예 자궁 Electroporation 및 전체 반구의 Explants : 초기 두피 개발 연구 간단한 실험 방법
2013년 4월 3일
이 프로토콜은 관련 개선 explant 절차를 설명합니다 예 자궁 배아 마우스에서 전체 대뇌의 electroporation, 해부 및 문화. 준비 초기 대뇌 피질의 개발 기간 동안 유전자 기능의 약리 연구와 assays을 용이하게한다.
이 절차의 전반적인 목표는 조기 피질 발달 연구를 위해 전체 뇌반구 설명을 준비하는 것입니다. 이는 배아 13일에 마우스 배아를 수확하여 먼저 수행됩니다. 다음으로, 플라스미드 DNA 혼합물을 뇌실에 주입하고 자궁외 전기 충격을 수행합니다.
그런 다음 전기 충격된 배아에서 전체 반구 설명을 준비합니다. 마지막 단계는 전체 반구 설명을 조직학적 분석을 위해 고정하고 절단하는 것입니다. 궁극적으로 돌연변이 또는 독소 노출의 결과는 GFP 발현 뉴런의 면역 조직학적 분석을 통해 피질 뉴런 발달을 평가할 수 있습니다.
저는 에릭 올슨입니다. 저는 시러큐스에 있는 SUNY Upstate Medical University의 신경 과학 및 생리학과에 있으며, 오늘은 우리가 개발한 방법인 전체 반구 X 설명을 보여드리겠습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존 방법(예: 슬라이스 설명)에 비해 전체 반구 X 설명은 준비가 간단하고 2일간의 기관 유형 성장을 제공한다는 것입니다.
이 방법은 신경 발달 분야의 주요 질문, 예를 들어 특정 돌연변이 또는 독소가 조기 피질 발달을 어떻게 방해하는지 답변하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 멘인지를 손상시키지 않고 전체 반구 설명을 준비하는 데 몇 번의 연습이 필요할 수 있으므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 조직의 기계적 파괴에 대한 민감성으로 인해 해당 해부 및 설명 이전 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.
이 절차를 시연하는 것은 저의 실험실에 있는 박사 후 연구원인 테레사 오지 박사입니다. 이 프로토콜에는 상업적으로 사용 가능한 키트를 사용하여 플라스미드를 정제합니다. 플라스미드 DNA를 물에 0.33밀리그램 당 밀리리터로 준비하고 약 0.02%의 무게 볼륨 비율로 주사 트레이서로서 빠른 녹색 염료를 추가합니다. 항상 수술 도구, 작업 공간 및 현미경을 소독합니다.
70%에탄올을 사용하여 필요한 수의 Swiss Webster 암컷을 E 13에서 탄소 산화물 흡입으로 희생합니다. 배아를 제거한 후 얼음 찬 HBSS가 담긴 10센티미터 접시에 놓고 접시를 얼음 찬 상태로 유지합니다. 각 배아를 주변 외배아 막에서 조심스럽게 해부합니다.
이제 각 배아를 개별적으로 얼음 찬 HBSS가 담긴 깨끗한 접시로 옮깁니다. Hamilton 주사기를 사용하여 준비된 DNA의 2~3마이크로리터를 왼쪽 뇌반구의 뇌실에 주입합니다. 미래 분석을 위해 예정된 피질 영역이나 그 근처에는 주입하지 마십시오.
DNA를 전기 충격하기 위해 포스킵스로 배아를 부드럽게 잡고 전극 패들의 긍정 부분을 머리의 등쪽 중앙 선에 가볍게 놓습니다. 배아의 턱 밑에 부정 패들을 가볍게 놓습니다. 한 초 간격으로 50밀리초의 30볼트 펄스 5개를 실행하여 모델 BTX 830을 사용합니다. 다른 시스템은 제조업체의 지시에 따라 설정할 수 있습니다.
각 배아를 얼음 찬 HBSS로 되돌리고 해부 현미경을 사용하여 전체 반구 Explan 준비를 진행합니다. 2번과 5번의 보석상 포스킵스를 사용하여 배아 머리에서 피부와 연골질 두개골을 제거합니다. 다음으로 포스킵스를 두뇌 아래로 밀어 넣습니다.
두개골에서 온전한 뇌를 제거하기 위해 전기 충격된 반구를 포함하여 부착된 중간 뇌 조직을 해부합니다. 해부된 피질 반구를 덮는 멘인지를 손상시키지 않도록 주의합니다. 우리가 찾은 가장 어려운 단계는 멘인지를 손상시키지 않고 전기 충격된 반구를 해부하고 제거하는 것입니다.
해부 후 각 반구를 넓게 잘린 1
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Overview
This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection, and culture of entire cerebral hemispheres from embryonic mice. This preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.
Key Study Components
Area of Science
- Neuroscience
- Developmental Biology
- Pharmacology
Background
- Understanding early cortical development is crucial for insights into neurodevelopmental disorders.
- Ex utero electroporation allows for targeted gene manipulation in embryonic tissues.
- Whole hemisphere explants provide a comprehensive model for studying cortical neuron development.
- Histological analyses can reveal the effects of genetic modifications on neuronal populations.
Purpose of Study
- To prepare whole cerebral hemisphere explants for studying early cortical development.
- To evaluate the impact of mutations or toxins on cortical neuron development.
- To facilitate pharmacological studies using the explant model.
Methods Used
- Harvesting mouse embryos on embryonic day 13.
- Injecting plasmid DNA into the cerebral ventricle.
- Performing ex utero electroporation to introduce genetic material.
- Fixing and sectioning the whole hemisphere explant for histological analyses.
Main Results
- Successful preparation of whole cerebral hemisphere explants.
- Effective gene expression observed in GFP-expressing neurons.
- Histological analyses demonstrated the consequences of genetic modifications.
- Pharmacological studies can be conducted on the explants to assess drug effects.
Conclusions
- The improved explant procedure is a valuable tool for studying cortical development.
- Ex utero electroporation enables precise manipulation of gene function.
- This model can aid in understanding the effects of environmental factors on neuronal development.
