷하게 나타났으며 2D IV까지 계속해서 성장했습니다. 따라서 E 13에 처음 배양된 전체 반구 외식편은 대뇌 피질의 성숙을 이틀 동안 지원하였으며, 배측 신피질의 초기 분리를 포착하여 배측 신피질의 정상적인 조직학적 발달을 확인했습니다. 2D IV 외식편을 콘드로이틴 황산, 프로테오글리칸 및 세포외 기질 성분에 대해 면역 염색했습니다. 배측 피질에서 나타난 두 개의 면역 반응 밴드는 인 비트로 배양 기간 동안 PPP가 MZ와 SP로 적절히 분리되었음을 나타냈습니다.PP는 CTIP2와 TBR1을 발현하는 6개의 피질 뉴런에 의해 분리되었습니다. 이러한 마커들의 면역 염색 패턴은 새로 형성된 cp에서 이러한 전사 인자들이 적절하게 발현되었음을 확인시켜 줍니다. 종합적으로, 이러한 분석들은 설명된 전체 프로토콜을 사용하여 전체 뇌 반구 설명 내에서 ORGANOTYPIC한 초기 피질 발달이 이루어졌음을 확인해 줍니다. 무손상된 E13 배아의 좌심실에 주입이 수행되었습니다.vz의 신경 전구세포에서 전기천공 후 처리된 GFP 발현이 관찰되었습니다. IZ와 cp에서 강한 GFP 발현 세포들이 관찰된 한편, 중요하게는 화살표로 표시된 수많은 GFP 양성 뉴런들이 수상돌기와 축삭이 형성되며 발달 중인 CP의 상단에서 관찰되었습니다. CP와 MZ 사이의 경계면에서 보이는 뚜렷한 층은 적절한 이동, 정지 및 층판 형성이 이루어졌음을 나타냅니다.수상돌기는 MZ로 뻗어 있었으며, 피질-시상 축삭은 CP 아래 및 iz로 뻗어 있었습니다. 분화 중인 세포들은 다양한 성숙 단계의 GFP 양성 세포들이었으며, 여기에는 방사형 글리아 섬유와 인접한 양극성 형태의 뉴런과 그 아래 iz에 위치한 다극성 뉴런이 포함되었습니다. 또한 수상돌기는 ECM 단백질인 reelin이 적절하게 면역 국소화된 MZ로 뻗어 있었습니다.따라서 전기천공법 및 외식편 배양 조건은 피질 뉴런의 정상적인 발달을 가능하게 합니다. 예상대로 분열 후 GFP 양성 뉴런들이 형성 중인 cp에 자리 잡았습니다. 결과적으로, 이 프로토콜은 L six 피질 뉴런의 이동 및 성숙 연구를 위해 해당 세포들을 안정적으로 타겟팅할 수 있습니다.이 절차를 광범위하게 적용한 결과 79%의 성공률을 보였습니다. 총 248회의 시도 중 195회가 이미징 및 분석에 적합한 것으로 나타났습니다. 실패 사례의 절반은 GFP 발현 실패 또는 표적 GFP 누락으로 인해 발생했으며, 이는 숙련 후 개선되었습니다.이 기술은 적절하게 수행될 경우 90분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 전기천공된 대뇌 반구가 이후 과정에서 뇌수막이 손상되지 않은 상태로 배양될 수 있도록 박리 연습을 하는 것이 중요합니다. 관심 있는 돌연변이가 신경세포 이동이나 수지상 돌기 생성(dendritogenesis)을 어떻게 방해하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 타임랩스 현미경 관찰과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

ex-utero-electroporation-whole-hemisphere-explants-simple

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E15 마우스 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

대뇌 피질의 발달에서 유전자의 기능의 신속한 평가를 실시하기 위해, 우리는 관련된 방법을...

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

여기에서는 해마 발달 중 특정 유전자의 조절 메커니즘을 조사하는 도구를 제공하는 프로토콜을 제시합니다. 자궁외 전기천공법(ex utero electroporation) 및 유기형 절편 배양을 사용하면 단세포에서 관심 유전자의 발현을 상향 및 하향 조절하고 발달 과정에서 이들의 운명을 따를 수 있습니다.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

이 프로토콜은 자궁 내 전기천공법을 통해 C57BL/6 중추신경계의 다른 영역을 구체적으로 transfection하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에는 피질, 해마, 시상, 시상하부, 외측 중격 핵 및 선조체로 발달하는 영역의 형질주입에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

배우세요 생쥐 태아 전뇌 반구 전체 explant를 이용한 초기 대뇌피질 발달 연구 방법입니다. 이 기술은 유전자 조작 및 약리학적 연구에 활용됩니다.

예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

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