Name: Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: 배우세요 원생동물 숙주에서 세균을 수확하고 정량화하여 포유류 세포를 감염시키는 방법을 Legionella mala와 GFP 형광 표지를 활용하여 병원성 증가를 평가하는 기술입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 protozoan 세포 감염에 대한 템플릿을 제공하는 박사 크레이그 로이 박사 다리오 잠보니 감사드립니다. 원고의 중요한 검토 박사는 룰루 Cambronne, 우리는 박사 Jagdeep Obhrai 박사 Georgiana 퍼디 박사 프레드 Heffron 및 장비와 시약에 대한 토드 Wisner 감사드립니다. 유동 세포 계측법은 OHSU의 유동 세포 계측법 공유 자원 시설에서 수행되었다. 이 작품은 오리건 주와 NIH 보조금 R21 AI088275 (EDC)의 의학 연구 재단의 교부금으로 일부 지원되었다.

1. 프라이밍 단계 감염에 대한 Legionella pneumophila의 문화의 작성 <ol><li> 모든 L. 변환 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 인코딩 플라스미드 pAM239과 분석에 사용 pneumophila의 변종은 녹색 형광 단백질 (GFP) 28 inducible. 연속은 철과 시스테인로 박테리아 변종은 숯불 효모 추출물 한천 (CYEA)는 6.25 μg / ML chloramphenicol (CM) (플라스미드 유지 보수 용)과 72에 품다를 포함하는 버퍼 N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic 산을 (ACES) 보충 37 번 시간 ° C. </li><li> 보충 ACES에 박테리아 스트레인의 inoculum는 6.25 μg / ML의 CM과 1 밀리미터 IPTG로 (예) 효모 추출물의 국물을 버퍼 전송 37에 궤도 셰이커에 고정 단계 (O / N)으로 육성 ° C. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 체외 문화에서의 GFP 발현을 확인합니다. 덮개를 유리 슬라이드에 문화의 10 μl를 전송슬립와 GFP의 여기 / 방출 큐브 (AMG EVOS 층)와 60X 목적을 사용하여 이미지입니다. </li><li> 멸균 H 2 O를 사용 1시 10분에 체외 문화의 각 100 μl 나누어지는을 희석 1 ㎜의 IPTG, 6.25 μg / ML의 cm 물과 빈 네 100 μl를 사용하여 미디어를 확인합니다. 분광 광도계를 사용하여 dilutions의 OD600 측정 (바이오 RAD 스마트 사양 플러스)를보십시오. 체외 문화에 각각에 대해 나 역시 = 20에서 잘 감염에 볼륨이 필요한 계산 : V = [(아메바 시드) × - 나] / [OD 600 X (희석 계수) × (상수)] = [(1 X 10 6 ) × (20)] / [OD 600 X (10) X (1 × 10 6)] = 2/OD 600. 박테리아의 농도는 OD 600에 따라 결정된다 = 1.0 = 1 × 10 9 CFU / ML. </li></ol> 2. Acanthamoeba castellanii를 사용하여 프라이밍 단계 감염 <ol><li> 유지 RT에서 175cm 두 플라스크에 ATCC 712 PYG 매체에 amoebae을 배양. </li><li> amoebae 막에서 미디어를 교체tures 박테리아 액체 문화를 시작하기 전에 24 시간. 같은 날 액체 박테리아 문화가 시작되며, 수집하고 hemocytometer를 사용하여 가벼운 현미경에 셀을 계산합니다. </li><li> 1 개 10 6 세포 / ML의 최종 농도에 새로운 미디어 amoebae을 희석. amoebae 1 ML의 aliquots로 씨는 12도 세포 배양 접시 RT O / N.에서 반복 pipettor과 품다를 사용하여 </li><li> 부화 후, 1 ML 멸균 PBS는 10 ML 혈청 학적의 피펫과 피펫 수동 보조를 이용한 3 배 12도 세포 배양 플레이트의 우물을 씻는다. </li><li> PBS의 흡인 후, 1 ㎜의 IPTG와 각도에 6.25 μg / ML cm로 감염 미디어 (ATCC 712 PYG 미디어 마이너스 포도당, 펩톤, 그리고 효모 추출물)의 1ml를 추가합니다. 1 시간에 RT에있는 접시를 품다. </li><li> 나 역시 = 20에서 우물을 감염. 5 분 (Eppendorf 5810R) 400 XG에서 판을 원심 분리기 5 분에 37 ° C의 물을 욕조에 떠. 37 ° C, 18 시간에 대한 5퍼센트 CO 2 인큐베이터로 판을 전송합니다. </li><li> 박테리아의 세포 용해와 수확을 호스트하기 전에 형광 현미경에서 라이브 셀 이미징을 사용하여 감염을 확인합니다. </li></ol> 3. 대상 셀 무대 감염에 대한 THP-1 세포을 퍼 뜨리고 <ol><li> (사전 액체 박테리아 문화를 설정하고이 과정을 24 시간을 시작합니다). 10% 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS)와 RPMI 1640 미디어 가까운 confluency에 75cm 두 문화 플라스크에 THP-1 세포를 배양. </li><li> hemocytometer를 사용하여 정지 세포 수를 계산, 1 × 10 6 세포 / ML의 농도 10 % FBS, 100 NG / ML phorbol-12-myristate-13-아세테이트 (PMA)를 RPMI 1640 미디어 THP-1 세포를 희석 , 및 12도 세포 배양 접시에 1 ML aliquots에서 판. 37 48 시간의 번호판을 길러 ° C, 5 % CO 2. </li></ol> 4. 프라이밍 단계 감염 후 대상 셀 무대 감염 박테리아의 처리 <ol><li> 중이오 amoebae에서 미디어를 대기음. </li><li> 를 Lysemoebae는 10 분 동안 RT에서 얼음 차가운, 멸균 초 필터링 (UF) H 2 O와 품다 500 μl을 사용합니다. </li><li> 풀 유형을 변형하고 형광 플레이트 리더를 (분자 장치 Spectramax 쌍둥이 EM)을 사용하여 풀링 된 lysates 각각에 대해 E 512 nm의 측정을에 따라 lysates. </li><li> - + 0.0019 calcOD 600 = 0.0008 (lysate 배경 E 1024) : 풀링 된 lysates에 대한 OD 600 측정을 계산합니다. 수식이 이전 OD 600 L.의 dilutions의 E 512 nm의 측정을 모두 직접 비교를 그래프화할 수에 의해 결정되었다 체외 문화에 고정 단계 (그림 1 *)에서 pneumophila는 야생 타입의 표현 GFP. 감염된 아메바와 같은 실험 조건에 따라 감염되지 않은 아메바의 lysates은, 빈로 사용 방정식에 포함 된 보정 값 (예를 들면 lysate 배경) 제공됩니다. 볼륨 필요한 t에서 잘 감염 O - 나 = 20 각 lysate 수영장에 대해 계산됩니다 V = [(THP-1 시드) × - 나] / [calcOD 600 X (상수)] = [(1 X 10 6) X (20)] / [calcOD 600 X (1 × 10 6)] = 20 / calcOD 600. </li><li> PBS로 3 배 THP-1 세포를 씻어 각도에 1 ML 신선한 RPMI 1640을 (10 % FBS)를 추가합니다. 37 번 1 시간에 품다 THP-1 세포 ° C, 5 % CO 2. </li><li> 풀링 된 lysates를 사용하여 - 나 계산에서 THP-1 세포를 감염. 우물 일련의 흐름 cytometric 분석을위한 대조군으로 제공 감염되지 않은 상태로 유지 할 수 있습니다. 프라이밍 단계의 처리는 이하의 30 분에 완료해야합니다. lysates는 감염되기 전에 박테리아 유전자 발현의 변화를 제한하는 얼음에 보관됩니다. </li><li> 판을 원심 분리기, 온도를 높이 떠 있으며, 프라이밍 단계에서와 같이 품다. </li><li> 한 시간 후 감염, 흡인하여 미디어를 제거하고 세포 박테리아를 제거 할 수 PBS로 3 배 우물을 씻는다. </li><li> fre 1 ML을 추가쉬 RPMI 우물에 1,640 (10 % FBS)과 보육에 판을 반환합니다. 바로 미디어 교체 후 시간은 시간 제로 (T 0) 역할을합니다. 37 14-16 시간의 THP-1 세포를 배양 ° C, 5 % CO 2. </li></ol> 5. 실험 분석 5.1 라이브 셀 이미징 감염된 10X에서 형광 현미경 (AMG EVOS 층)를 사용하여 우물 또는 20X 배율 (그림 1A-D) 이미지. 이미지는 프라이밍 단계 및 대상 셀 무대 감염 모두에서 감염의 수준을 결정하는 중 질적 또는 양적 비교할 수 있습니다. 5.2 유동 세포 계측법 <ol><li> 다른 감염의 방출 봉우리는 유동 세포 계측법 (BD FACS Calibur)로 비교할 수 있습니다. 감염된 THP-1 세포를 Trypsinize 부드럽게 피펫으로 PBS에 혼합하여 우물에서 그들을 씻어. </li><li> 2 1800 XG 15 ML 팔콘 튜브 및 펠렛에 풀 변형 유형으로 세포를테이블 탑 원심 분리기에 분. </li><li> 1 ML PBS에서 알약을 일시 중지하고 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 1800 X g (Eppendorf 5424)에서 중지를 원심 분리기 1 ML PBS에서 산탄에게 다시 일시 중지합니다. 결과 현탁액이 높은 흐린 경우 (OD 600 ≥ 1.0) 사람들은 흐름 cytometer의 라인 막힘을 방지하기 위해 추가 PBS (1시 3분)에 희석해야합니다. </li><li> 흐름 cytometer의 평균에 대한 및 샘플 주사 사이의 세척 단계 살균 필터 PBS를 사용합니다. 이전 대상 셀 감염 샘플의 주입에 감염되지 않은 대상 세포의 전진 /면 분산시킵니다. </li><li> 488 nm의 레이저 여기와 FL1 채널을 사용하여 각 조건에 대해 총 20,000 이벤트를 수집합니다. </li><li> 게이트 포스트 캡처 전지 인구는 감염되지 않은 세포와 막대 그래프의 플롯 형광 강도 (FlowJo) (그림 1E)를 제외 할 수 있습니다. </li></ol> 5.3 CFU 도금 <ol><li> 효율성 O를 검사유동 세포 계측법에 수확 세포의 CFU 도금에 의해 F 감염. 초 필터링 H 2 10 -1에서 O, 10 -2, 10 -3에서 샘플 시리얼 dilutions을 준비합니다. </li><li> 6.25 μg / ML의 CM 각 희석 CYEA 판의 1 / 3로의 플레이트 20 μl. </li><li> 72 시간에 37 ° C에서 접시를 품다. </li><li> 이쑤시개와 셀 카운터를 사용하여 식민지를 계산합니다. </li></ol>

<ol><li>Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+bacterial+virulence+genes+that+are+specifically+induced+in+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues.</a> Science. 259, 686-688 (1993).</li>
<li>Mahan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-based+selection+for+bacterial+genes+that+are+specifically+induced+during+infection+of+a+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).</li>
<li>Rankin, S., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Legionella+pneumophila+promoters+regulated+by+the+macrophage+intracellular+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Agents+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment.</a> Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).</li>
<li>Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-induced+genes+of+Legionella+pneumophila%3A+protection+from+reactive+intermediates+and+solute+imbalance+during+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth.</a> Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).</li>
<li>Fields, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+ecology+of+legionellae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The molecular ecology of legionellae.</a> Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).</li>
<li>Cirillo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+growth+in+Acanthamoeba+castellanii+affects+monocyte+entry+mechanisms+and+enhances+virulence+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila.</a> Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).</li>
<li>Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Legionella+pneumophila+in+Acanthamoeba+castellanii+enhances+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion.</a> Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).</li>
<li>Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pneumophila+Transcriptome+during+Intracellular+Multiplication+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages.</a> Front Microbiol. 2, 60(2011).</li>
<li>Kilvington, S., Price, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Legionella+pneumophila+within+cysts+of+Acanthamoeba+polyphaga+following+chlorine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure.</a> J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).</li>
<li>King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+coliforms+and+bacterial+pathogens+within+protozoa+during+chlorination%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).</li>
<li>Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+novel+phagosome+by+the+Legionnaires%27+disease+bacterium+%28Legionella+pneumophila%29+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes.</a> J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).</li>
<li>Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+the+Legionnaires%27+disease+bacterium+%28Legionella+pneumophila%29+occurs+by+a+novel+mechanism%3A+engulfment+within+a+pseudopod+coil%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil.</a> Cell. 36, 27-33 (1984).</li>
<li>Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease+bacterium+%28Legionella+pneumophila%29+multiples+intracellularly+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes.</a> J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).</li>
<li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLoS Pathog. 5, e1000508(2009).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot%2FIcm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS One. 6, e17638Forthcoming.</li>
<li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Front Microbiol. 2, 136(2011).</li>
<li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li>
<li>Shin, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+processes+that+influence+the+intracellular+survival+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila.</a> Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).</li>
<li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).</li>
<li>Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Legionella+pneumophila+locus+required+for+intracellular+multiplication+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).</li>
<li>Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+killing+and+bacterial+conjugation+require+overlapping+sets+of+genes+within+a+22-kb+region+of+the+Legionella+pneumophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).</li>
<li>Segal, G., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+new+region+required+for+macrophage+killing+by+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila.</a> Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).</li>
<li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li>
<li>Haghjoo, E., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+transcriptional+regulator+that+controls+intracellular+gene+expression+in+Salmonella+Typhi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi.</a> Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).</li>
<li>Molofsky, A. B., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiate+to+thrive%3A+lessons+from+the+Legionella+pneumophila+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle.</a> Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).</li>
<li>Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-component+regulator+induces+the+transmission+phenotype+of+stationary-phase+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila.</a> Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).</li>
<li>Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Legionella+IcmS-IcmW+protein+complex+is+important+for+Dot%2FIcm-mediated+protein+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation.</a> Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).</li>
<li>Neild, A. L., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+reveal+dendritic+cell+functions+that+facilitate+selection+of+antigens+for+MHC+class+II+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation.</a> Immunity. 18, 813-823 (2003).</li>
<li>Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebae+as+training+grounds+for+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).</li>
<li>Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebae+promote+persistence+of+epidemic+strains+of+MRSA%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA.</a> Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).</li>
</ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

박테리아 유전자 발현이 밀접하게 생활주기의 진행과 주변 microenvironment의 신호에 응답의 조합을 통해 제어됩니다. 이러한 L. 같은 Vacuolar 병원균 phagosome에 compartmentalized 때 pneumophila는 호스트 세포 유래 단서의 다양한 응답 할 수 있습니다. 숙주 세포에 영양소를 고갈의 집단 결과, 세균은 이후 숙주 세포 25 성공적인 배포에 필요한 요소를 표현하여 보상. L.는 pneumophila 효율적으로 protozoan 세포의 다양한 기생하도록 구성되므로이 과정을 유도 할 수 이펙터 단백질의 광범위한 카탈로그을 비호. 이러한 효과기 단백질은 도트 / ICM 유형 IVb 분비 시스템 (16)에 의해 감염되는 동안 호스트 세포질에 직접 translocated 있습니다. 효과기 단백질 translocation은 결함 전송의 결과는 완전히 다른 숙주 세포 유형의 세포 성장을 폐기하는 변이 등이 필...

수많은 세균 병원체는 세포 내 구획의 생존과 복제 호스트 세포를 이용하기 위해 일반화 된 전략을 적응하고 있습니다. 많은 경우, 병원성 메커니즘은 protozoan과 metazoan 세포 사이의 비슷합니다. 그러나,이 두 microenvironments은 매우 다른과 독성 요인 1-4의 미분 표현 될 수 있습니다. 이 부대 &#39;병 박테리아 Legionella pneumophila는 ubiquitously 5 전 세계적으로 담수 환경과 연결되어 있습니다. 중요한 것은, L. pneumophila는 유전자 6-8을 재배에서 체외보다 다른 protozoan 셀을 종료 세균의 글로벌 유전자 발현 프로파일을 제안, 인간 단핵 세포 병원성 이득의 감염 이전에 protozoan 세포에서 재배. 자연에서 민물 amoebae는 침입 세균의 급속한 확대를 위해 영양이 풍부한 굴레를 제공합니다. L. 인간의 취득 pneumophila는 대개 세균을 포함 오염 된 물방울의 흡입에 따라 결정됩니다. 그것은 가능성이 이러한 방울 항구 protozoan 세포 관련 세균이, protozoan 전지는 기존의 수처리 관행 9,10에 더 강한 위치. 11-13 protozoan 호스트 세포에서 세균의 세포 수명주기와 거의 동일한 방식으로 폐 폐포 대 식세포 진행의 감염. 생존과 진핵 세포에서 복제하기 위해, L. pneumophila 다트 / ICM은 숙주 세포 14-16의 세포 기질에 거의 300 &#39;이펙터&#39;단백질을 제공하는 칭했다 전문 유형 IVb 분비 시스템을 사용합니다. 이러한 효과기 단백질은 집합 적으로 세균 17,18의 복제 허용 구획을 생성하기 위해 셀룰러 프로세스를 파괴하는 기능을 수행합니다. 세포 복수에 결함이있는 변종의 점 / ICM 전송 결과를 구성하는 26 유전자의에서 삭제iplication 19-23. 역사적으로, 개별 이펙터 인코딩 유전자의 삭제는 거의 세포 성장을위한 감쇠 변종이 발생하지 않습니다. 이러한 현상은 중복 기능과 effectors의 paralogous 사본 등 여러 가지 가설에 기인되었습니다. 일부 독성 요소는 호스트 세포 관련 세포 성장 (24)의 맥락에서 표현됩니다. 우리는 특정 이펙터 만 protozoan 감염의 맥락에서 표현 된 경우, 이펙터의 노력이 모두 체외에서 배양 된 야생 타입의 변형과 비교되지 않을 수 rationalized. replicative에서 투과성 단계로 L. pneumophila는 전환이 문화 25 고정 단계에 들어가면서. 위상 전환 표현형은 세포 성장을하는 동안 발생 및 운동성 26 flagella의 조립을 통해 예시되어있는 영양소를 고갈를 나타냅니다. 때문에 L. pneumophila 더 inva입니다protozoan 세포에서 수확 때 sive 및 악성, 우리는 호스트 대 식세포가 발생 될 때 더욱 충실 세균의 병원성 상태를 표현하는 검정을 개발을 모색하고 있습니다. 이를 위해, 우리는 첫 번째 (프라이밍 세포)와 두 번째 (대상 셀) 무대 감염 모두에 대한 적절한 호스트를 수용 할 수있는 다목적 protozoan의 프라이밍 분석을 개발했습니다. 감염 과정은 안정적으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 박테리아의 사용을 통해 다루기 쉬운 것입니다. protozoan Acanthamoeba castellanii의 감염 모델은 널리 필드에 27에서 사용되는 방법론을 따른다. 프라이밍 단계 L.에게 들어 pneumophila의 긴장이 표시 &#39;투과성&#39;박테리아를 (그림 1A) 생산 액체 미디어에 고정 단계로 체외에서 재배되고있다. 박테리아는 다음 A.의 monolayers를 감염하는 데 사용됩니다 castellanii 18 시간 동안 세포 생활주기의 후반 단계를 달성합니다. 대형 액포가 포함되어ING 박테리아는 형광 현미경 (그림 1A)를 사용하여이 시점에서 시각화 할 수 있습니다. Protozoan 전지는 다음 lysed되고 lysate에서 발견 한 박테리아는 형광 플레이트 리더를 사용하여 512 nm의에서 방출 측정합니다. 형광은 타겟 세포의 감염 (그림 1, * 상관 관계 곡선)에 대한 다중성 수준의 감염 (나 역시)를 계산하는 광학 밀도와 상관 있습니다. 침공 (T 0) 18 시간 후 침공 (T 18) 후, 대상 세포는 세포 내 박테리아를 대표하는 형광에 대한 평가합니다. 형광은 현미경과 유동 세포 계측법에 의해 모니터링 할 수 있으며, 가능한 카운트는 식민지 도금을 통해 측정 할 수 있습니다. 프라이밍 분석은 항상 야생 형 L.과 감염에 의해 동반 pneumophila 및 도트 / ICM 유형 IV 분비 시스템 (Δ dotA) (그림 1A)에 결함이 부담. 이 중요한 야생 형 사이의 직접 비교에 대한 내부 통제를 제공합니다감염 과정에 사용되는 차있는 isogenic 돌연변이 변종. 프라이밍 단계 동안 avirulent Δ dotA 변형의 포함은 체외에서 배양 아르 isogenic 돌연변이 변종과 관련된 감쇠 성장 phenotypes의 관찰에 대한 임계 값을 설정합니다.

<table><tbody><tr><td colspan = "4 ">< 강> 시약< / 강></td></tr> <tr><td>클로람페니콜</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>항생제</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma</td><td>A9758-1KG</td><td>미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>ATCC 매체 : 원생 동물을위한 712 PYG</td><td>ATCC</td><td></td><td>성장 미디어</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Fisher 과학적</td><td>SH30256FS</td><td>인산염 완충 식염</td></tr>수 <tr><td>활성탄</td><td>Fisher Scientific</td><td>C272-212</td><td>매체 성분</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>배지 성분</td></tr><tr><td>펩톤</td><td>BD 진단</td><td>211677</td><td>매체 성분</td></tr><tr><td>한천</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td>배지 성분</td></tr><tr><td>L-시스테인, 99%+</td><td>아크로스 유기물</td><td>173601000</td><td>미디어 보충제</td></tr><tr><td>질산철 비수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>I110-100</td><td>미디어 보충제</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>EVOS fl</td><td>AMG</td><td>EVOS fl</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>Smart Spec Plus</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>분광 광도계</td></tr><tr><td>5810 R 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>22627023</td><td>bench top 원심분리기</td></tr><tr><td>Repeater plus</td><td>Eppendorf</td><td>22230201</td><td>repeating pipette</td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>microplate reader</td></tr><tr><td>Softmax Pro 5.3</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td>microplate reader software</td></tr><tr><td>5424 microfuge</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td>table top 마이크로 원심 분리기</td></tr><tr><td>고속 방출 피펫 펌프 II</td><td>Scienceware</td><td>379111010</td><td>피펫 에이드</td></tr><tr><td>FACS Calibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>유세포 분석기</td></tr><tr><td>FlowJo 7.6.1</td><td></td><td>FlowJo 라이센스</td><td>유세포 분석기 소프트웨어</td></tr><tr><td>15 ml 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>폴리 프로필렌 원추형 튜브</td></tr><tr><td>1.6 ml 마이크로 퓨지 튜브</td><td>Neptune</td><td>3745.X</td><td>마이크로 원심분리기 튜브</td></tr></tbody></table>

protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

대부분의 세포 내 세균 병원균이 있습니다. 환경에서 확산을위한 자연 저수지로 민물 protozoans를 사용하여 Legionella pneumophila, 부대 &#39;폐렴의 원인이되는 에이전트는 먼저 이전 포유류의 대 식세포의 감염 protozoan 세포에서 수확 체외 배양 균에 비해 병원성 이점을 얻게되었습니다. 이 중요한 독성 요소가 제대로 체외로 표현되지 않을 수 있습니다 제안합니다. 우리는 프라이밍 L.위한 다루기 쉬운 시스템을 개발 포유류의 세포 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 Acanthamoeba castellanii을 통해 pneumophila 사전. 모든 독성 요소의 기여는 protozoan의 프라이밍 후 야생 형 박테리아에 돌연변이 변종의 세포 성장을 비교하여 검사 할 수 있습니다. GFP-표현 야생 타입과 돌연변이 L. pneumophila의 긴장은 프라이밍 단계에서 protozoan monolayers를 감염하는 데 사용과 세포 성장의 후반 단계에 도달 할 수 있습니다. 형광 박테리아는 다음이 감염된 세포를 채취와 포유류의 대 식세포에 후속 감염 박테리아의 비교 숫자를 생성하는 분광 광도법에 의해 표준화되어 있습니다. 정량화를 들어, 라이브 박테리아는 형광 현미경, 유동 세포 계측법, 그리고 식민지 도금하여 사용 감염 후 모니터링됩니다. 이 기술은 강조하고 자연 수집 경로에 발생 될 환경을 모방하여 호스트 세포에 의존 유전자 발현의 기여에 의존하고 있습니다. 이 방법은 병원성 우위를 확보하기위한 수단으로 중간 호스트를 사용하는 세균을 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

전체 감염 프로세스에 대한 일반적인 결과는 그림 1에 설명되어 있습니다. 야생 형 L.에 감염된 A.castellanii의 monolayers을 그린 셀 형광의 micrographs 라이브 프라이밍 단계 동안 pneumophila는 그림 1A에 표시됩니다. 프라이밍 단계의 성공적인 측정이 전부다에서 GFP이라는 세균으로 채워 큰 액포를 포함하는 호스트 세포의 약 90 %의 인구로 이어질 것입니다. 18 인사 후 감염의 대부분의 A. castellanii 전지는 최대 세균 하중을 달성 한 아직 인구의 용해을 최소화합니다. 빛 현미경에서 성공적으로 프라이밍 감염 반올림과 분리 amoebae가 표시됩니다. Gentamycin는 [25 μg / ML] 세포 박테리아의 기여를 제거하기 30 분에서 1 시간 게시물 감염 문화 매체에 추가 할 수 있습니다. effectors의 도트 / ICM로 인한 transloca...

이 기술은 이전 포유류의 세포의 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 세포에 미리 재배되고 세균 병원균의 세포 성장을, 수확 정상화하고 계량화 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 메소드는 프라이밍 단계뿐만 아니라 대상 셀 유형에 대한 호스트 세포의 다양한 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

이 절차의 전반적인 목표는 포유류 숙주 세포의 후속 감염을 위해 중간 숙주로부터 형광 추적이 가능한 박테리아를 수확하고 정량화하는 것입니다. 여기서는 GFP를 발현하는 Legionella mala를 사용하여 천연 숙주 원생동물인 Acanthamoeba castellanii 단층을 감염시킵니다. 그 후 선택적 용해를 통해 L. mala를 수확하며, 원생동물의 형광 방출 희석에 기반한 공식을 사용하여 박테리아 농도를 계산합니다.그 다음으로 프라이밍된 박테리아를 사용하여 포유류 세포 단층을 감염시킵니다. 마지막으로, 형광 현미경, 유세포 분석 및 용해물을 도말하여 콜로니 형성 단위를 회수하는 방법을 병행하여 포유류 세포 내 감염성 박테리아의 수를 측정합니다. 결과 데이터는 인공 배지에서 배양된 동일 균주와 비교했을 때, 프라이밍 단계에서 원생동물 세포에서 배양된 박테리아가 병원성 이점을 얻었음을 보여줍니다.우리는 박테리아의 특정 병원성 인자 발현이 시험관 내(in vitro) 배양만으로는 유도될 수 없다는 점을 관찰하여 이 기술을 개발했습니다. 배양된 세포 단층의 전형적인 감염 모델은 Legionella 및 기타 여러 박테리아의 경우 시험관 내에서 배양된 박테리아를 사용합니다. 프로테아좀은 박테리아가 병원성 이점을 얻을 수 있는 증식을 위한 천연 저장소 역할을 합니다.설명해 드릴 기술은 세포 내 성장 과정에서만 생성되는 병원성 인자의 기여도를 정확하게 측정하기 위해 프로테아좀 프라임 박테리아를 정량화하는 방법입니다. 이 절차는 연구 보조원인 Sam Renan과 Amri Lama 박사후 연구원이 시연할 것입니다. 분석에 사용되는 모든 L. pneumophila 균주에 IPTG 유도성 GFP를 인코딩하는 플라스미드 pAM239를 전기천공법으로 형질전환하여 이 절차를 시작하십시오. 박테리아를 37 °C의 진탕기에서 3시간 동안 배양한 후, 도말봉(spreader)을 사용하여 각 형질전환된 박테리아를 단일 플레이트에 스트리킹하고 37 °C에서 72시간 동안 배양하십시오.3일 후, 1 mM IPTG가 포함된 배지 3 mL에 박테리아 균주의 단일 콜로니를 접종하고, 37 °C의 오비탈 쉐이커에서 정지기에 도달할 때까지 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배양액 10 µL를 슬라이드 글라스 위에 옮기고 커버 글라스를 덮습니다. 그다음 현미경으로 슬라이드를 관찰하여 GFP 발현을 확인합니다.적절한 여기 및 방출 필터 하에서 60x

tractable-mammalian-cell-infections-with-protozoan-primed-bacteria

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Toxoplasma gondii는 조직 문화 모델 했었 수있는 환경 스트레스에 대한 응답으로 낭종 형태로 변환됩니다. 이 동영상은 골수 파생 macrophages 뼈를 활성화하거나 fibroblast 세포 성장 매체 산도를 변경하여 낭종 벽 형성을 검토하기 위해 기술을 보여줍니다.

활성 골수 - 유래 Macrophages과 Bradyzoite Toxoplasma gondii 약관의 낭종의 벽 형성

쥐 말라리아 기생충의 유전자 십자가는 모기에 두 유전자 별개의 기생충을 먹이에 의해 수행됩니다. 재조합 자손은 모기가 감염된 쥐를 물어 수 있도록 후 마우스 혈액에서 복제됩니다. 이 비디오의 유전자 십자가를 생산하는 방법을...

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

여기에서 우리는 유형 I 및 유형 II를 사용하는...

유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 시각화 및 encysting 기생충 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계의 분석을 가능하게 기생충 톡소 포자충, 감염된 마우스의 이미지를 160 μm의 두께 뇌 부분에 수 있었다.

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염 생체와 톡소 포자충

단백질 응집체의 프리온과 같은 증식은 최근 많은 신경 퇴행성 질환과 관련이 있는 것으로 부상했습니다. 이 프로토콜의 목표는 선충 C. elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 확산을 모니터링하고 프리온과 유사한 현상을 조사하는 방법을 설명하는 것입니다.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

여기 프로토콜은 사전에 감염된 수지상 세포 (DC)에서 transinfection 통해 항원 제시 동안 발생하는 CD4 + T 세포에 의해 세균 캡처를 측정하기 위해 제공됩니다. 일차 전지, DC, DC / T 세포 복합체 형성의 감염, 박테리아 T 세포 형질의 측정의 분리 : 우리는 필요한 단계를 수행하는 방법을 보여줍니다.

T 세포는 수지상 세포에서 Transinfection에 의해 박테리아를 캡처

여기서, 우리는 포자조이트 또는 2세대 메로조이트에 의한 닭에이메리아 기생충의 안정적인 형질변환을 달성할 수 있는 방법을 제공했다. 이종 항원 유전자를 발현하는 유전자 변형 에이메리안 기생충은 백신 전달 차량으로 사용될 수 있었다.

닭 에이메리아 기생충의 핵 과 생체 내 전파

이 프로토콜의 전반적인 목표는 중추 신경계에서 뮤린 성상 세포와 미세 글리아 세포를 추출, 유지 및 해리하는 방법을 지시하고 원생 동물 기생충에 감염하는 것입니다.

원생 동물 기생충 감염에 대 한 기본 성상 세포와 Microglia의 수반되는 격리

말라리아는 감염된 모기에 의한 Plasmodium의 sporozoite 단계 접종을 통해 전염됩니다. 형질전환 플라스모디움 은 말라리아의 생물학을 더 잘 이해할 수 있게 해주었고 말라리아 백신 개발 노력에 직접적으로 기여했습니다. 여기에서는 형질전환 Plasmodium berghei sporozoites를 생성하는 간소화된 방법론을 설명합니다.

유전자 변형 Plasmodium berghei Sporozoites 생성

이 프로토콜은 시험관 내 영양 영양 환자를 통과시키는 동안뿐만 아니라 encystment 및 excystment를 통해 유지되는 구조로 Naegleria gruberi trophozoites를 transfection하는 방법론을 설명합니다.

Naegleria gruberi rDNA의 분자 클론을 N. gruberi Trophozoites로 transfection

여기에서는 테트라사이클린 제어 기반 유도 합성 회로를 설계, 구축 및 전달하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 기생충 제거 및 사이토카인 발현에 대한 합성 회로의 영향은 제시된 파이프라인을 채널화하여 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 전염병의 합성 회로 기반 치료법을 연구하는 연구자와 관련이 있습니다.

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로)

배우세요 원생동물 숙주에서 세균을 수확하고 정량화하여 포유류 세포를 감염시키는 방법을 Legionella mala와 GFP 형광 표지를 활용하여 병원성 증가를 평가하는 기술입니다.

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

더 많은 동영상 탐색