Name: 설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 배우세요 생체외 고해상도 영상법으로 생쥐 기도 상피 섬모 운동성과 유체 흐름을 정량 분석하는 방법을. 이 기법은 20~30분 내에 재현 가능한 결과를 제공하여 호흡기 질환 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트는 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소에서 NIH 교부금 U01HL098180에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 심장, 폐의 공식 견해를 대변하지 않습니다, 및 혈액 연구소 또는 국립 보건원

1. 시약 설정 1.1 해부 및 영상 매체 Leibovitz의 L-15 배지 (L15)는 기관 샘플 수확 및 이미징을 수행하는 동안 사용되는 FBS (10 %)과 페니실린 - 스트렙토 마이신 (100 단위 / 페니실린 G 나트륨과 스트렙토 마이신 황산염 100 ㎍ / ㎖의 ML)로 보충된다. 2. 얕은 벽으로 둘러싸인 문화 챔버 어셈블리 기관 조직을 보유하는 데 사용되는 챔버는 그림 1에 표시됩니다. 챔버의 바닥은 유리 35mm 배양 접시 바닥이다. 챔버의 상단과 측면이 유리 접시 위에 0.3 mm 두께의 실리콘 시트의 작은 조각을 배치하여 생성됩니다. 시트의 가장자리가 둥근 바닥 요리에 맞게 절단 및 센터는 추가 (단계 2.1-2.3 참조) 얕은 중앙 챔버를 형성하기 위해 트림합니다. 이 어셈블리의 상단에, 18mm의 둥근 유리 커버 슬립이 영상에 적합한 밀폐 챔버를 생성하기 위해 배치됩니다. <ol><li> 완전히 0.3 mm 두께의 실리콘 시트의 사각형 18mm 원형 유리 커버 슬립을 포함한다. </li><li> 표준 날카로운 해부 가위 커버 슬립 (실리콘 시트의 원형 레이어의 결과)의 가장자리 주위에서 초과 실리콘 시트를 트림. </li><li> 날카로운 메스를 잘라와 커버 커버 슬립 (따라서 이미징 챔버의 상단과 측면을 형성)의 중간에서 실리콘 시트 (약 10mm 광장)의 중앙 광장을 제거와 함께. </li></ol> 3. 기관 수확 및 준비 <ol><li> 지역 기관 동물 관리에 따라 쥐를 안락사와위원회 및 / 또는 정부의 지침을 사용하여 잠수함의 조직에 충분한 L15 미디어 (저자를 통해, 단지 임신 일 16.5에서 출생하기 전에 마우스를 사용하고있는 표준 플라스틱 35mm 배양 접시에 기관을 제거 신생아, 신생아, 성인 동물 2). </li><li> 의 외부에 부착 된 비 기관 관련 조직을 제거무딘 절개를하여 기관. </li><li> 다만 마이크로 해부 가위 (그림 2A, 선 1)를 사용하여 윤상 연골 아래에 가로 컷 후두를 제거합니다. </li><li> 마이크로 해부 가위 (그림 2A, 선 2)를 사용하여 바로 카리나 위의 가로 컷으로 왼쪽과 오른쪽 주 기관지 분지를 제거합니다. </li><li> 부드럽게 미세 집게로 기관을 보유하고 점액과 혈액을 맑게하는 P1000 Pipetman과 P1000 팁 입욕 L15 매체의 ~ 1 ml의 루멘 2 ~ 3 회 세척하십시오. </li><li> 마이크로 해부 가위 (그림 2B, 선 1) 가로 컷을 사용하여 기관지의 3-4 링 세그먼트를 잘라. </li><li> 마이크로 해부 가위 (그림 2B, 선 2)를 사용하여이 짧은기도 세그먼트의 trachealis 근육의 중앙을 세로 방향으로 잘라. </li><li> 마이크로 해부 가위 (그림 2C를 사용하여 기관 연골 고리의 중앙을 세로 방향으로 잘라 그림 2D에서와 같이)를 떠나&gt; 라인). </li></ol> 4. 속눈썹 영상 <ol><li> 이전 기관 조직 부문, L-15 매체의 100-200 μL와 35mm 유리 바닥 문화 요리의 중간에 내려 루멘 쪽. </li><li> 속눈썹 생성 흐름이 기관의 조직 샘플을 (~ 1 × 10 11 입자 / ㎖ 또는 Fluoresbrite 2.5 % 수성 microsphere의 현탁액 20 μL / ㎖) 목욕 L-15 배지에 형광 0.20 ㎛의 작은 양의 마이크로를 추가 계량합니다. </li><li> 실리콘 시트로 잘라 창에 의해 형성된 얕은 벽 챔버의 중앙에있는 기관의 샘플, 이미징 챔버 아래 기관 샘플 실리콘 시트면의 상단에 (위의 1-3 절차를 참조하십시오) 이전에 준비를 놓습니다 (그림 1 ). </li><li> 조심스럽게 제자리에 고정 coverslip을 아래로 밀어 가장자리저기서을 넘는 L-15 용지를 제거조지아 P1000 팁 P1000 Pipetman. </li><li> 100X 목적 및 DIC 광학 거꾸로 현미경에 35mm 유리 바닥 문화 요리와 기관 샘플을 장착합니다. </li><li> 고속 카메라와 영화 수집 소프트웨어를 사용하여 200 섬모 운동의 영화를 수집 +의 섬모 기관 상피에 따라 초당 프레임 (그림 2D 박스, E 윤곽 : 녹화 된 동영상에서 예를 스틸 이미지) trachealis 근육의 가장자리를 웅크 리고 (보충 영화 1). </li><li> FITC epifluorescent 이미징 및 저조도 CCD 카메라 (위의 장비 목록을 참조)를 사용하여, 속눈썹 생성 흐름 (보충 영화 2) 이후 정량화 할 수 있도록 섬모 기관 상피의 표면에 형광 microsphere의 운동의 영화를 수집합니다. </li></ol> 5. 섬모 운동성의 정량 <ol><li> ImageJ에 소프트웨어 패키지에 DIC 이미지 한 영화를로드하고 I에서 설명하는 방법에 따라아인 Drummond는 13 박동 섬모를 건너 래스터 선을 그리는 선 도구를 사용합니다. 이 라인의 &quot;다시 분할은&quot;라인에 걸쳐 섬모 운동이 파형을 생성 kymograph 형식 이미지를 생성합니다. 각 파의 피크 사이의 픽셀 수는 그들을 측정 (하나의 픽셀 = 1 동영상 프레임) 분당 비트 (즉 Hz에서)의 수는 다음 계산 될 수있는 것입니다. </li><li> ImageJ에 소프트웨어 패키지로 속눈썹을 흐름이 생성 부하 형광 구슬 영화를 측정하고 수동으로기도 상피의 표면에 형광 구슬을 추적하고 소프트웨어를 추적 각 비드 비드 속도와 방향성을 생성하도록 MTrackJ 플러그인 14을 사용합니다. </li></ol> 치는 속눈썹의 거리로 흐름을 정량화하는 강력한 측정 유량 크기에 영향을 미칠 수있는 형광 구슬을 사용하는 경우주의해야합니다. 보충 영화 2 구슬 운동은 이것의 좋은 예입니다. 이 예제 비드의운동 박동 섬모의 표면에 빠르고 훨씬 더 멀리 목욕 미디어 비즈 끊깁니다. 이를 위해 제어하려면, 구슬 트레이싱은 정확한 비교를 할 수 있도록 모든 샘플에있는 섬모 상피 위의 고정 된 거리에서 수집해야한다. 마지막으로, 유체의 흐름에 대한 대표적인 데이터를 얻기 위해, 구슬은 가급적 대해 추적해야한다, 우리는 유체 흐름을 계산하기위한 10 + 섬모 세포를 커버 비드 트랙을 사용하는 것을 선호합니다.

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저자는 공개 아무것도 없어.

속눈썹 비트 주파수 측정 (CBF)는 고성능 현미경 목표와 빠른 이미지 수집 하드웨어 13,15을 사용하여 비교적 쉽고, CBF 측정은 건강과 질병 중에 점막 섬모 허가를 조사하고 대부분의 연구의 기초를 형성 이유를 설명합니다. CBF 측정 혼자 CBF의 점막 섬모 정리, 측정을 이해하기위한 필수적인 반면, 섬모 생성 흐름을 측정하기가 더 어렵 자주 무시되는 둘 중 속눈썹 비트 파형 모두의 근본적인 중요성을 무시하고 CBF와 연관되지 않을 수 있습니다. CBF 증가 섬모 생성 흐름과 일치하지 않을 수도 증가하는 방법의 예는 DNAH11 돌연변이를 가진 일부 환자에서 볼 수 있습니다. DNAH11는 axonemal dynein 중쇄 단백질, 모두 hyperkinetic (빠른) 섬모 비트와 점막 섬모 정리 16 문제를 일으킬 것으로 예상되는 비정상적인 섬모 비트 파형을 일으키는 것으로보고 된 어떤 돌연변이입니다. significa우리의 프로토콜 NT의 장점은 섬모 구타 모양과 속눈썹의 고해...

기도 상피 세포의 운동성 섬모 기능의 분석은 점막 섬모 통관 및 폐 건강 한 영향을 미칠 수있는 유전과 환경 요인을 해명 실험적으로 중요합니다. 영상에 마우스기도 상피를 위해 개발 된 간단한 프로토콜은 돌연변이와 녹아웃 마우스 모델에서기도 섬모 운동을 심문하는 효율적인 방법을 제공하고 마우스 기관 조직의 절개와 높은 해상도 videomicroscopy와기도 섬모 운동의 생체 이미징는 기본 기술을 필요로합니다. 이 프로토콜은 이소성 2-5과 관련된 선천성 심장 질환을 가진 돌연변이의 운동성 섬모 기능의 신속한 평가 (속눈썹 비트 주파수, 섬모 구타 모양, 속눈썹 생성 흐름)을 허용하는 대규모 마우스 돌연변이 화면 중에 설립 세련된. 기도 섬모 운동을 연구하는 데 사용되는 현재의 기술은 급성 전 생체 유형 또는 경도 하나에 그룹화 할 수 있습니다체외 실험 방법의 GER 용어입니다. 급성 실험은 생체 인간 코 /기도 브러시 생검의 시각화 6,7 간단한 가로기도 섹션 8의 분석을 포함. 체외 방식은 공기 액체 인터페이스를 문화 나기도 현탁 배양 9-11에서와 같이 차별화 된 섬모 상피의 시트를 생성하는 다양한 세포 배양 기술을 활용합니다. 모든 사용 가능한 섬모 상피 세포가 실험 (4-6주 9,10)에 대해 생성되기 전에 그러나, 이러한기도 상피 reciliation 기술은 시간과 교육에서 매우 중요한 투자를 필요로합니다. 기도 상피 브러시 생검의 급성 전 생체 분석은 일반적으로 인간의 임상 연구에 사용하고 있지만,이 방법은 더욱 악화 기계적 조직 손상 12에 의한 마우스 연구에서 사용할 수 없습니다. 양해 각서 (MOU)의 분석을 위해이 프로토콜에 설명 된 기술E 기관기도 상피 실행할 단순 아니지만, 그것은 특별한 해부 기술도 videomicroscopy하여 이미징을위한 그 표준 이외의 특수 장비 전혀 필요하지 않습니다. 이 간단한 프로토콜에 많은 장점이 있습니다. 마우스 기관 조직 수확을 실시 할 빠르고 쉽기 때문에 첫째, 그것은 쥐의 큰 숫자기도 섬모 기능의 신속한 평가를 위해 수 있습니다. 이 체외 치료 다른의 단기 효과 급성 분석을 포함 할 수 있습니다. 둘째, 생체 기술되고, 섬모기도 상피 세포는 지원 조직을 기본에 붙어 남아 있으므로 관련된 세포 신호 경로를 유지합니다. 따라서 체외 reciliated기도 상피 세포에 비해,이 혼합물은 생체 조직 환경에서 자연의 더 나은 표현입니다. 셋째,이 프로토콜을 허용 운동성 섬모 F의 객관적인 평가를 제공 할 수있는 다른 양적 변수의 숫자의 취득기름 부음. 마지막으로,기도 섬모 시각화를위한 다른 현재의 방법과는 달리,이 프로토콜은 섬모 비트의 고해상도 이미징 및 metachronal 파 생성을위한 최적 속눈썹의 프로필보기를 허용, 속눈썹 비트 방향에 직각 속눈썹의 시각화 수 있습니다 . 이 프로토콜은 이러한 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는기도 섬모 기능 및 생성 / 유지 보수 등의 점액 부하 등의 기계적 요인의 역할과 실험의 다양한 요구를 해결하기 위해 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다 기도 섬모 비트와 metachronal 파동 전파.

<table><tbody><tr><td>레보비츠' s L-15 Medium </td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>페놀 레드 </td></tr><tr><td>태아 소 혈청 </td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2x 미세 집게 </td><td>Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위 </td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 가위 </td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>메스 </td><td>Roboz</td><td>RS-9801-15</td><td></td></tr><tr><td>P1000 피펫맨 </td><td>Gilson, Inc</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P1000 팁 </td><td>Molecular BioProducts</td><td>2079E</td><td></td></tr><tr><td>18mm 원형 유리 커버 슬립 </td><td>Fisher Scientific</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 35mm 배양 접시 </td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 35mm 배양 접시 </td><td>워너 인스트루먼트</td><td>W3 64-0758</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 시트 0.012" (0.3 mm) 두께</td><td>의 AAA Acme Rubber Co</td><td>CASS-.012X36-63908</td><td></td></tr><tr><td>0.20 &mu; m 직경 Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres </td><td>Polysciences</td><td>09834-10</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경, 100x 오일 대물렌즈 및 DIC 필터 </td><td>Lecia</td><td>DMIRE2</td><td>브랜드는 중요하지 않습니다. </td></tr><tr><td>100와트 수은 램프, 에피 형광 FITC 여기/방출 필터</td><td>Lecia</td><td></td><td>브랜드는 중요하지 않습니다.</td></tr><tr><td>현미경 스테이지 인큐베이터</td><td>Lecia</td><td>11521749</td><td>실온에서 섬모를 이미징하는 경우 필요하지 않음</td></tr><tr><td>고속 카메라 명시야 </td><td>Vision Research</td><td>Phantom v4.2</td><td>브랜드가 중요하지 않습니다. 125fps보다 빨라야 합니다</td></tr><tr><td>고속 형광등 카메라 </td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-12</td><td>브랜드는 중요하지 않습니다. 10fps보다 빨라야 합니다</td></tr>.<tr><td>영화 분석 소프트웨어</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ(MtrackJ 플러그인</td><td></td></tr></tbody></table> 포함)

설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

점막 섬모 정리 기능에 대한 통찰력을위한 중요한 운동성 섬모 기능의 정량적 분석을위한 영상 마우스의기도 상피 세포에 대한 생체 기술이 설립되었습니다. 갓 수확 마우스 기관은 trachealis 근육을 세로로 잘라 유리 바닥 접시에 얕은 벽 챔버에 장착된다. 기관의 샘플은 길이 방향으로 컬하는 trachealis 근육을 활용하기 위해 긴 축을 따라 배치됩니다. 이 전체 기관 길이에 따라 프로필보기 섬모 운동의 이미지를 수 있습니다. 200 프레임 / 초의 영상은 섬모 비트 주파수와 섬모 파형의 정량 분석​​을 할 수 있도록 차등 간섭 대비 현미경과 고속 디지털 카메라를 사용하여 얻을 수 있습니다. 영상 중에 형광 구슬의 추가와 함께, 섬모 발생 유량도 측정 할 수 있습니다. 프로토콜 시간은 챔버 준비를위한 5 분에서 약 30 분, 샘플에 대한 5-10 분에 걸쳐설치 및 videomicroscopy 10 ~ 15 분.

동영상 재생 100 %, 속눈썹 비트 (보충 영화 2의 방향으로 눈에 띄는 흐름; 통제기도 섬모가 명확하게 볼과 조정 방법 (동영상 재생이 15 % 실시간으로 느려집니다 보충 영화 1)에서 이길 볼 수 있어야합니다 ) 시간 진짜. 섬모 영화의 정량은 그림 3에서 본 것과 유사한 결과를 얻을 수 있어야합니다. 형광 구슬의 추적 섬모 생성 유속의 측정 (그림 3D)을 허용하면서 고속 DIC 영화 컬렉션은 가능한 속눈썹 비트 주파수 (그림 3C)의 정량을하고 섬모 구타 모양의 질적 평가에 대한 좋은 이미지를 제공합니다 및 방향성 (그림 3E). 우리는 선형 흐름의 인덱스를 제공하기 위해 방향성을 사용합니다. 방향성은 형광 구슬 (즉, 최단으로 여행의 총 변위로 나누어 계산거리 추적의 시...

기도 섬모 운동과 섬모 생성 흐름을 마우스 기관을 사용하여 시각화 및 정량화를위한​​ 쉽고 안정적​​인 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 요소의 넓은 범위 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하와 같은 기계적 요인 등 섬모 운동성에 영향을 미치는 방법을 결정 수정할 수 있습니다.

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

본 절차의 전반적인 목표는 갓 분리한 마우스 기관지를 사용하여 호흡기 CLIA 운동성과 CLIA에 의해 생성된 흐름을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 얕은 이미징 챔버를 준비함으로써 수행됩니다. 이어지는 절차 단계에서는 이미징을 위해 기관지 조직을 채취하고 장착합니다.이어서 100배 XDIC 대물렌즈와 고속 비디오 촬영 기능이 있는 도립 현미경을 사용하여 C motility 및 CLIA 생성 유동을 시각화하고 기록하는 방법이 제시됩니다. 마지막 단계는 Image J 소프트웨어를 사용하여 CLIA 박동 빈도와 CLIA 생성 유동을 정량화함으로써 비디오를 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 고속 비디오 현미경법을 통해 호흡기 CLIA motility 및 CLIA 생성 유동의 변화를 확인할 수 있습니다.기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 설치류 기도 상피의 재현 가능한 이미징이 가능하여 섬모 운동에 대한 일관된 정량적 평가를 수행할 수 있다는 점입니다. 이는 최소한의 교육만으로 20분에서 30분 이내에 완료될 수 있습니다. 이 방법은 특히 다양한 유전자 변형 및 돌연변이 마우스 모델과 함께 사용할 때, 기도 내 점액 제거를 조절하는 세포 및 분자적 기전과 관련된 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.먼저 기관 샘플을 담을 챔버의 바닥 또는 베이스를 제작하는 것으로 시작합니다. 상단에는 바닥이 유리로 된 35 millimeter 배양 접시를 사용하십시오. 0.3 millimeter 두께의 실리콘 시트를 사용하십시오.18 millimeter 원형 유리 커버 슬립 위에 시트를 놓고 가장자리를 다듬습니다. 다음으로 메스를 사용하여 실리콘 중앙에서 10 millimeter 정사각형을 잘라냅니다. 이렇게 준비한 유리 커버 슬립과 실리콘이 배양 챔버의 상단과 측면을 형성하게 됩니다.배양 접시에 놓인 시료 위에 이를 배치합니다. 기관의 제도적 지침에 따라 마우스를 안락사시킨 후, 수술적으로 기관을 분리합니다. 기관을 L 15 배지가 충분히 들어있는 플라스틱 35 millimeter 배양 접시에 수집하여 완전히 잠기게 합니다.둔성 박리(blunt dissection)를 사용하여 기관 주변의 모든 비기관 조직을 제거합니다. 다음으로, 미세박리 가위를 사용하여 윤상연골 바로 아래를 가로로 절개하여 후두를 제거합니다. 이제 미세 핀셋을 사용하여 기관분기능(carina) 바로 위를 가로로 절개하여 좌우 주기관지 가지를 제거합니다.기관을 조심스럽게 잡습니다. 그다음 1 mL 피펫을 사용하여 L 15 배지로 루멘을 2~3회 세척하여 점액과 혈액을 제거합니다. 이어서 미세 절삭 가위를 사용하여 횡단면을 절개하여 기관의 3~4개 링 분절을 제거합니다.그런 다음 작은 기관 분절에서 기관 근육의 중앙을 따라 세로로 절개합니다. 마지막으로 미세 해부 가위를 사용하여 기관 연골 고리의 중앙을 세로로 절개하여, 이미징에 적합한 두 개의 기관 조직 구역을 남깁니다. 해부가 끝나면 기관 조직 분절의 내강 쪽이 아래로 향하도록 하여 약 100 µL의 L 15가 담긴 유리 바닥 접시의 중앙으로 옮깁니다.L 15 배지 mL당 2.5% 형광 마이크로스피어 현탁액 20 µL를 사용하여 생성된 CLIA 흐름을 정량화합니다. 이제 실리콘 및 유리 커버를 기관 위에 놓고 가볍게 눌러 고정하십시오. 그런 다음 가장자리를 따라 1 mL 피펫으로 과잉 배지를 제거합니다.이제 챔버를 100배 대물렌즈와 DIC 광학계가 장착된 도립 현미경으로 옮깁니다. 고속 카메라와 영상 획득 소프트웨어를 사용하여, 말려 올라간 기관지 근육 가장자리의 섬모 기관지 상피를 따라 초당 200프레임 이상의 속도로 CLIA 운동성 영상을 수집합니다. FS epi 형광 이미징과 저광량 CCD 카메라를 사용하여 섬모 기관지 상피 표면을 가로질러 이동하는 형광 미세구체의 영상을 수집합니다.이 영상들을 사용하여 CLIA로 생성된 유동의 정량화를 진행하십시오. 세포 박동 기능의 눈에 띄는 변화 없이 최대 1시간까지 샘플 이미징이 가능합니다. 먼저 CLIA의 분당 박동수를 계산하십시오. DIC로 이미징된 영상들을 Image J 소프트웨어 패키지로 불러오십시오.Aian Drummond가 설명한 기술을 따르십시오. 라인 도구를 사용하여 래스터 라인을 그리십시오. 박동하는 섬모를 가로지릅니다.이 선의 해상도 슬라이스(res slice)를 만들어 CA가 선을 가로질러 이동할 때 파형 패턴이 생성되는 그래프 형태의 이미지를 생성하십시오. 이제 이 선을 따라 각 파동 정점 사이의 픽셀 수를 세십시오. 이 수치로부터.각 영화 프레임이 선을 따라 하나의 픽셀로 표시됨을 이용하여 분당 박동수를 계산하십시오. 다음으로, C Cate에 의해 생성된 흐름을 측정하십시오. 형광 비드 영상을 Image J 소프트웨어 패키지로 불러오십시오.MT track J 플러그인을 사용하여 기관 상피 표면의 형광 비드를 수동으로 추적하십시오. 소프트웨어가 추적된 각 비드의 속도와 방향성을 계산합니다. 비드가 부착된 섬모로부터의 거리가 측정된 흐름 크기에 강한 영향을 미칠 수 있으므로 주의하시기 바랍니다.본 예시에서는 비드(bead)의 이동 속도가 섬모 표면에서는 빠르지만, 배양액 내에서 표면으로부터 멀어질수록 감소합니다. 이를 제어하기 위해, 모든 샘플에서 섬모 상피 위 일정 거리에서만 비드 추적 데이터를 수집하여 정확한 비교가 가능하도록 해야 합니다. 마지막으로, 유체 흐름을 분석할 때는 비드를 가능한 한 길게 추적하십시오. 이러한 계산을 수행하려면 10개 이상의 섬모 세포를 지나가는 비드를 사용하는 것이 바람직합니다.설명된 프로토콜을 사용하면 대조군 기도 섬모가 명확하게 보여야 하며, 조율된 방식으로 움직이는 것이 관찰되어야 합니다. 마찬가지로, 섬모 박동 방향으로 뚜렷한 흐름이 나타나야 합니다. 일반적으로 고속 DIC 영상을 수집하면 C 박동 빈도를 정량화할 수 있으며 양질의 이미지를 얻을 수 있습니다.CLIA 비드 형태의 정성적 평가를 위한 단계입니다. 형광 비드의 추적을 통해 CLIA로 인해 생성된 유속을 측정합니다. 방향성은 형광 비드의 총 변위를 형광 비드 궤적의 길이로 나누어 계산합니다.따라서 직선 궤적선은 1점을 얻습니다. 반면, 구불구불한 경로는 훨씬 낮은 값을 얻습니다. 이 절차를 수행할 때, 절단하기 전에 기관 근육 주변의 모든 결합 조직과 지방 조직을 적절히 제거하는 것이 중요함을 기억하십시오.기관 근육은 절단 후 말리는 성질이 있으며, 이는 호흡 CLIA를 이상적인 시각화 위치로 잡는 데 필수적입니다. 이 절차 이후에는 약물제가 호흡 C 활동을 어떻게 또는 왜 조절하는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 약리학적 연구와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

ex-vivo-method-for-high-resolution-imaging-cilia-motility-rodent

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Al Omran, A. J., et al. 마우스 뇌의 외측 심실에 있는 뇌실막의 실시간 이미징. J. Vis. Exp. (2015).  이 비디오는 미분 간섭 대비(DIC) 현미경을 사용하여 시상 쥐 뇌 절편에서 뇌실막의 박동을 관찰하는 실시간 이미징 기술을 보여줍니다. 뇌실막(epiendymal cilia)은 뇌척수액(CSF)을 추진하며, 이들의 활동은 영양이 풍부한 배지로 유지되고 기후 조절실에서 영상화되는 뇌 절편에 기록됩니다. 고대비 비디오를 통해 기능적 섬모를 식별하고 박동 빈도를 정량화할 수 있습니다.

Mouse Brain Section에서 Ependymal cell ciliary activity의 라이브 이미징

의 intravital 현미경은 살아있는 동물의 다양한 생물학적 과정을 영상화 할 수있는 강력한 도구입니다. 이 문서에서는, 우리는 살아있는 생쥐의 침샘에서 이러한 분비 과립으로 세포 내 구조의 역학 이미징을위한 자세한 방법을 제시한다.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

고해상도 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여, 마우스 뇌 심실 내에 위치 운동성 뇌실막 섬모의 고동의 생체 관찰은 실시간 이미징에 의해 입증된다. 이 기술은 고유의 섬모 박동 주파수의 기록 및 구타 각도뿐만 아니라 세포 내 칼슘 진동 페이싱 등록 할 수 있습니다.

마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

본 연구에서는 초구조 분석을 위한 전자 현미경 방법과 함께 생체 외 CPEC 섬모의 움직임을 실시간 관찰 및 분석할 수 있도록 상세한 광학 현미경 기술을 최적화했습니다.

맥락총 상피 세포의 섬모 운동의 관측<em&gt; 전의 VIVO</em

이 간행물에서는, 우리는 이중 양식 방사성 핵종 화상 진찰을 이용하는 생체내 마우스에 있는 기도 점원 클리어런스 (MCC)를 평가하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 이중 SPECT/CT 시스템에서 마우스 전신(MWB) 콜리메이터를 사용하여 단일 광자 방출 컴퓨팅 단층 촬영(SPECT) 및 컴퓨터 단층 촬영(CT) 획득 프로토콜을 위해 설계되었습니다.

마우스의 점도 클리어런스의 생체 내 평가

PCD 진단을 위한 성공적이고 고품질의 섬모 기능 분석을 보장하려면 호흡기 상피 샘플링 및 처리를 위한 정확하고 신중한 방법이 필수적입니다. COVID-19 팬데믹 기간 동안 PCD 진단 서비스를 계속 제공하기 위해 섬모 비디오 현미경 프로토콜이 적절한 감염 관리 조치를 포함하도록 업데이트되었습니다.

디지털 고속 섬모 비디오 현미경을 사용한 비강 칫솔질 샘플링 및 처리 – COVID-19 전염병에 대한 적응

이 프로토콜은 비강 상피 세포 수집, 확장 및 기관형 기도 상피 세포 모델로의 분화와 라이브 셀 이미징 및 맞춤형 스크립트를 통한 섬모 박동 빈도의 정량화를 설명합니다.

섬모 박동 빈도의 정량화를 위한 1차 인간 비강 상피 세포 모델의 수집, 확장 및 분화

고속 비디오 현미경 분석은 비교적 수행하기 쉽고 빠르며 비용 효율적이며 숙련 된 손에는 원발성 섬모 운동 장애의 첫 번째 라인 진단을위한 상당히 신뢰할 수있는 도구로, 진단 및 중증 폐 질환 치료와 관련된 모든 센터에서 사용할 수 있어야합니다.

원발성 섬모 운동장애의 일선 진단을 위한 고속 비디오 현미경 분석

이 프로토콜은 최적화된 마취 요법과 미세하게 조정된 내시경 조작 기술을 사용하여 호흡 및 삼키는 동안 후두의 클로즈업, 방해받지 않는 비디오 이미징을 허용하는 마우스와 쥐를 위한 연속 경구강 후두경 접근 방식을 설명합니다.

최소 침습적 쥐 후두경(Minimally Invasive Murine Laryngoscopy)은 호흡과 삼킴 중 후두 움직임을 클로즈업하여 촬영합니다.

공기-액체 계면 배양은 일반적으로 폐기도의 정점 쪽을 모방하는 1차 정상 인간 기관지 상피 세포를 분화하여 가성층화 기도 상피를 개발하는 데 사용됩니다. 여기에서는 섬모 기능 및 막 무결성과 같은 생물물리학적 특성을 모니터링하여 품질을 결정하기 위한 쉬운 프로토콜에 대해 설명합니다.

Determining Ciliary Function and Membrane Impermeability of the Pseudostratified Lung Airway epithelium(가성층화된 폐 기도 상피의 섬모 기능 및 막 불투과성 측정)

이 방법은 조직 수집에서 섬모 조직 분석에 이르기까지 광물화된 조직의 넓은 영역에 걸쳐 원발성 섬모를 3차원으로 제 자리에서 이미지화하기 위해 ARL13B-CENTRIN-2 형질전환 마우스 모델에서 내인성 신호를 활용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 유형의 조직에도 적용될 수 있습니다.

ARL13B-CENTRIN-2 마우스 모델을 사용한 근골격계 조직의 원발성 섬모의 체적 이미징 및 분석

배우세요 생체외 고해상도 영상법으로 생쥐 기도 상피 섬모 운동성과 유체 흐름을 정량 분석하는 방법을. 이 기법은 20~30분 내에 재현 가능한 결과를 제공하여 호흡기 질환 연구에 활용됩니다.

설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법

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