예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법

본 절차의 전체적인 목표는 초기 피질 발달 연구를 위해 대뇌 반구 전체 설명편(explan)을 준비하는 것입니다. 이를 위해 먼저 배아 13일 차에 마우스 배아를 채취합니다. 그다음, 플라스미드 DNA 혼합물을 대뇌 뇌실에 주입하고 자궁 외 전기천공법(ex utero electroporation)을 수행합니다.

그 다음, 전기천공된 배아로부터 전체 반구 외편(whole hemisphere explan)을 준비합니다. 마지막 단계는 조직학적 분석을 위해 전체 반구 외편을 고정하고 절편을 만드는 것입니다. 최종적으로, GFP를 발현하는 뉴런의 면역 조직학적 분석을 통해 돌연변이 또는 독소 노출이 피질 뉴런 발달에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.

제 이름은 Eric Olson입니다. 저는 이곳 시러큐스에 있는 SUNY Upstate Medical University의 신경과학 및 생리학과에 소속되어 있으며, 오늘은 저희가 개발한 whole Hemisphere X explan이라는 방법을 소개해 드리겠습니다. 슬라이스 explan과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 whole hemisphere X explan의 준비 과정이 간단하며 2일 동안의 기관 유사 성장이 가능하다는 점입니다.

이 방법은 특정 돌연변이나 독소가 초기 피질 발달을 어떻게 방해하는지와 같이 신경 발달 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 뇌막을 손상시키지 않고 대뇌 반구 전체를 적출(explan)하는 준비 과정에 숙련되기까지 다소 어려움을 겪을 수 있습니다. 조직이 기계적 손상에 매우 민감하여 해부 및 적출물 전이 단계를 익히기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

시연은 제 실험실의 박사후 연구원인 Theresa Ozzi 박사가 진행하겠습니다. 본 프로토콜에서는 상용 키트를 사용하여 플라스미드를 정제하십시오. 플라스미드 DNA를 물에 0.33 mg/mL 농도로 준비하고, 주입 추적자로 fast green 염료를 약 0.02% w/v로 첨가하십시오. 수술 도구, 작업 공간 및 현미경은 항상 소독하십시오.

70% ethanol로 소독한 후, 임신 13일(E 13)차의 Swiss Webster 모묘를 필요한 수만큼 이산화탄소 흡입법으로 희생시킵니다. 배아를 적출할 때, 얼음처럼 차가운 HBSS가 담긴 10cm 디쉬에 넣고 계속해서 냉장 상태를 유지하십시오. 주변의 배외막으로부터 각 배아를 조심스럽게 분리합니다.

이제 각 배아를 HBSS가 담긴 차가운 깨끗한 디쉬로 개별적으로 옮깁니다. Hamilton 주사기를 사용하여 준비된 DNA 2~3 µL를 좌측 대뇌 반구의 뇌실에 주입합니다. 향후 분석 예정인 피질 영역 내부나 그 주변으로는 주입하지 마십시오.

DNA를 전기천공하기 위해, 핀셋으로 배아를 조심스럽게 잡고 트위저 전극의 양극 패들을 머리의 등쪽 정중선에 살짝 놓습니다. 음극 패들을 배아의 턱 아래에 살짝 놓습니다. BTX 830 모델을 사용하여 1초 간격으로 각각 50 ms 동안 30 V 펄스를 5회 가하는 프로그램을 실행하거나, 다른 시스템의 경우 제조사의 지침에 따라 설정할 수 있습니다.

각 배아를 얼음처럼 차가운 HBSS로 다시 옮기고, 5번 보석 세공용 핀셋 두 개를 사용하여 해부 현미경 하에서 전체 반구 분리 준비를 진행합니다. 배아 머리에서 피부와 연골성 두개골을 제거합니다. 그다음, 핀셋을 뇌 아래로 밀어 넣습니다.

두개골에서 온전한 뇌를 제거하려면, 부착된 중뇌 조직을 포함하여 전기천공법을 시행한 반구를 절개하여 분리하십시오. 이때 절개된 피질 반구 위에 있는 뇌수막이 손상되지 않도록 주의하십시오. 뇌수막을 손상시키지 않고 전기천공 반구를 절개 및 제거하는 과정이 가장 숙달하기 어려운 단계였습니다.

박리한 후, 넓힌 1 mL 피펫 팁을 사용하여 각 반구를 5 mL의 얼음처럼 차가운 HBSS로 옮깁니다. 필요한 경우, 배아를 12웰 조직 배양 접시의 개별 웰에 보관할 수 있습니다. 다음으로, 최대 6개의 반구를 24 mm 콜라겐 코팅 배양 접시 위로 조심스럽게 옮깁니다.

인서트를 내측면이 아래로 향하게 삽입하고 배치합니다. 이제 6-웰 플레이트의 35 mm 웰에 보충 배지 2.7 mL를 채웁니다. 인서트에서 과량의 HBSS를 제거하고 배지가 담긴 웰에 인서트를 넣은 후, 웰 내의 배지를 피펫으로 몇 방울 취해 각 외세편(explant) 상단에 떨어뜨립니다.

배지의 부피를 늘리지 마십시오. X 외식편 위에 배지를 몇 방울 떨어뜨려 X 외식편이 배지로 완전히 덮이지 않도록 하는 것이 중요하다는 점을 발견했습니다. 이는 X 외식편 위의 배지 2.7 ml에 최대 400 µL까지 추가하는 것을 의미할 수 있습니다.

가습용 물 접시가 들어 있고 최소 1분 동안 95% oxygen이 주입된 billups rothenberg chamber로 dish를 옮깁니다. chamber를 밀폐하고 가스 공급 튜브를 분리합니다. 이 chamber를 37 °C 인큐베이터에 2일 동안 보관하며, 이 기간 동안 prepl splitting이 진행됩니다.

준비 단계입니다. explan 매립을 위한 패드를 제작합니다. 60 °C에서 10% 송아지 피부 젤라틴 용액을 제조합니다.

가용화가 완료되면, 용액 약 10 milliliters를 10 centimeter 디쉬에 붓습니다. 남은 용액은 나중에 사용할 수 있도록 60 °C로 유지합니다. 필요한 경우 패드가 응고될 때까지 30분 정도 둡니다.

4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있으나, 사용 전에는 반드시 상온으로 가온해야 합니다. 고정 작업을 수행하는 당일에 흄 후드 내에서 Pagano 고정액과 고정액이 포함되지 않은 Pagano 용액을 준비하십시오. 고정 용액을 37°C로 가온하십시오.

조직이 손상되지 않도록 주의하며 배양기에서 외식편을 신속하게 꺼냅니다. 배지를 대부분 제거하고, 가온된 고정액 5 mL로 교체합니다. 각 외식편이 완전히 잠겼는지 확인합니다.

조직을 상온에서 1시간 동안 고정합니다. 그 후 고정액을 제거하고 Pagano 용액으로 교체합니다. 고정액은 사용하지 않습니다.

각 웰에 10% sodium azide를 몇 방울씩 첨가합니다. 이제 조직을 임베딩 패드에 포매할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. 자를 사용하여 디쉬 바닥에 그리드를 그립니다.

2~3cm 크기의 정사각형 조각을 만듭니다. 개별 외식편을 매립 패드로 옮깁니다. 잔류 용액을 피펫으로 제거하고 각 외식편을 따뜻한 10% gelatin 용액으로 덮습니다.

이를 응고시킵니다. 천천히 응고되면, 각 절편이 완전히 둘러싸일 때까지 젤라틴 용액을 더 추가합니다. 젤라틴을 한꺼번에 너무 많이 추가하면 패드가 녹을 수 있으므로 주의하십시오.

이제 젤라틴이 약 한 시간 동안 굳도록 둡니다. 젤라틴이 굳으면, 절편을 만들기 전에 개별 explan을 작은 젤라틴 블록으로 자를 수 있습니다. 이 블록들을 Pagano 고정액에 하루나 이틀 동안 후고정(post fix)하는 것이 중요합니다.

절편 제작 시, 외측구(olfactory bulb)가 위를 향하도록 외식편을 배치하고 관상면(coronal plane)을 따라 100 µm 두께로 절단합니다. 절단된 절편은 0.1% sodium azide가 포함된 냉각된 PBS에 수집합니다.

설명된 기법을 사용하여 염색할 때까지 절편을 4 °C에서 보관하십시오. 전판 분할 전에 E 13 단계에서 뇌반구 전체 외식편을 준비했습니다. 등쪽 신피질에서.

해당 조직에는 흥분성 피질 계통의 미성숙 뉴런을 보고하는 트랜스진이 포함되어 있었습니다. 동일한 리터에서 얻은 피질 외식편을 in vitro에서 2일에 걸쳐 순차적으로 drop fixed 처리한 후, 후속 조직학적 분석을 위해 프로세싱하였습니다. 초기 분석 시점인 DIV 0에는 필드 1x1에서 prepl splitting이 아직 발생하지 않았습니다.

CP가 뚜렷하게 나타났으며 2D IV까지 계속해서 성장했습니다. 따라서 E 13에 처음 배양된 전체 반구 외식편은 대뇌 피질의 성숙을 이틀 동안 지원하였으며, 배측 신피질의 초기 분리를 포착하여 배측 신피질의 정상적인 조직학적 발달을 확인했습니다. 2D IV 외식편을 콘드로이틴 황산, 프로테오글리칸 및 세포외 기질 성분에 대해 면역 염색했습니다. 배측 피질에서 나타난 두 개의 면역 반응 밴드는 인 비트로 배양 기간 동안 PPP가 MZ와 SP로 적절히 분리되었음을 나타냈습니다.

PP는 CTIP2와 TBR1을 발현하는 6개의 피질 뉴런에 의해 분리되었습니다. 이러한 마커들의 면역 염색 패턴은 새로 형성된 cp에서 이러한 전사 인자들이 적절하게 발현되었음을 확인시켜 줍니다. 종합적으로, 이러한 분석들은 설명된 전체 프로토콜을 사용하여 전체 뇌 반구 설명 내에서 ORGANOTYPIC한 초기 피질 발달이 이루어졌음을 확인해 줍니다. 무손상된 E13 배아의 좌심실에 주입이 수행되었습니다.

vz의 신경 전구세포에서 전기천공 후 처리된 GFP 발현이 관찰되었습니다. IZ와 cp에서 강한 GFP 발현 세포들이 관찰된 한편, 중요하게는 화살표로 표시된 수많은 GFP 양성 뉴런들이 수상돌기와 축삭이 형성되며 발달 중인 CP의 상단에서 관찰되었습니다. CP와 MZ 사이의 경계면에서 보이는 뚜렷한 층은 적절한 이동, 정지 및 층판 형성이 이루어졌음을 나타냅니다.

수상돌기는 MZ로 뻗어 있었으며, 피질-시상 축삭은 CP 아래 및 iz로 뻗어 있었습니다. 분화 중인 세포들은 다양한 성숙 단계의 GFP 양성 세포들이었으며, 여기에는 방사형 글리아 섬유와 인접한 양극성 형태의 뉴런과 그 아래 iz에 위치한 다극성 뉴런이 포함되었습니다. 또한 수상돌기는 ECM 단백질인 reelin이 적절하게 면역 국소화된 MZ로 뻗어 있었습니다.

따라서 전기천공법 및 외식편 배양 조건은 피질 뉴런의 정상적인 발달을 가능하게 합니다. 예상대로 분열 후 GFP 양성 뉴런들이 형성 중인 cp에 자리 잡았습니다. 결과적으로, 이 프로토콜은 L six 피질 뉴런의 이동 및 성숙 연구를 위해 해당 세포들을 안정적으로 타겟팅할 수 있습니다.

이 절차를 광범위하게 적용한 결과 79%의 성공률을 보였습니다. 총 248회의 시도 중 195회가 이미징 및 분석에 적합한 것으로 나타났습니다. 실패 사례의 절반은 GFP 발현 실패 또는 표적 GFP 누락으로 인해 발생했으며, 이는 숙련 후 개선되었습니다.

이 기술은 적절하게 수행될 경우 90분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 전기천공된 대뇌 반구가 이후 과정에서 뇌수막이 손상되지 않은 상태로 배양될 수 있도록 박리 연습을 하는 것이 중요합니다. 관심 있는 돌연변이가 신경세포 이동이나 수지상 돌기 생성(dendritogenesis)을 어떻게 방해하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 타임랩스 현미경 관찰과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.