라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 혈관 질환 중 활성화된 내피에서 혈소판과 호중구 사이의 유형적 상호 작용을 시각화하는 것입니다. 이는 살아있는 쥐의 실시간 형광 생체 현미경 검사법을 통해 크레마스터 근육 내의 미세혈관 구조를 시각화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 형광 표지된 항체를 주입하고 염증 또는 손상을 시작하여 생성된 유형 혈소판 호중구 상호 작용의 직접적인 시각화를 용이하게 합니다.

다음으로, 세포의 수와 역학을 정량화하기 위해 저장된 데이터를 분석합니다. 궁극적으로, 활성화된 내피에서 혈소판과 호중구 사이의 직접적인 유형적 상호 작용은 실시간 생체 내 현미경 검사에서 주입된 항체의 형광 신호를 기반으로 평가할 수 있습니다. 당사의 생체 내 현미경 기술은 혈관 염증 및 혈전 형성 중 활성화된 내피에서 혈소판과 호중구 간의 실시간 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 기술은 암세포와 혈액 세포의 상호 작용 평가와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 혈관 염증 모델에 대한 현미경 시스템을 켭니다. 마취제의 IP 주입 3 시간 전에 TNF 알파를 미러링하는 intra growly 주사.

발가락으로 진정이 확인되면 PE 90 튜브를 쥐의 기관에 캐뉼로 삽입하여 호흡 곤란을 제거합니다. 다음으로, PE 10 튜브를 왼쪽 경정맥에 캐뉼레이션하여 형광 표지된 항체와 추가 마취제를 주입합니다. 그런 다음 음낭 피부를 부드럽게 당겨 수평으로 절개하고 수술 부위에 예열 완충제를 사용합니다.

이제 한 집게로 하복부를 누르고 다른 집게로 고환을 조심스럽게 빼내면 자동차가 근육을 수직으로 마스터하고 주변 조직을 트레이에 고정하여 바이알 내 현미경 트레이의 유리 커버 슬립 위로 근육을 평평하게 만듭니다. 먼저 이전에 설정된 경정맥 캐뉼라를 통해 DITE 4 88 conjugated rat, anti mouse CD 42 C 및 Alexa floor 6 47 conjugated anti mouse GR one 항체를 주입하여 이 단계를 시작합니다. 그런 다음 현미경의 필터 세트에서 노출될 채널의 확인란을 선택하고 선택한 각 타임랩스 캡처에 대한 노출 시간을 설정합니다.

경과 시간 5분에 대해 200밀리초 간격으로 시간 포인트 수를 1000에서 1500으로 설정합니다. 이미지 캡처에서 모든 매개 변수가 설정되면 시작을 선택하여 157마이크로미터 x 118마이크로미터 창을 사용하여 60배 배율로 캡처 캡처를 시작합니다. 염증이 있는 cremaster 장소의 위쪽 절반에서 5분 동안 호중구로 들어가는 지배 및 부착 혈소판을 모니터링합니다.

혈소판 혈전 형성을 분석하려면 mask(마스크)로 이동하여 create(생성)를 선택합니다. 그런 다음 기본 보기의 선택 윤곽 도구 아래에서 큰 연필 아이콘을 클릭합니다. 연필을 사용하여 기본 보기에서 용기 외부의 영역을 색칠합니다.

배경 마스크를 설정하려면 마스크로 이동하여 이 평면 복사를 클릭하고 마스크 복사를 클릭합니다. 현재 시점에서 모든 시점을 선택하고 확인을 클릭합니다. 배경 신호를 계산하려면 통계량으로 이동하여 마스크 통계량을 클릭하십시오.

그런 다음 이미지 범위에서 현재 2D 타임랩스를 클릭하거나 마스크 범위에서 4개의 D 이미지를 클릭하고 피처에서 전체 마스크를 선택합니다. date of capture(캡처 날짜)에서 경과 시간을 선택합니다. Morph geometry에서 area in pixels를 선택하고 intensity 아래에서 maximum intensity를 선택합니다.

이제 내보내기를 클릭합니다. 스프레드시트 프로그램에서 텍스트 파일을 열고 녹음 기간 동안 배경 신호의 평균값을 계산합니다. 배경 형광 강도를 결정합니다.

울라성 염증 모델에서 보여준 것처럼 혈소판 혈전 중 배경 형광 강도를 계산한 후 mask로 이동하여 segment를 클릭하고 fit e 및 channel을 선택하고 배경 신호의 평균값을 low click apply 및 okay에 삽입합니다. 그런 다음 통계로 이동하여 마스크 통계를 클릭합니다. 이제 이미지 범위에서 마스크 범위에서 현재 2D 타임랩스 또는 4개의 D 이미지를 클릭하고, 캡처 날짜 아래의 기능에서 전체 마스크를 선택하고, 모프 형상에서 경과 시간을 선택하고, 픽셀 단위의 영역을 선택하고, 강도에서 일부 강도를 선택합니다.

그런 다음 내보내기를 클릭합니다. 스프레드시트 프로그램에서 텍스트 파일을 열고 혈소판 혈전의 형광 강도를 계산합니다. 세동맥 혈전증을 분석하기 위해서는 방금 설명한 바와 같이 DITE 4 88 conjugated anti mouse CD 42 C ANDOR 6 47 conjugated anti mouse GR one 항체를 주입하는 것으로 시작합니다.

시작을 클릭하여 이미지 캡처 프로세스를 시작한 후 용기 벽에서 2-3마이크로미터 떨어진 지점을 두 번 클릭하여 레이저를 발사합니다. 세동맥 내피 세포의 손상은 명시야 이미지에서 명백하게 드러나야 하는 시각적 형태 변화를 일으킨 후 혈소판 축적이 뒤따릅니다. 레이저 손상 후 5분이 지나면 캡처를 일시 중지하고 취소합니다.

그런 다음 500밀리초 간격으로 2, 400개의 시간 지점으로 캡처를 시작하여 20분 동안 부착 혈소판과 롤링 및 부착 호중구를 기록합니다. 울라성 염증 모델과 유사한 방식으로 혈소판 혈전 중 배경 형광 강도를 계산한 후 mask(마스크)로 이동하여 segment(세그먼트)를 클릭하고 fite와 channel(채널)을 선택하고 배경 신호의 평균값을 low, click apply, okay에 삽입합니다. 이제 이미지 범위에서 마스크 범위에서 현재 2D 타임랩스 또는 40D 이미지를 클릭하고, 캡처 날짜에서 피처에서 전체 마스크를 선택하고, Morpho에서 경과 시간을 선택하고, 픽셀 단위의 영역을 선택하고, 강도에서 일부 강도를 선택합니다.

그런 다음 내보내기를 클릭합니다. 스프레드시트 프로그램에서 텍스트 파일을 열고 혈소판 혈전의 형광 강도를 계산합니다. 굴러가는 호중구와 부착된 호중구를 정량화하려면 타임랩스를 재생하고 눈에 띄게 굴러가는 세포의 수를 세십시오.

혈소판 혈전이 20분 이상 롤링되는 것은 최소 2초 동안 혈소판 혈전과 상호 작용하면서 호중구 속도가 감소하는 것으로 정의됩니다. 부착 호중구는 최소 2분 동안 혈소판 혈전에 부착된 상태로 남아 있는 모든 호중구로 정의됩니다. 여기에서는 호중구와 관련된 형광 신호의 출현을 빨간색으로 표시하고 혈소판을 녹색으로 표시하는 대표적인 이미지입니다.

울라성 염증이 표시되는 동안 화살표는 혈관 내 혈류의 방향을 보여줍니다. 염증이 있는 내피 세포의 롤링 및 부착 호중구의 수는 각각 분당 0.25 세포 및 5분당 18.5 세포로 측정되었습니다. 데이터는 4개의 야생형 마우스에서 30개의 서로 다른 E의 평균의 표준 오차를 더하거나 뺀 평균을 나타냅니다.

여기서 혈소판의 중앙값 통합 형광 신호는 시간의 함수로 표시됩니다. 빨간색으로 표시된 대부분의 혈소판은 염증이 있는 혈관 벽이 아니라 녹색으로 부착되고 기어다니는 호중구에 부착되는 것으로 나타났습니다. 이제 레이저로 유도된 세동맥 손상 후 호중구 혈소판 상호 작용으로 이동합니다.

이 이미지는 빨간색으로 표시된 단일 호중구를 보여주며, 노란색 화살표가 혈소판 혈전 위를 굴러가는 녹색으로, 두 번째 호중구가 빨간색으로 표시되고, 흰색 화살표가 세동맥 내피 세포 위를 빠르게 굴러가는 것으로 표시되며, 둘 다 5초 캡처 간격 동안 다시 빨간색으로 표시된 단일 호중구가 15초 간격으로 굴러가며 녹색의 혈소판 혈전을 부착하는 것으로 표시됩니다. 화살촉은 굴러가는 호중구와 부착된 호중구를 식별하고 두꺼운 회색 화살표는 혈류의 방향을 나타냅니다. 여기서, 혈소판의 중앙값 통합 형광 신호는 시간의 함수로 표시됩니다.

롤링 호중구와 부착 호중구의 수는 20분에 걸쳐 각각 21.5개 및 1.6개 세포로 확인되었습니다. 호중구의 초기 빠른 굴러가는 것은 내피 세포에서 일어났습니다. 호중구가 혈소판 혈전과 접촉하면 혈소판 혈전에서 호중구의 롤링 속도가 초당 8.2마이크로미터 범위로 변화했으며 펙틴과 psgl L one의 상호 작용에 의해 매개됩니다.

이 데이터는 평균 플러스 또는 마이너스, 레이저 손상 후 5분 후 7개의 야생형 마우스에서 14개의 서로 다른 혈전의 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 혈소판 혈전의 크기는 이미징 중에 비교적 일정하게 유지되며 호중구는 혈전으로 굴러 가서 달라붙습니다. 순환하는 혈소판에서 나오는 형광 신호는 무시할 수 있는 수준입니다.

혈소판 혈전과 비교하여, 이 비디오를 시청한 후에는 살아있는 마우스로 생체 내 현미경 시스템을 설정하는 방법을 잘 이해하게 되어 미세 혈관 구조 내의 활성화된 내피에서 혈소판과 호중구 사이의 이질적인 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.