에 신약 표현형을 평가 초파리 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색

이 절차의 전반적인 목표는 형질전환 초파리에서 도파민성 뉴런의 신경 퇴행을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 GAL 4 UAS 시스템을 통해 tyrosine hydroxylase promoter의 제어 하에 원하는 전이유전자를 발현함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 원하는 유전자형의 파리를 수집하여 성별로 구분하고 나이를 측정하는 것입니다.

세 번째 단계는 파리가 나이가 들면서 음의 지리 축으로 파리의 등반 활동을 테스트하는 것입니다. 마지막 단계는 서로 다른 연령대에 수집된 해부된 뇌에서 도파민 뉴런의 수를 세는 것입니다. 궁극적으로, 그 결과는 동물의 운동 행동과 도파민성 뉴런 개체군의 크기에 변화가 있음을 보여줄 것입니다.

이 접근법의 함의는 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료로 확장됩니다. 이 접근법은 신경 보호 유전자 및 약리학적 개입을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.분석을 설정하려면 원하는 유전자형의 연령과 일치하는 파리를 선택하십시오. 성별로 분리하고 무작위로 20-30마리의 동물 집단으로 그룹화합니다.

각 코호트는 통계적 표본을 나타냅니다. 코호트를 12시간 밝고 어두운 주기로 유지하여 일주기 리듬이 운동 행동에 미치는 영향을 제어하고 시험실에서 복제할 수 있는 온도로 유지합니다. 코호트의 바이알을 2-3일마다 교체하고 매주 일정한 시간에 테스트합니다.

실험 30분 전에 각 집단에 이산화탄소를 마취시키고 테이프로 연결된 빈 음식 바이알로 만든 라벨이 붙은 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 파리는 5분에서 10분 후에 깨어나야 하지만 마취로부터의 완전한 회복은 나이와 유전자형에 따라 다르므로 최적화해야 합니다. 지금. 테스트 바이알 뒤를 볼 수 있는 높이 눈금을 만듭니다.

흰 종이에 1에서 20cm 사이의 거리를 표시합니다. 그런 다음 저울을 제자리에 고정합니다. 이제 약 20-30cm 떨어진 저울에 대해 테스트할 튜브를 정렬합니다.

바이알을 정사각형으로 보기 위해 디지털 카메라를 배치합니다. 튜브의 라벨과 저울이 명확하게 보이는지 확인하십시오. 위치가 설정되면 녹음을 시작하고 디지털 타이머를 시작합니다.

이제 튜브를 몇 초 동안 탭합니다. 모든 파리는 튜브의 바닥을 모아야 합니다. 전체 실험에서 동일한 지속 시간과 동일한 힘으로 이 단계를 일관되게 수행해야 합니다.

1분 후 15회 연속 시도 중 두 번째 시도에 대해 넉다운을 다시 반복합니다. 15번의 시도가 모두 완료되면 영화를 육안으로 검사하여 파리를 새 유리병으로 되돌립니다. 코호트당 수행된 15번의 시행 각각에 대해 2cm 이상의 파리 수를 계산합니다.

10초가 경과한 후 2cm 표시는 경험적으로 결정되며, 테스트 중인 많은 연령에서 10초 후에 모든 컨트롤이 교차하는 거리입니다. 15개 시도의 평균 점수를 취하여 목표를 넘은 코호트 구성원의 백분율로 표현합니다. 통계적 반복 횟수는 15번의 시행이 아니라 각 그룹에 대해 테스트된 코호트 수와 같습니다.

학생의 T-test, anova 또는 기타 적절한 분석 방법을 사용하여 서로 다른 유전자형 간의 통계적 유의성을 평가합니다. 에탄올이 70%인 해부 접시에 파리를 약 1분 동안 넣습니다. 큐티클 왁스를 제거합니다.

그런 다음 파리를 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 다른 해부 접시로 옮기고 뇌 해부를 진행합니다. 복부 쪽이 위로 향하도록 플라이를 배치하고 선택적으로 날개와 다리를 제거합니다. 한 세트의 집게를 사용하여 몸을 잡고 다른 한 세트를 사용하여 눈 아래의 큐티클을 잡습니다.

그런 다음 머리를 몸에서 당겨 빼냅니다. 다음으로, 머리에서 주둥이를 잡아당겨 제거합니다. 그런 다음 새 구멍의 반대쪽 가장자리에 있는 머리 큐티클을 잡고 뇌가 머리 캡슐에서 제거될 때까지 반대 방향으로 당깁니다.

이제 뇌 표면에 남아 있는 큐티클을 섬세하게 제거합니다. 그런 다음 공기로 채워진 기관 조직을 모두 제거합니다. 이렇게 하면 다음 잠복기 단계에서 뇌가 떠다니는 것을 방지할 수 있습니다.

P 200 피펫 팁에서 브레인 핸들링 피펫을 준비합니다. 몇 밀리미터를 잘라내고 PBS에서 0.1%Triton X 100으로 평형을 이룹니다. PBS에 4%PFA로 완전히 채워진 반 밀리리터 튜브로 뇌를 옮깁니다.

부드러운 회전으로 실온에서 20분 동안 뇌를 고정합니다. 20분 후 P 1000 피펫을 사용하여 PBS에서 0.1%Triton X 100인 세척 완충액 반 밀리리터로 고정제를 교체합니다. 반전으로 혼합하고 세척 버퍼를 교체하기 전에 뇌가 1분 동안 배양하도록 합니다.

1분 후, 세척 버퍼를 두 번째로 교체하고 실온에서 20분 동안 뇌를 배양합니다. 그런 다음 세척 버퍼를 세 번째로 교체하고 다시 20분 동안 뇌를 배양합니다. 이제 세척 완충액을 제거하고 뇌가 실온에서 1시간 동안 반 mm의 차단 완충액으로 배양하도록 합니다.

한 시간 후, 차단 용액에 antit 항체의 1-100 희석을 추가합니다. 섭씨 4도에서 이틀 동안 부드럽게 회전하며 배양합니다. 블록을 제거하려면 수정 사항을 제거하는 데 사용된 세척을 반복합니다.

그런 다음 부드러운 회전으로 섭씨 4도에서 2일 동안 용액을 차단하기 위해 2차 항체를 1-200 희석하여 두뇌를 평형화합니다. 며칠 후 동일한 세척 절차를 사용하여 2차 항체를 제거합니다. 장착 슬라이드를 준비하려면 커버 유리에 장착 매체 2 25 방울을 추가합니다.

중간에 틈이 있는 장착 미디어에 두 개의 커버 안경을 놓습니다. 슬라이드를 건조시킵니다. 장착 슬라이드의 너비가 s에 맞지 않는 경우tage 컨포칼 현미경의 경우 매니큐어를 사용하여 22 x 22mm 커버 슬립을 슬라이드에 부착하여 제대로 맞도록 합니다.

이제 뇌가 있는 용액을 50마이크로리터의 장착 매체로 교체하십시오. 절단 P 200 팁으로 피펫팅하여 장착 매체와 두뇌를 평형을 이룹니다. 다음으로, 절단된 P 200 팁을 사용하여 뇌를 도랑으로 옮깁니다.

장착 슬라이드에서 뇌의 방향을 지정하여 전방 또는 후방 측을 봅니다. 그런 다음 숫자 1.5 커버 슬립으로 덮고 한쪽 모서리에서 커버 안경 사이의 공간을 장착 미디어로 채워 공기를 모두 제거합니다. 슬라이드를 건조시킨 다음 검사하기 전에 매니큐어로 밀봉하십시오.

인간 알파 synuclein는 상승 분석실험에 있는 TH GAL 4개의 운전사를 사용하여 DA 신경에서 발현되었다. 이 전이유전자를 발현하는 수컷은 연령 일치 대조군에 비해 가속화된 감소를 보였으며 NRF 2D NA 결합 파트너를 발현하는 coex로 비행했습니다. Math S 암컷은 다른 유전자형의 4주 된 수컷 파리를 비교하는 유사한 결과를 보여주었습니다.

면역형광 기반 DA 뉴런 수를 사용하여 PPL 1 뉴런의 수를 정량화했습니다. PPL 1 뉴런의 작지만 중요한 손실은 알파-시누클레인을 발현하는 파리에서 발견되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 CLA 분석 및 티로신 aase 면역형광을 통해 형질전환 조아에서 varg 뉴런의 신경 퇴행을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

시청해 주셔서 감사합니다.