대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 ER 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (TED)

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 세포의 소포체 내강에서 칼슘 역학을 직접 시각화하는 것입니다. 이는 세포를 표적 에스테라제 유도 염료 또는 TED 벡터 구조체로 transduction하여 소포체에서 carbox esterase CS 2를 과발현함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포는 원형질과 ER막을 통해 확산되는 아세토 메틸 에스테르 칼슘 지시약 독감 oh five NA와 함께 배양됩니다.

그런 다음 카르복실 에스테라아제가 절단됩니다. 에스테르기는 er에서 칼슘 민감성 지표를 방출합니다. 내강과 형광 칼슘 복합체가 형성됩니다.

살아있는 세포 이미징을 기반으로 응급실의 유리 칼슘 농도 변화를 보여주는 결과를 얻었습니다. 이 방법은 세포 칼슘 항상성 조절과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 칼슘 신호는 세포질에서 가장 자주 모니터링되므로 칼슘이 세포 외 공간에서 세포질로 유입되는지 아니면 세포 내 ER 칼슘 저장소에서 세포질로 유입되는지 쉽게 구별할 수 없습니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 당사는 표적 에스테라제 유도 다운로드를 개발했습니다. 이 방법을 사용하면 응급실에서 방출되는 칼슘을 직접 모니터링할 수 있습니다. 이 접근 방식은 중단되지 않습니다.

원형질막은 손상되지 않고 세포 내 신호 전달 cascades가 보존됩니다. 일반적으로 개인은 경험이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. TED Vector 발현에서 우리는 Carboxylase CES two에 융합된 cent 단백질을 발현하는 벡터 구조를 개발했습니다.

이를 통해 실험 중에 AR 칼슘 이미징에 적합한 세포를 쉽게 식별할 수 있으며, 이는 강한 적색 형광과 중등도에서 강한 칼슘 지표 형광만 특징으로 하는 세포입니다. 이 형광 표지는 소포체 전체에 고르게 분포되어야 하며 핵 영역에는 없어야 합니다. 시작하기 전에.

텍스트 프로토콜에 따라 인공 뇌척수액 또는 A CSF 및 독감 오 파이브 NAM을 준비합니다. A CSF를 실온으로 예열하고 포도당을 심부 포도당으로 추가하고 A CSF를 탄체로 5분 동안 폭기시킵니다. 그런 다음 염화칼슘과 염화마그네슘의 몰 스톡 용액 1개를 각각 2밀리몰의 최종 농도에 추가합니다.

라이브 이미징 현미경 및 컴퓨터 프로그램을 시작한 후 더미 이미징 챔버에서 풍성한 작업을 시작하고 튜브 시스템을 평형화하고 인라인 용액 히터와 이미징 챔버를 예열하고 현미경 스테이지에서 이미징 챔버를 예열하고 시스템을 섭씨 32도에서 37도로 평형을 이룹니다. 염료를 세포에 로드하기 위해 다운로드 절차를 시작하기 전에, 5 밀리몰라 독감 오 5 NAM의 0.5 마이크로리터 분취액 100 마이크로리터를 추가하고, 용액을 수조 초음파 처리에서 90초 동안 용해시키고 400 마이크로리터의 예열 이미징 용액을 4 또는 24 웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다. 동일한 웰에 D 용액을 추가하여 500마이크로리터의 5마이크로몰 용액을 생성합니다.

다음으로, 적절한 시간 동안 웰 배양기에 세포가 있는 커버 슬립을 조심스럽게 놓고 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 DI 로딩 시간 및 D 농도는 세포 유형, 세포 밀도 및 실험의 특정 요구 사항에 따라 다릅니다. 배양 시간이 길면 세포, 특히 일차 뉘앙스와 신경교세포에 해를 끼칠 수 있으며, 이는 생리적 자극에 대한 반응성에 매우 중요합니다. 30분 이상의 배양은 작은 마이크로 도메인(예: 척추의 MUE)에서 ER 칼슘의 분포를 조사하기 위한 ER 칼슘 국소화 실험에만 유용합니다. 배양 직후 커버 슬립을 이미징 솔루션이 포함된 다른 세포 배양 웰로 옮깁니다.

이미징 챔버에 셀을 장착할 준비를 하려면 페인트 브러시를 사용하여 이미징 챔버에 고진공 그리스를 바르십시오. 당사는 작은 부피로 10-12mm 커버 슬립을 위해 자체 제작한 이미징 챔버를 사용하여 분당 최대 15배의 버퍼 교환의 높은 관류 속도를 허용합니다. 독감 oh five 및 장전된 세포가 있는 커버 슬립을 집어 들고 젖은 상태를 유지하기 위해 이미징 용액을 작은 방울 떨어뜨립니다.

그런 다음 커버 슬립을 거꾸로 뒤집어 세포를 이미징 챔버에 장착합니다. 면봉을 사용하여 커버 슬립을 실리콘 접착제에 밀어 넣고 유리 커버 슬립 바닥의 잔여 버퍼를 닦아냅니다. 다음으로, 더미 이미징 챔버를 실험용 이미징 챔버와 교체합니다.

세포 선택을 위해 지속적인 관류로 5-10분 동안 세포를 세척합니다. 응급실에서 독감 5호와 칼슘 2의 빠른 광표백을 방지하기 위해 최소한의 레이저 조명을 사용하고, 2-4헤르츠의 높은 스캔 속도, 작은 이미지 크기 및 현미경에서 높은 이득을 설정합니다. 식물 실험에 따르면.

실험을 시작할 때 flu oh five 및 calcium label의 세포 분포와 red carbox cel esterase 구조체의 적색 형광 라벨을 문서화합니다. 여기에서 관심 세포에서 고해상도 X, YZ 이미지 스택에 의한 대표 뉴런은 XYT 이미징을 수행하여 특정 실험 조건에서 ER 칼슘 역학을 모니터링합니다. 본 시스템의 일반적인 설정은 텍스트 프로토콜의 표 2에 나열되어 있습니다: 이미징 용액을 사용한 연속 관류 하에서 ER 칼슘의 변화를 모니터링하고, 완충액 교환 비율은 세포 세척 및 저장 고갈을 위해 분당 1.5ml이며, 육종을 차단하여 고갈을 저장하고, TP 및 DHPG에 의한 자극을 위해 TP 및 DHPG와 대사성 글루타메이트 수용체에 대한 작용제입니다.

여기서 신경교세포는 10초 동안 200마이크로몰 A TP로 자극됩니다. 이미지를 처리하려면 멀티컬러 이미징을 위해 Image J 프로그램에서 이미지 스택을 엽니다. 소프트웨어에서 요청하면 RBG 채널을 분할합니다.

관심 영역을 식별합니다. 목적에 따라 전체 ER 또는 ER의 작은 영역 주위에 관심 영역을 그립니다. 시계열 분석기 플러그인을 사용하여 관심 영역의 평균 픽셀 강도를 읽습니다.

이 공식을 사용하여 F 0에 대한 델타 F에 의한 형광의 배경 보정된 상대적 변화를 계산합니다. 형광의 상대적 변화를 Y축에 대해 F 0에 대한 델타 F와 x축에 대한 시간을 가진 트레이스로 표시합니다. 이 그림에서 그는 A 세포 피질 성상 세포와 해마 뉴런은 적색 형광 TED 벡터를 발현하고 낮은 친화성 칼슘 지표로 표지됩니다.

독감 오 파이브 N.형광 칼슘 지시 복합체는 모든 세포 유형의 소포체에 국한되어 있습니다. 이 그림은 독감 oh five N 표지 신경교세포를 보여줍니다. CIN 처리 중 CIN 처리 전후에 세포의 원형질막이 손상된 경우 밝은 세포질 표지가 나타납니다.

이것은 독감 oh five N이 내인성 에스테라아제에 의해 세포질에서도 방출된다는 것을 보여줍니다. 이 실험에서 독감 oh five N er 칼슘 라벨링 후 배양 된 해마 뉴런의 고갈은 circa blocker cyclonic acid에 의해 발생합니다. 주목할 점은, 여기에서 관찰된 관심 영역당 평균 형광 밀도의 엄청난 변화는 TP로 자극된 마우스 코르티코 GL 세포의 타임 랩스 시리즈입니다. 형광이 갑자기 떨어졌다가 회복되어 ER 칼슘 방출 및 리필을 나타냅니다.동시에 적색 형광 단백질의 형광은 전부는 아니지만 일부 실험에서 시간 경과에 따른 형광 강도의 변화를 보여주는 슬레이트 표백 다이어그램의 결과로 약간 감소합니다.

형광 값은 초기 형광 강도 수준으로 돌아오지 않는데, 이는 일부 독감 oh five N 복합체가 자극 중에 손실되기 때문입니다. 이 동영상은 카르복실라아제, 2개의 감염된 BHK 21 세포를 고해상도로 독감 oh five N 칼슘 복합체로 표지하고 TP로 자극하는 것을 보여줍니다. TP 유도 칼슘 방출 및 ER 칼슘 저장 재충전은 ER 세뇨관의 미세 구조에서 시각화됩니다. 이 절차를 수행하는 동안 완벽하게 건강한 세포만이 생리학적 칼슘 반응을 보인다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

따라서 동일한 세포 배치로 하루에 일련의 상호 관련된 칼슘 항상성 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 5N의 염료 독감이 가장 효과적이지만 이 칼슘 지시약은 침투에 강하지 않습니다. 따라서 이 방법은 더 많은 표백제 저항성이 낮은 친화성 칼슘 지시약의 개발로 이점을 얻을 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 합성 저친화성 칼슘 지표로 E 칼슘 과도현상을 이미지화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이러한 지표를 사용하면 높은 시간 분해능으로 칼슘 역학을 모니터링할 수 있습니다. 이러한 이유로, 본 연구는 시냅스 가소성과 관련된 칼슘 신호 캐스케이드를 조사하고 신경퇴행성 질환에 대한 세포 모델에서 칼슘 항상성의 변화를 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다.