Name: 대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 ER 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (TED) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 학습하세요 생존 세포의 소포체 내 칼슘 역학을 형광 이미징으로 시각화하는 TED 방법을. 카르복실에스테라제를 이용한 이 기술은 세포 신호 전달 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1와 프리드리히 바우어 - 재단의 보조금에 의해 지원되었다. 우리 태그 - RFP-T2를 저희에게 제공하기 위해 캘리포니아 샌디에고 대학의 로저 Y. 첸 교수, 하워드 휴즈 의학 연구소의 연구소에 감사드립니다. 우리는 다행히도 우리에게 렌티 바이러스 플라스미드 FUGW를 제공하고 psPAX2/pMD2.G 데이비드 볼티모어, 캘리포니아 공과 대학교, 패서 디나, 그리고 디디에 Trono, 제네바, 제네바, 대학을 인정합니다.

<ol><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%3A+dynamics%2C+homeostasis+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+calcium+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local calcium signaling in neurons.</a> Neuron. 40, 331-346 (2003).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21, 13-26 (1998).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73, 862-885 (2012).</li>
<li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59, 861-872 (2008).</li>
<li>Jaepel, J., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+ER+calcium+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capturing ER calcium dynamics.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).</li>
<li>Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathophysiology+of+the+calcium+store+in+the+endoplasmic+reticulum+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons.</a> Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).</li>
<li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).</li>
<li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+Ca2%2B+from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li>
<li>Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On%2Foff-regulation+of+phospholipase+C-gamma+1-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Enzyme+Regulation%22%5BJournal%5D)">On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction.</a> Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channels+as+cellular+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRP channels as cellular sensors.</a> Nature. 426, 517-524 (2003).</li>
<li>Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIMulating+store-operated+Ca%282%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">STIMulating store-operated Ca(2+) entry.</a> Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).</li>
<li>Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+cellular+stress+through+STIM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sensing cellular stress through STIM proteins.</a> Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).</li>
<li>Erdmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61alpha+limits+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).</li>
<li>Schäuble, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP-mediated+closing+of+the+Sec61+channel+limits+Ca%282%2B%29+leakage+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER.</a> The EMBO Journal. , (2012).</li>
<li>Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum+as+an+integrator+of+multiple+dendritic+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist+%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%2C+neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).</li>
<li>Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+compartments+serve+multiple+hippocampal+dendritic+spines+from+a+widespread+rather+than+a+local+store+of+recycling+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).</li>
<li>Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+endoplasmic+reticulum+controls+metabotropic+signaling+and+plasticity+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).</li>
<li>Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+network+of+endoplasmic+reticulum+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J. Vis. Exp. (23), e1067(2009).</li>
<li>Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+calcium+imaging+combined+with+siRNA+mediated+gene+silencing+identifies+Ca%282%29%28%2B%29+leak+channels+in+the+ER+membrane+and+their+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms.</a> J. Vis. Exp. (53), e2730(2011).</li>
<li>Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+forward+to+seeing+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Looking forward to seeing calcium.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).</li>
<li>Mank, M., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators.</a> Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamic+changes+in+free+Ca2%2B+concentration+in+the+endoplasmic+reticulum+of+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells.</a> The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).</li>
<li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li>
<li>Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+shuttling+between+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+underlying+Ca2%2B+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations.</a> EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).</li>
<li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).</li>
<li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+in+situ+measurement+of+calcium+in+intracellular+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate-sensitive+stores+using+the+fluorescent+indicator+mag-fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).</li>
<li>Solovyova, N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+free+calcium+in+the+neuronal+endoplasmic+reticulum%3A+an+overview+of+modern+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches.</a> Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).</li>
<li>Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+dynamics+in+the+lumen+of+the+endoplasmic+reticulum+in+sensory+neurons%3A+direct+visualization+of+Ca%282%2B%29-induced+Ca%282%2B%29+release+triggered+by+physiological+Ca%282%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry.</a> The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).</li>
<li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).</li>
<li>Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+R+%22Calcium+imaging+of+intracellular+organelles%3A+endoplasmic+reticulum%22">Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum</a>. 43, Humana Press. (2010).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+photostability+of+bright+monomeric+orange+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5, 545-551 (2008).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zufferey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).</li>
<li>Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM+dyes+enter+via+a+store-operated+calcium+channel+and+modify+calcium+signaling+of+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).</li>
<li>Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+R+%22Calcium+measurement+methods%22">Calcium measurement methods</a>. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+esterase-ester+pair+for+targeting+small+molecules+with+cellular+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).</li>
<li>Samtleben, S., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+direct+ER+calcium+imaging+with+targeted-estersase+induced+dye+loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading.</a> , In preparation (2012).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

TED 방법의 장점과 단점은 최근의 출판물 34,35에서 광범위하게 논의되었다. 위에서 설명한 다른 방법에 비해, TED는 세포를 방해하고 관류의 문제를 우회. 또한, 두 가지 측면이 강조 될 필요가있다. ER 칼슘 이미징을위한 TED의 원리는 TED 벡터 구조의 도움과 낮은 친화력 합성 AM-에스테르 (2). 효율적이고 특혜 릴리스 ER 루멘의 활성 carboxylesterase (1). 대상으로 표현해야합니다 ER 루멘 칼슘 염료. 1. TED 벡터 생성 그림 3은 TED 벡터 구조의 발전을 요약 한 것입니다. TED는 CES 가족 단백질 (EC 3.1.1.1)에 기초하여 개발되었다. 이 단백질은 ER 루멘의 구성원 거주. 체외에서 들어 CES 단백질의 재조합 관리가 안정적으로 발현 한 후 가장 적합한 연구단백질이나 중간 발현 수준의 바이러스 감염 후. 현재, ...

ER의 생리적 칼슘 반응을 해결하기 위해, 우리는 ER로 합성 칼슘에 민감한 염료의 트래핑을 개선하기 위해 새로운 전략을 개발했다. 이 방법은 세포 외 칼슘의 면전에서 무료 ER 칼슘의 직접, 무중단 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다. ER 칼슘의 기능 및 신호 칼슘 신호는 다른 세포 유형, 예를 들면 근육 세포, 뉴런과 학습과 기억 1,2에서 시냅스 전달에 관여로 근육 수축을 중재에서 glial 세포와 그 기능 범위에 있습니다. 칼슘은 유전자 전사, 세포 증식, 신경 흥분, 세포 죽음 및 이벤트 1-7 신호를 다른 세포의 조절에 관여되어 있기 때문에 무료로 칼슘 농도의 변화는 높은 과학적 관심이다. 이러한 모든 세포 칼슘 신호는 기능적으로 연결되어 있고 칼슘을 세포 내에 기여하는매장 역학 8-10. 모든 칼슘 신호 사이의 일반적인 기능은 세포 공간과 칼슘의 흐름, 세포질 및 세포 소기관, 주로 ER 및 미토콘드리아이다. 이 서로 다른 신호 구성 요소에 의해 감지되는 이러한 세포 소기관 내 칼슘 농도의 동적 변경을 발생합니다. 일반적으로 100-800 μM 사이 ER 범위에서 칼슘 농도가 세포질에 칼슘 농도에 가까운 100 nm의, 그리고 세포 공간에 농도가 1 ~ 2 밀리미터 정도입니다. 따라서, 세포질 2,9,10으로 칼슘의 흐름에 대한 높은 화학 원동력이있다. 가장 일반적으로 조사 ER-파생 된 칼슘 신호는 포스 C (PLC)를 활성화 G-단백질 결합 수용체 (GPCR)의 자극에 따라 달라집니다. 차례 PLC는 이노시톨 1,4,5-trisphosphate (IP 3) 1을 생산하고 있습니다. 그 REC에 IP 3의 바인딩에 따라eptor이 (IP 3 녹화, 그림 1) ER 막에 칼슘 이온은 ER 루멘에서 해제됩니다. 역사적으로, ER에서 IP 3 매개 칼슘 방출은 처음 - 비록 간접적 - Streb 등으로 포상 췌장 세포에서 측정 된 1983 십일인치. 이 책은 처음으로 제안 아세틸 콜린, 포스 C 및 IP 3를 포함하는 신호 폭포. 칼슘 방출이 방법은 일반적으로 IP 3에 의한 칼슘 방출 (IiCR) (그림 1)이라고합니다. 수용체 tyrosin 키나제 링크 IP 3 높이 12 후 신호 ER의 칼슘 성장 인자와 신경 성장 인자의 작용에 의해 포스의 Cγ의 키나제에 의존 활성화. IiCR뿐만 아니라, 칼슘 상승은 ryanodine 재에 의해 전압 게이트 칼슘 채널 (칼슘 V), 및 후속 칼슘에 의한 칼슘 방출 (CiCR)를 통해 예를 들어, ionotropic 칼슘 항목에 의해 중재 될 수있다ceptors (RYR). IiCR 및 CiCR은 생리 학적으로 매장 운영 칼슘 항목 (SOCE)에 연결되어 있습니다. SOCE는 ER의 칼슘 릴리스에 대한 센서 STIM (기질의 상호 작용 분자)의 활동을 포함한다. STIM은 일시적인 수용체 잠재적 인 채널 (Trp의) 13 Orai 칼슘 채널 14도 전압 게이트 칼슘 채널 15 (그림 1)를 통해 세포 칼슘 항목을 자극하기 위해 표시되었습니다. ER 칼슘의 손실은 동적 적극적으로 펌프 칼슘 다시 ER로 사코 - 소포체 칼슘 ATPase의 (SERCA)의 작용에 의해 구출된다. 같은 쌥시 가르 긴 등의 약물 SERCA를 차단하면 세포질 구획 ER 칼슘의 지속적인 손실을 발표했다. 이 ER 칼슘 &quot;누수&quot;은 Sec61 단백질 복합체 16,17 (그림 1) 응급실 intramembrane 기공 복합체에 의해 발생합니다. 1998 년 Berridge는 모델, &quot;신경 세포 모델에서 신경&quot;, 어느 것이를 발표H는 신경 세포의 칼슘는 5 통합에서 ER의 원리 생리적 역할을 제안합니다. 이 모델은 신경 세포막 5의 세포 내 &quot;이미지&quot;를 형성하는 연속 ER 막 시스템의 존재를 고려합니다. 이 바이너리 진핵 세포 멤브레인 시스템은 뉴런 빠르고 느린 칼슘 신호의 시간적 및 공간적 통합을위한 기본 전제 조건으로 주장했다. 같은 신경 세포의 다른 쪽이 나 돌기의 병용 또는 이후에 하나 발생할 칼슘 신호는 세포의 세포체 또는 그들이 5-18을 표현하는 ER을 통해 핵을 수여한다. 그런 다음, 그 합은 신호 폭포의 유전자 전사 또는 통합의 신경 규제의 흥분에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, ER 칼슘 신호의 통합을 지원합니다. 이 개념에 대한 하나의 전제 조건은 여러 연구에 의해 주장되었으며 적어도 somato-D에 대한 입증 된 어느 하나의 세포에서 ER의 연속성이다endritic 지역과 가까운 거리에 축삭 돌기 19-21. 긴 축삭 돌기에서 ER 연속성이 있는지 여부는 논쟁의 문제입니다. ER 막에 무료로 칼슘의 흐름을 측정하는 전략 칼슘 신호는 가장 자주 세포질 22,23으로 모니터링됩니다. 따라서, 그것은 쉽게 칼슘 2 + 세포에서 또는 6,24 세포 내 상점에서 세포질로 유입 여부를 구별 할 수 없습니다. 이 제한을 극복하기 위해, 직접 ER의 칼슘 이미징을위한 방법 론적 전략이 개발되었다. 요약하면, 다음과 같은 전략이 사용됩니다. (1) 유전자 조작 단백질 지표 25-27 단백질 기반의 낮은 친화력 칼슘 2 + 지표 칼슘 감지 단백질과 결합 된 발광 단백질 aequorin 또는 GFP를 사용하여 ER-대상. 이러한 유전자 조작 칼슘 2 + 지표 (GECIs)는 수신호 펩타이드의 도움으로 응급실을 대상으로 적극적으로 보존 및 검색 모티브를 사용하여 ER에 보관됩니다. 카멜레온 분할 YC7.3ER 29, 그리고 카멜레온의 D1 30, 그리고 카멜레온 원리에 대한 일반적인 ER 칼슘 2 + 지표베이스는 카멜레온 YC4.3 26,28입니다. AM-에스테르 낮은 친화력 칼슘 2 (2) 직접 에스테르 가수 분해 효소 기반의 염료 로딩 + 지표 31,32가. 표시기 염료 (크기 - Fura2-AM, 매기 - Fluo4-AM 또는 Fluo5N-AM) 파생 오전을 통과 친 유성, 칼슘 구분 상태에서 생체막. 그런 다음, 세포질뿐 아니라 ER에서, 내생 에스 테라 AM-에스테르 그룹의 다니엘과 세포질에 적극적으로 염료의 일정 금액 뒤에와 ER에두고, 칼슘 2 + 표시를 놓습니다. 세포질 칼슘 농도가 잘 드 아래에 남아 그러므로,이 방법은 오래 ER에서 높은 칼슘 농도 조건에서 유용하다특히 특징적인 칼슘 신호 (낮은 μM로 예를 들면 NM) 동안 낮은 선호도 지표의 방호 한계. 플라즈마 멤브레인 permeabilization 32와 함께 (3) AM-에스테르 로딩. 모든 나머지 세포질 칼슘 2 + 표시는 인공 세포 버퍼에 &quot;중성&quot;세제 (예 : 사포닌)의 소량의 플라즈마 멤브레인 permeabilization에 의해 제거됩니다. 따라서, 세포 세포막에 직접 세포막의 &quot;구멍&quot;을 통해 세포 버퍼에 IP 3에 예를 들어, 자극 할 수있다. (4) 칼슘의 전체 셀 구성 및 동시 측정에 따라 세포질의 투석 + ER 루멘 및 세포질 32,33 인치 세포가 먼저 낮은 친화력 칼슘 2 + 지표 (예를 들어 크기 - Fura2 - 함께로드됩니다 AM), 비례 UV 빛. 그 후, 패치 피펫, 남아있는 CYT의 도움으로osolic 낮은 친화력 칼슘 2 + 지표는 높은 친화력 칼슘 2 + 지표 (예를 들면 플루오-3, 가시 광선)를 포함하는 버퍼 세포질에서 dialysed 있습니다. 이 전략은 세포질과 ER 유도 신호의 동시 녹음을 할 수 있습니다. (5) 대상 - 에스테르 가수 분해 효소에 의한 염료 로딩 8,34. Carboxylesterase은 (CES) ER의 내강을 대상으로 낮은 친화력 칼슘 2 + 지표 AM-에스테르 형태로 효율적으로 트래핑 높은 에스테르 가수 분해 효소 활동을 제공합니다. 대상 - 에스테르 가수 분해 효소 유도 염료로드 (TED) ER 루멘 낮은 친화력 칼슘 2 + 지표를 대상으로 개선하기 위해 TED가 개발되었다. TED는 식 구조를 통해 달성된다 ER 대상 마우스 carboxylesterase (CES2) (그림 2)의 발현을 필요로한다. 재조합 CES-구조를 표현 세포에서 칼슘의 AM-에스테르 양식을 배양하는식일 염료 (Fluo5N-AM, 그림 2). 그런 다음, ER에서, 염료 칼슘 2로 변환 + 민감한 막 투과성 칼슘 따라서 ER 루멘 8 높은 농도에서 염료를 트래핑 높은 에스테르 가수 분해 효소 활동에 의해 + 표시 복잡 (Fluo5N/Ca 2 +), 34. 방법은 SERCA 17의 봉쇄 한 후 예를 들어 직접 &quot;누설 채널&quot;을 통해 대사성, 퓨린 또는 글루타민산 염 수용체 8,34를 통해 인스턴스에 대한 IiCR - 경로를 통해 ER 칼슘 방출을 조사하고, ER의 칼슘 고갈을 시각화하는 것이 특히 유용합니다 34. 우리의 경험에 낮은 친화력 칼슘 2 + 지표 Fluo5N-AM 현재 TED 염료로드 전략을 사용하는 가장 좋은 가능한 지표입니다. Fluo5N-AM은 칼슘 2 +에 대한 낮은 친화력이 (해리 상수 K D ~ 90 μM, 그림 2), 거의 비 형광의 AM-형태이지만, calciu에 높은 형광 방출을 제공합니다M 바인딩 8,34. Fluo5N/Ca 2 + 단지는 같은 FITC, 알렉사 488, 또는 EGFP와 같은 표준 염료에 해당 ~ 490 ㎚의 표준 광원으로 흥분 할 수 있습니다. 세포질 칼슘 신호는 거의 낮은 μM 범위에서 농도에 도달하지 않으므로 거의 세포질 35 Fluo5N에 의해 감지됩니다. TED의 성능을 향상시키기 위해 몇 가지 재조합 벡터의 구조는 (그림 3)을 개발 하였다. 원래 CES2의 코딩 서열 (Refseq의 기탁 번호 NM_145603, CES2c)과 최고의 TED의 성능에 따라 TED 벡터는 CES의 구조를 안정적으로 발현으로 관찰된다. 새로운 TED 벡터는 빨간색 형광 단백질 TagRFP-T2 36 융합 CES2의 핵심 요소를 표현한다. 이러한 벡터들은 세포를 형질 확인하고 Fluo5N/Ca 2의 변화의 정상화를위한 내부 통제로 적색 형광을 사용하는 데 사용할 수 있다는 장점을 가지고 + 형광. 빨간색 형광은 자극 조건 하에서 ER과 ER 역학의 변화의 구조적 분포를 시각화 할 수있는 가능성을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>(S)-3,5-DHPG (디하이드록시페닐글리신)</td><td>토크리스</td><td>0805</td><td></td></tr><tr><td>5';-ATP-Na2, ATP 디소듐 염 수화물</td><td>시그마</td><td>A26209-1G</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제,50x</td><td>인비트로젠</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>카르바모일콜린 클로라이드 (차르바콜)</td><td>시그마</td><td>C4382-1g</td><td></td></tr><tr><td>시클로피아존산 (CPA)</td><td>어센트 사이언티픽</td><td>Asc-300</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with Glutamax</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu; g</td><td>Invitrogen</td><td>F14204</td><td></td></tr><tr><td>글루타메이트</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12 영양소 혼합물</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21765-029</td><td></td></tr><tr><td>Hank's BSS(1x) without Ca, without Mg, with Phenol Red, HBSS</td><td>PAA Laboratories</td><td>H15-010</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>SHD3250YK</td><td>Linearis</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin Ca2+ salt</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-116</td><td></td></tr><tr><td>murine EGF </td><td>PreproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement 100x</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127, low UV absorbance,2g</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Poly-DL-Ornithine hydrobromide PORN</td><td>Sigma</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysin</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005-1mg</td><td></td></tr><tr><td>TryLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Glycine</td> MAX (대두)의 Worthington <td>LS-003707</td><td></td></tr><tr><td>트립신 억제제</td> <td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81</td><td>Olympus</td><td></td><td>user-specific configuration</td></tr><tr><td>Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)</td><td>Olympus</td><td></td><td>사용자별 구성</td></tr><tr><td>컨포칼 시스템: 스펙트럼 검출기가 있는 스캔 헤드 FV10-SPD</td><td>Olympus</td><td></td><td>사용자별 구성</td></tr><tr><td>히터 컨트롤러 TC-344B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0101</td><td>을 제어하여 인라인 솔루션 히터</td></tr><tr><td>NIH ImageJ 소프트웨어</td><td>WS Rasband, ImageJ, 미국 국립보건원(National Institutes of Health), <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>목표: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td><td>올림푸스</td><td>N2709100</td><td></td></tr><tr><td>목표: UPLFLN40XO</td><td>올림푸스</td><td>N1478700</td><td></td></tr><tr><td>대물렌즈: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td><td>올림푸스</td><td>N1480700</td><td></td></tr><tr><td>관류 챔버, 역</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>관류 챔버, RC-49FS</td><td>Warner Instruments</td><td>W4 64-1709</td><td></td></tr><tr><td>관류 튜브 : PT-49</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1730</td><td>관류</td></tr><tr><td>용 연동 펌프 MiniPlus 3 (4 채널)</td> <td>Gilson</td><td>n.a.</td> <td>관류 펌프</td></tr><tr><td>단일 인라인 용액 히터 SH-27B</td><td>히터</td><td>컨트롤러로 제어</td>되는 Warner Instruments <td>64-0102</td></tr><tr><td>흡입관: ST3R</td> 관<td>류용</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1407</td></tr><tr><td>가열 인서트: Tempocontrol 37-2 디지털 2채널</td><td>Pecon</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 er 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (ted)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

칼슘 역학의 시각화 세포 생리학에서 칼슘의 역할을 이해하는 것이 중요합니다. 칼슘 역학을 조사하기 위해, 합성 형광 칼슘 2 +의 indictors가 인기를 끌고있다. 여기에 우리가 TED (= 대상 - 에스테르 가수 분해 효소 유도 염료로드), 칼슘의 방출을 개선하는 방법을 보여 + 다른 세포 유형의 ER 루멘의 표시기 염료. 지금까지 TED는 세포 라인, glial 세포 및 생체 뉴런에 사용되었다. 벡터 구조를 사용하여 ER 루멘에 높은 carboxylesterase 활동의 대상으로 효율적인 재조합에 TED 기지가 표현 Carboxylesterases (CES). 최근 TED 벡터 따라서 동시에 두 색 이미징을 가능하게 빨간색 형광 단백질에 융합 CES2의 핵심 요소가 포함되어 있습니다. 해당 ER 구조가 빨간색으로 표시되는 동안 ER 무료 칼슘의 역학은 하나의 색상에서 몇 군데 있습니다. 프로 시저의 시작 부분에서, 세포 렌티 바이러스로 형질 있습니다. 그 후, 감염된 세포다시 마지막 라이브 셀 이미징을 사용하는 coverslips를에 놓는. 그런 다음, 살아있는 세포가 아세 톡시 메틸 에스테르 (AM-에스테르) 낮은 친화력 칼슘의 형태로 배양하는 + 지표, 예를 들어 Fluo5N-AM, 매기 - Fluo4-AM, 또는 매기 - Fura2-AM. 칼슘 2 + 지표 및 친수성 형광 염료 / CA 2 + 복합 AM 양식에서 소수성 측쇄 오프 응급실 클리브의 에스테르 가수 분해 효소 활동이 형성된 ER 루멘에 갇혀있다. 염료로드 후, 세포는 거꾸로 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경에서 분석됩니다. 세포는 지속적으로 벨소리와 같은 솔루션을 관류와 ER의 칼슘 역학 시간 경과 영상으로 직접 시각화 수 있습니다. ER의 칼슘 저장소의 보충이 형광 강도의 증가를 생산하는 반면, ER에서 칼슘 방출은 관심 영역에서 형광 강도의 감소에 의해 식별됩니다. 마지막으로, 시간이 지남에 따라 형광 강도의 변화는 ΔF / F 0의 계산에 의해 결정됩니다.

이 프로토콜은 무료 ER 칼슘의 직접 이미징을위한 무중단 방식을 제공합니다. 낮은 친화력 합성 칼슘 2 + 지표 발표하고 대상 ER의 도움으로 재조합 에스테르 가수 분해 효소 효소의 활동과 ER 루멘에 갇혀있다. ER 루멘 칼슘 2 + 지표 염료의 향상된로드는 ER의 칼슘 저장소 역학의 직접적이고 빠른 영상을 가능하게합니다. TED에 대한 세포 유형 방법의 타당성은 셀 라인 BHK21, HEK293 34, 헬라 17, SH-SY5Y 배양 성상 8,40 및 기본 해마와 대뇌 피질의 뉴런 8,34,41에 표시되어 있습니다. 우리의 실험에서, TED는 상대적으로 약한 발기인 (예를 들어 유비퀴틴 프로모터) 35를 사용하여 자체 운영을 중지 렌티 바이러스 벡터 37,39에</s...

대상 - 에스테르 가수 분해 효소 유도 염료로드 (TED)는 형광 이미징에 의해 세포 내 칼슘 저장소 역학의 분석을 지원합니다. 방법은 합성 낮은 친화력 CA의 로컬 폭로을 향상 소포체 (ER)로 재조합 Carboxylesterase의 대상에 기지<sup&gt; 2 +</supER 루멘&gt;에 표시 염료.

대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 ER 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 세포의 소포체 루멘 내에서 칼슘 역학을 직접 시각화하는 것입니다. 이는 세포에 targeted esterase induced dye(TED) 벡터 구조물을 형질전환하여 소포체 내에서 carbox esterase CS2를 과발현시킴으로써 달성됩니다. 그 다음, 세포를 아세토 메틸 에스테르 칼슘 지시약인 fluo-5 NAc와 함께 배양하며, 이 지시약은 세포막과 소포체 막을 통해 확산됩니다.그 후 카르복실 에스테라제(carboxyl esterase)가 이를 분해합니다. 에스테르기가 소포체(er) 내강의 칼슘 민감성 지표를 방출시키고, 형광 칼슘 복합체가 형성됩니다.생세포 이미징을 통해 소포체(ER) 내 유리 칼슘 농도의 변화를 보여주는 결과가 도출되었습니다. 이 방법은 세포 내 칼슘 항상성 조절에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 칼슘 신호는 주로 세포질에서 모니터링되므로, 칼슘이 세포 외 공간에서 세포질로 유입되는지 아니면 세포 내 소포체 칼슘 저장고에서 유입되는지를 쉽게 구별할 수 없습니다.이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 표적 에스테라제 유도 다운로딩(targeted esterase induced downloading) 방법을 개발했습니다. 이 방법을 통해 소포체(ER)에서 방출되는 칼슘을 직접적으로 모니터링할 수 있습니다. 이 접근 방식은 비파괴적입니다.세포막은 온전하게 유지되며 세포 내 신호 전달 폭포는 보존됩니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 경험이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. TED Vector 발현에서, 우리는 Carboxylase CES two에 융합된 cent 단백질을 발현하는 벡터 구조물을 개발했습니다.이를 통해 실험 중 AR 칼슘 이미징에 적합한 세포를 쉽게 식별할 수 있으며, 이러한 세포는 강한 적색 형광과 중간에서 강한 수준의 칼슘 지표 형광이 나타나는 것이 특징입니다. 이 형광 표지는 소포체 전체에 고르게 분포되어 있어야 하며 핵 영역에는 없어야 합니다. 시작하기 전에.텍스트 프로토콜에 따라 인공 뇌척수액(A CSF)과 Fluoh5-NAM을 준비합니다. A CSF를 실온으로 예열하고 포도당을 첨가한 후, carbogen으로 5분 동안 에어레이션합니다. 그 다음, 염화칼슘과 염화마그네슘의 1 M 스톡 솔루션을 최종 농도가 각각 2 mM이 되도록 첨가합니다.라이브 이미징 현미경과 컴퓨터 프로그램을 시작한 후, 더미 이미징 챔버에서 관류를 시작하여 튜브 시스템을 평형화하십시오. 인라인 용액 가열기와 현미경 스테이지 위의 이미징 챔버를 예열하고, 시스템을 32 to 37 °C로 평형화하십시오. 세포에 염료를 로딩하기 위한 다운로딩 절차를 시작하기 전에, 예열된 A CSF 100 µL를 5 mM fluo-5 NAM 0.5 µL 분주액 1개에 첨가하고, 워터배스에서 용액을 가용화한 후 90초 동안 초음파 처리하십시오. 예열된 이미징 용액 400 µL를 4-well 또는 24-well 플레이트의 웰 하나에 옮기십시오. 해당 웰에 D 용액을 첨가하여 5 µM 용액 500 µL를 제조하십시오.다음으로, 세포가 부착된 커버슬립을 웰에 조심스럽게 넣고 37 °C의 세포 배양 인큐베이터에서 적절한 시간 동안 배양합니다. 로딩 시간과 D 농도는 세포 유형, 세포 밀도 및 실험의 특정 요구 사항에 따라 달라집니다. 배양 시간이 길어지면 세포, 특히 일차 뉴런 및 글리아 세포에 손상을 줄 수 있으며, 이는 생리적 자극에 대한 반응성에 결정적인 영향을 미칩니다. 30분 이상의 배양은 스파인(spine)의 MUEs와 같은 작은 마이크로 도메인 내 ER 칼슘 분포를 조사하기 위한 ER 칼슘 국소화 실험에만 유용합니다. 배양이 끝난 직후, 커버슬립을 이미징 솔루션이 들어 있는 다른 세포 배양 웰로 옮깁니다.이미징 챔버에 세포를 마운팅하기 위해, 페인트 브러시를 사용하여 이미징 챔버에 고진공 그리스를 도포합니다. 저희는 소량의 부피를 갖는 10~12mm 커버슬립용 자체 제작 이미징 챔버를 사용하여, 분당 최대 15배의 버퍼 교환이라는 높은 관류 속도를 구현합니다. Flu oh five와 로딩된 세포가 있는 커버슬립을 집어 올린 후, 습윤 상태를 유지하기 위해 이미징 솔루션을 한 방울 떨어뜨립니다.그런 다음 커버슬립을 뒤집어 세포를 이미징 챔버에 장착합니다. 면봉을 사용하여 커버슬립을 실리콘 접착제에 누르고, 유리 커버슬립 바닥에 남은 잔류 버퍼를 닦아냅니다. 다음으로, 더미 이미징 챔버를 실험용 이미징 챔버로 교체합니다.세포 선택을 위해 연속 관류를 통해 5분에서 10분 동안 세포를 세척합니다. flu oh five 및 ER 내 calcium two의 급격한 광퇴색을 방지하기 위해 레이저 조사량을 최소화하고, 현미경 설정에서 2~4 Hz의 높은 스캔 속도, 작은 이미지 크기 및 높은 게인을 사용하십시오. 이는 식물 실험 조건에 따릅니다.실험 시작 시, flu oh five 및 칼슘 표지와 red carbox cel esterase 컨스트럭트의 적색 형광 표지의 세포 내 분포를 기록하십시오. 관심 세포의 대표적인 뉴런을 고해상도 X, YZ 이미지 스택으로 촬영하여, 특정 실험 조건 하에서 ER 칼슘 역동성을 모니터링하기 위해 XYT 이미징을 수행하십시오. 시스템의 일반적인 설정은 텍스트 프로토콜의 표 2에 나열되어 있습니다. 이미징 솔루션으로 지속적으로 관류하며 ER 칼슘의 변화를 모니터링하십시오. 버퍼 교체 속도는 세포 세척 및 sarco endoplasmic reticulum calcium two ATPase 차단을 통한 저장고 고갈 시 1.5 milliliter per minute이며, ATP 및 metabotropic glutamate receptor의 작용제인 DHPG로 자극할 때는 3 milliliters per minute입니다.여기서는 200 µM ATP로 10초 동안 글리아 세포를 자극합니다. 이미지를 처리하려면 다색 이미징용 Image J 프로그램에서 이미지 스택을 엽니다. 소프트웨어의 요청에 따라 RGB 채널을 분리하십시오.관심 영역(ROI)을 지정합니다. 목적에 따라 소포체(ER) 전체 또는 소포체의 일부 작은 영역 주변으로 관심 영역을 설정합니다. time series analyzer 플러그인을 사용하여 관심 영역 내의 평균 픽셀 강도를 측정합니다.이 공식을 사용하여 F zero 대비 delta F로 배경 보정된 형광 상대 변화량을 계산하십시오. 형광 상대 변화량을 Y축은 delta F over F zero, X축은 시간으로 하는 트레이스로 나타내십시오. 이 그림에서, A 세포인 피질 성상교세포와 해마 뉴런은 적색 형광 TED 벡터를 발현하며 저친화성 칼슘 지시약으로 표지되었습니다.Fluo-5N. 형광 칼슘 지시약 복합체는 모든 세포 유형의 소포체에 국소화됩니다. 이 그림은 Fluo-5N으로 표지된 글리아 세포를 보여줍니다. CIN 처리 과정 중, CIN 처리 전후에 세포의 세포막이 손상된 경우 밝은 세포질 표지가 관찰됩니다.이는 Fluo-5N이 내인성 에스테라아제(endogenous esterases)에 의해 세포질로도 방출됨을 보여줍니다. 이 실험에서는 Fluo-5N으로 TED 라벨링을 수행한 후, CIRCA 차단제인 cyclonic acid를 사용하여 배양된 해마 뉴런의 ER 칼슘 고갈을 유도합니다. 여기서 관찰되는 관심 영역(ROI)당 평균 형광 밀도의 엄청난 변화에 주목하십시오. 여기에는 ATP로 자극된 마우스 cortico GL 세포의 타임랩스 시리즈가 표시되어 있습니다. 형광이 갑자기 감소했다가 회복되는 것은 ER 칼슘의 방출과 재충전을 나타냅니다. 동시에, 광퇴색(photobleaching)의 결과로 적색 형광 단백질의 형광이 약간 감소합니다. 일부 실험(전체는 아님)에서 시간에 따른 형광 강도의 변화를 보여주는 도표가 제시됩니다.일부 flu oh five N 복합체가 자극 과정 중에 손실되기 때문에 형광 값은 초기 형광 강도 수준으로 돌아가지 않습니다. 이 영상은 flu oh five N 칼슘 복합체로 표지하고 ATP로 자극한 carboxylase two 감염 BHK 21 세포를 고해상도로 보여줍니다. ATP로 유도된 칼슘 방출과 ER 칼슘 저장고의 재충전이 ER 세관의 미세 구조에서 시각화됨에 유의하십시오. 이 절차를 수행할 때, 완전히 건강한 세포만이 생리적 칼슘 반응을 보인다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.따라서 동일한 세포 배치를 사용하여 하루에 일련의 상호 연관된 칼슘 항상성 실험을 수행할 것을 권장합니다. 저희의 경험에 따르면, Fluo-5N 염료가 가장 효과적이지만, 이 칼슘 지표는 광퇴색에 매우 취약합니다. 그러므로 본 방법은 광퇴색에 더 강한 저친화성 칼슘 지표의 개발을 통해 더욱 개선될 수 있을 것입니다.이 영상을 시청한 후, 합성 저친화성 칼슘 지시자를 사용하여 세포 외 칼슘 일시적 변화(calcium transient)를 이미지화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 지시자를 사용하면 높은 시간 해상도로 세포 외 칼슘 역동성을 모니터링할 수 있습니다. 따라서 본 방법은 시냅스 가소성에 관여하는 칼슘 신호 전달 경로 연구 및 신경퇴행성 질환의 세포 모델에서 칼슘 항상성 변화를 모니터링하는 데 유용할 수 있습니다.

direct-imaging-er-calcium-with-targeted-esterase-induced-dye-loading

Research

연구

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Biology

생물학

endoplasmic reticulum은 단백질 biogenesis과 칼슘 항상성에 중요한 역할을합니다. 우리는 우리 Ca2 + 누출 채널의 역할을 주소로하고 putative 규제 메커니즘을 특징 수있는 실험적인 체제를 구축했습니다. 이 시스템은 siRNA 중재 유전자 입을 라이브 세포 Ca2 + 이미징을 포함한다.

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다 2 + ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

이 문서의 목적은 디지털 immunofluorescent 현미경을 사용하여 쥐 pial 동맥 조각에 에스 트로겐 수용체 - α의 immunofluorescent 감지 (ERα)를 최적화하는 방법을 설명하는 것입니다.

디지털 Immunofluorescent 현미경을 사용하여 쥐 Pial Arterioles에서 에스 트로겐 수용체 - α의 영상

의 연결을 네트워크를 개발 자발적인 활동은 칼슘에 민감한 지표 염료의 AM - 에스테르 양식을 사용하여 측정할 수 있습니다. 의 연결을 활성화를 나타내는 세포 내 칼슘의 변화는 하나 또는 두 개의 광자 이미징과 형광 표시기에 일시적 변화로 감지됩니다. 이 프로토콜은 발달 종속의 연결 네트워크의 범위에 대해 적용할 수...

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

여기에서는 Ca2+ 지표가 로드된 온전한 포유류 세포에서 형광 현미경을 사용하여 로컬 IP3 매개 Ca2+ 이벤트를 이미징하는 기술과 이러한 이벤트의 식별 및 분석을 자동화하는 알고리즘을 제시합니다.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

소포체 칼슘 항상성은 다양한 병리학에서 파괴됩니다.  분비된 ER 칼슘 모니터링 단백질(SERCaMP) 리포터를 사용하여 ER 칼슘 저장소의 중단을 감지할 수 있습니다.   이 프로토콜은 가우시아 루시페라아제 SERCaMP를 사용하여 ER 칼슘 항상성을 in vitro 및 in vivo에서 검사하는 방법을 설명합니다.

사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링<em&gt; Gaussia</em&gt; 루시 페라 제 SERCaMP

우리는 실시간 형광 현미경을 사용하여 HEK293 및 골격근 C2C12 세포의 소포체 / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)에서 빠른 칼슘 과도 현상을 모니터링하기위한 우리의 표적 유전자 코딩 칼슘 지시약 (GECI) CatchER +의 적용 을위한 프로토콜을 제시합니다. 현장 K d 측정 및 교정을위한 프로토콜도 논의됩니다.

표적화 된 Ca를 이용한 ER / SR 칼슘 방출 모니터링<sup&gt; 2+</sup&gt; 센서 캐쳐<sup&gt; +</sup

여기 이미지 칼슘 murine neuromuscular 접속점에 개별 셀 종류의 인구에 있는 신호 프로토콜 선물이.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

여기 우리는 캘리포니아2 + 이미징 신경 그리고 glial 세포, 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 해 부를 수 있게 하는 프로토콜을 제시. 이 프로세스는 유전자 인코딩된 Ca2 + 지표의 식을 허용 하는 모든 셀 형식에 적용 됩니다.

로컬 Ca2 + 신호 막 대상 Ca2 + 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

이 프로토콜은 마취마우스에 있는 가까운 혈관에서 백혈구 및 혈류 데이터를 심신하는 두뇌에서 형광 칼슘 심상을 취득하고 분석하는 단계를 제시합니다. 이러한 기술은 벽화 세포 생리학의 연구에 유용하며 모든 세포 유형의 칼슘 과도를 조사하기 위해 적응 할 수 있습니다.

생체 내 트랜스제닉 마우스의 뇌 성 구체 칼슘 및 혈역학 이미징

본 프로토콜은 고처리량 약물 스크리닝 및 독성 테스트를 위해 iPSC 유래 심근세포(iPSC-CM)에서 유발된 세포 활성의 전광학 제어 및 관찰을 설명합니다. 시간과 공간에서의 표현형 패턴의 다중 모수적 정량화가 도시된다. 몇 시간에 걸친 약물의 장기적인 효과 또는 며칠에 걸친 순차적 측정이 입증되었습니다.

독성 테스트 및 표현형 약물 스크리닝을 위해 iPSC 유래 심근 세포에서 칼슘 신호를 고처리량 광학 제어 및 기록

학습하세요 생존 세포의 소포체 내 칼슘 역학을 형광 이미징으로 시각화하는 TED 방법을. 카르복실에스테라제를 이용한 이 기술은 세포 신호 전달 연구에 필수적인 도구입니다.

대상 - 에스테르 가수 분해 효소와 ER 칼슘의 직접 이미징 유발 염료 로딩 (TED)

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