절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

이 절차의 전반적인 목표는 성체 미러링 심근세포에서 배양을 분리하고 수축 및 칼슘 처리를 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 muren 심장을 제거하고 실온에 두어 수행됩니다. PBS, 심장은 만화에 표시된 것처럼 접시에 캐뉼레이트하거나 영화에서와 같이 관류 시스템에 부착된 바늘에 직접 캐뉼레이트할 수 있습니다.

세 번째 단계는 관류, 완충액, 그리고 효소 완충액을 체내에 펌핑하여 심장을 세척하고 소화시키는 것입니다. 마지막 단계는 심실을 전달 완충액 접시로 자르고 집게로 조직을 부드럽게 다지는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 전체 세포 및/또는 육상 길이 측정 및 비율 측정을 통해 개별 심근세포 세포 수축 및 칼슘 처리를 보여줄 수 있습니다.

이온 광학 시스템을 사용한 RO 2:00 AM과 같은 칼슘 지표. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 혈관이나 심장 자체를 손상시키지 않고 대동맥을 통해 심장을 빠르게 매달아 놓는 것이 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 생후 약 12주령의 성체 마우스에게 150USP의 헤파린 나트륨을 복부 공간에 주입합니다.

마우스가 탈수된 경우 식염수 1cc를 주입합니다. 케타민 자일라진 혼합물 주사로 마우스 마취 체중에 따른 용량으로, 마우스는 뒷다리 발가락 꼬집음 반사 상실 및 호흡 속도 저하를 통해 깊이 마취되었는지 확인합니다. 진정제를 투여한 마우스를 수술대에 고정한 다음 심장을 절제하고 생리식염수가 담긴 접시에 넣습니다.

옵티 비전 해부 고글을 사용하여 대동맥을 식별하고 노출시킵니다. 대동맥 주위의 조직을 제거하는 것은 세포 분리를 위해 필요하지 않습니다. 대동맥근이 명확하게 보이는 한 펌프에 관류 완충액을 프라이밍합니다.

라인을 채우기 위해 빠른 속도로 펌핑을 시작하고 기포가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 심장 관류를 위한 유속을 설정하기 위해 느린 속도로 펌핑합니다. 순환 수조를 사용하여 관류 완충액의 온도를 섭씨 37도로 유지하십시오.

미세 절개 겸자를 사용하여 대동맥을 양말처럼 바늘에 올려 놓습니다. 바늘의 끝이 상행 대동맥, 이상적으로는 오른쪽 원위부의 대동맥 뿌리에 있는지 확인하십시오. 다음으로, 대동맥 위쪽에 10cm 길이의 봉합 실크를 묶어 심장을 바늘에 고정합니다.

넥타이가 오른쪽 동맥 아래의 상행 대동맥 수준에 있는지 확인하되 바늘 끝 위와 대동맥 판막 위에 있어야 합니다. 이제 심장을 원뿔 내부로 낮추십시오. 이것은 주변 온도를 유지하는 데 도움이 됩니다.

분당 1밀리리터의 속도로 5분 동안 관류 버퍼로 심장을 관류하고 유리 챔버 유출을 막아 PERFU 8이 원뿔형 유리에 모여 심장을 둘러쌀 수 있도록 합니다. 이 시점에서 심장 부피가 커지는 것을 볼 수 있습니다. 또한 심장 조직의 혈액은 PERFU 8 유발 조직으로 대체됩니다. 창백함.

펌프를 중지하여 튜브를 관류 완충액 용기에서 효소 완충액 용기로 이동합니다. 유출 클램프를 해제하여 PERFU 8을 배출합니다. 펌프를 다시 시작하여 심장 관류를 시작합니다.

분당 1밀리리터의 효소 완충액으로 유출을 다시 고정하여 효소 완충액이 심장을 둘러쌀 수 있도록 합니다. 여기. 효소가 심장을 관류시키고 결합 조직을 소화함에 따라 심장은 창백해지고 구조적 무결성이 감소합니다. 초보자의 경우 관류 라인을 압력계와 연결하는 것이 도움이 됩니다.

압력계는 또한 바늘의 위치가 심실이 아닌 대동맥 판막 위에 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 압력이 낮으면 바늘이 심실실에 있음을 나타내고 압력이 높으면 바늘이 판막에 닿는다는 것을 나타냅니다. 심장이 소화될 때, 결합 조직이 저항을 유지하지 못하기 때문에 압력이 급격히 감소합니다.

소화된 심장에서 심실을 절단할 시기를 결정하려면 원뿔형 유리에서 심장을 들어 올리고 집게로 심장을 부드럽게 짜낸 다음 작은 페트리 접시에 PERFU 8 몇 방울을 모아 확인합니다. 단세포가 8분에서 10분 안에 떨어지면 심실 압력이 떨어지고 단세포가 Perfu로 들어가는 것을 볼 수 있어야 합니다. 여덟 둘 중 하나가 처음 보이면 심장에서 심실을 잘라 전달로 가득 찬 접시로 만들고 보다 균일한 준비를 위해 완충 A

우심실을 잘라내고 제거하고, 좌심실은 다지고 연구할 수 있도록 남겨둡니다. 우심실에 관심이 있는 경우 분리 후 다질 수 있습니다. 마이크로 해부 겸자를 사용하여 각 심실을 개별적으로 다지고, 성공적인 소화는 다진 후 단단한 조직 덩어리를 거의 남기지 않으며 대부분의 조직은 해리 시 비정질이 됩니다.

조직을 추가로 해리하려면 팁이 절단된 플라스틱 페이스트 피펫을 통해 조직을 흐르게 합니다. 45도 각도로 클램프를 사용하여 사각형 메쉬 조각을 작은 깔때기에 고정하고 이 여과 장치를 15밀리리터 튜브에 넣습니다. 변형된 목초지 피펫을 사용하여 접시에서 세포 용액을 제거하고 용액을 15ml 튜브로 여과합니다.

살아있는 세포가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 몇 분 정도 걸립니다. 부피를 두 개의 튜브로 분할하면 더 빠르게 얻을 수 있습니다. 알리를 쫓는 펠릿.

4개의 칼슘 용액 각각을 2.5밀리리터를 4개의 개별 15밀리리터 튜브에 인용합니다. 표준 피펫을 사용하여 침전된 세포 펠릿을 첫 번째 칼슘 용액으로 조심스럽게 옮깁니다. 세포가 튜브 바닥에 가라앉도록 하고 이 과정을 반복합니다.

침전된 세포를 각각의 칼슘 용액을 통해 이동시킵니다. 세포가 네 번째 칼슘 용액으로 옮겨지면 튜브를 덮고 옆으로 뒤집습니다. MM SIS 시스템에 전원을 공급하여 아크 램프가 먼저 시작되도록 합니다.

그런 다음 칼슘 완충제로 시스템을 프라이밍합니다.B.펌프의 튜브를 MM 시스 챔버의 적절한 입구와 출구로 연결합니다. 챔버에 일반적으로 20 x 25mm의 적절한 크기의 유리 커버 슬립을 고정합니다. 500마이크로리터의 세포 용액을 작은 eend orph tube로 옮깁니다.

0.5 마이크로리터의 PHE 2:00 AM을 세포에 추가하고 방을 어둡게 한 후 5-7분 동안 실온의 어둠 속에서 배양하도록 합니다. 이제 챔버를 통해 칼슘 완충액 B를 조심스럽게 흐르기 시작합니다. 흐름이 시작되고 더 빨리 챔버 온도를 섭씨 37도까지 높이기 시작합니다.

변형된 피펫을 사용하여 세포 농도에 따라 커버 슬립에 하나 또는 두 방울의 세포 용액을 로드하고 세포가 안정되도록 합니다. 챔버에 있는 세포의 밀도입니다. 겹치지 않는 단일 셀이 sys 데이터 수집 플랫폼에 쉽게 있을 수 있어야 합니다.

챔버가 연결 와이어를 통해 myo Pacer에 연결되어 있는지 확인하고 실험을 위한 전압 및 주파수 설정을 시작합니다. 올바른 주파수로 박동하는 셀을 선택하고 프레이밍 조리개로 이동합니다. 카메라와 프레이밍 조리개 치수를 조정하여 전체 셀이 sarco 미러가 보이는 수평으로 향하는 창 중앙에 오도록 합니다.

다음으로, 잘 정의된 sarcomeres가 포함된 세포 영역에 상자를 놓고 초점을 조정하여 파워 스펙트럼의 피크를 최적화합니다. 또한 현미경의 밝기를 조정하여 파란색 스무딩 창과 검은색 대비 정보를 최적화합니다. 사진 승수를 켜고 녹음을 시작합니다.

충분한 데이터가 기록되면 일시 중지를 클릭하여 기록을 일시적으로 중지합니다. 중지를 클릭하지 마십시오. 이렇게 하면 녹음이 종료되고 해당 셀에 대한 배경을 녹음할 수 없습니다.

이제 초점 또는 viewing window의 치수를 변경하지 않고 microscope stage를 세포나 세포 물질이 보이지 않는 커버 슬립 영역으로 이동합니다. 그런 다음 resume을 클릭하여 배경 측정을 기록합니다. 충분한 배경이 녹음된 후 중지를 클릭하여 녹음을 종료합니다.

그런 다음 파일 저장을 클릭하여 해당 세포에 대한 모든 추적을 저장합니다.단일 ZPT 파일에서 성인 심근세포를 분리하면 화살촉이 자발적으로 박동하지 않는 막대 모양의 줄무늬 및 정지 세포가 생성되며 줄무늬가 없는 둥근 죽은 세포가 나타납니다. 정지 세포는 아데노바이러스로 배양하고 형질 주입하여 유전자 발현을 조작할 수 있습니다. 배양 24시간 후에도 살아있는 세포의 형태는 변하지 않습니다.

그들은 여전히 칼슘에 내성이 있으며 필드 자극에 의해 속도를 조절할 수 있습니다. 85 - 90%의 생존 가능한 세포의 수율이 가능합니다. MM SIS 시스템은 야생형 C 57 블랙 식스 마우스에서 채취한 근세포의 수축성과 칼슘 과도 상태를 측정하는 데 사용되었습니다. 동시에.

수축성 및 칼슘 취급의 측정은 fira 2:00 AM 비율의 바운드 대 언바운드 형태의 비율을 측정하여 이루어졌습니다. 측정은 설정마다 약간 다를 수 있지만 건강한 세포는 일반적으로 1.5에서 2.5 사이의 점수를 받았습니다. 수축성 및 칼슘 미량의 데이터를 분석하기 위해 미량의 평균을 구하여 각 세포에 대한 특징적인 미량을 생성했습니다. sys 소프트웨어에서 발견되는 mono transient data analysis 알고리즘을 사용하여 수축기 및 이완기 기능에 대한 매개변수는 특성 추적에서 생성되었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 개별 성인 해양 심근세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.