Name: 에서 상동 재조합 구문을 Recombineering 초파리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 배우세요 초파리에서 상동 재조합 벡터를 생성하는 재조합 기법을 활용한 유전자 조작 방법입니다. 이 기술은 정밀한 널 돌연변이 생성과 내인성 단백질 표지에 활용됩니다.

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우리는 휴고 Bellen 및 시약 블루밍턴 증권 센터 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 더 도움이 토론 공원 Venken, 휴고 Bellen 및 Buszczak 및 Hiesinger 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 ACR에 건강의 국립 연구소 (T32GM083831), PRH (RO1EY018884)에서 교부금에 의해와 MB (RO1GM086647), MB와 PRH (RP100516)에 텍사스​​의 암 예방 연구소 부여, 그리고 웰치에 대한 지원 PRH에 기초 (I-1657). MB는 생물 의학 연구 및 PRH에서 전자와 그리어 GARSON Fogelson 학술 것은 UT 남서 의료 센터에 생물 의학 연구에 유진 맥 더못 학자이다.

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<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li>
<li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li>
<li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families%3A+Rab+GTPases+as+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li>
<li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li>
<li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+positive%2Fnegative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
</ol>

저자는 여기에 설명 된 기술에 관해서 어떤 경쟁 이익을 가지고 있지 않습니다.

생물 의학 연구에서 유전자 모델 생물의 힘은 크게 유전 조작을 위해 사용할 수있는 도구를 기반으로합니다. 작은 모델 C. 특히 엘레과 초파리는 다세포 개발이나 기능에 연루 전체 경로와 유전자 가족의 저렴하고 빠른 분자 유전 학적 분석을 허용합니다. 최근 몇 년 동안 초파리 14,15의 유전자를 조작하기위한 도구 개발에 상당한 진전을 보았다. 예를 들어, 널리 혈중 알코올 농도의 DNA 구조를 조작하는 마우스 유전학에서 사용되는 recombineering은 최근 P [acman] 벡터와 ΦC31 매개 ​​transgenesis 6의 사용을 통해, 초파리에 맞게되었다. 다른 선택의 카세트 재조합 능력이 박테리아 4,13를 사용하여 구조 내의 아무 곳이나 특정 서열의 삽입 또는 삭제 할 수 있습니다. 우리가 수정 한 원래 P [acman]가 구성을 위해 사용할 수 있도록 벡터 <em&gt; 초파리의</e...

자신의 내생 유전자 좌에서 단일 유전자의 분자 정의 된 조작을 청소하는 진핵 세포 생물학 관련 질문 수많은 연구에 귀중한 도구를 제공합니다. 초파리는 기능 상실 대립 유전자를 생성하는 유전자 기법을 역 Golić 선수와 동료에 도입 될 때까지 도전 할 수 입증했다 생체 내 유전자는 초파리 1-3에 상동 재조합을 사용하여 대상. 그들은 특정 게놈 유전자 좌가 통합 된 형질 전환 구조에서 DNA의 선형 조각을 사용하여 대상이 될 수 있습니다 보여 주었다. 이 선형 &quot;기증자&quot;DNA는 meganuclease I-SCEI와 선형화 다음 FRT-매개 재조합 (소비세에 원형의 분자와 같은 염색체에서 DNA)를 통해 생체 내에서 생성됩니다. 이 방법이 성공적으로 정의 된 병변의 다양한 생성하는 데 사용되었습니다 있지만, 기술은 병렬로 다수의 유전자의 조작에 쉽게 확장되지 않았기 때문에 각 indivi이중 녹아웃 구조는 독특하고 사용자 정의 디자인을 필요로합니다. 예를 들어, 완벽하게 고전적인 제한 효소 / 결찰 복제 또는 PCR뿐만 아니라, 생체 내 변환 벡터 전통의 크기 제한을 사용하여 체외에서 DNA (&gt; 5 개 KB)의 큰 조각을 조작하는데 어려움은 종종 대상 상동 재조합의 신속한 생성을 방해 벡터. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 끝 아웃 유전자가 효율적이고 비교적 빠른 플랫폼을 구축하는 방법론을 대상으로, DNA의 최대 100KB의 하위 복제 및 transgenesis 수 있습니다 recombineering / transgenesis P [acman] 시스템을 결합하는 초파리 유전자 타겟팅 용이하게합니다. 재조합 - 중재 유전 공학 (recombineering)는 4,5 강력한 상동 재조합 기반의 복제 기술입니다. 기존의 제한 효소 / 리가 복제 대조적으로, recombineering는 순서 나 SIZ에 의해 제한되지 않는다조작 된 DNA의 전자. Recombineering는 특별한 E.를 사용 결함 λ prophage 4에서 제공하는 재조합 기계를 품고 대장균 균주. 이 기술은 최근 초파리 6.7에서 사용하기 위해 채택되었다. 초파리에 Recombineering은 P [acman] 6,7이라고 수정 조건부 증폭 세균 인공 염색체 (BAC) 벡터에 의존합니다. OriV, 시퀀싱 및 배아 주입 기저 상태에서 낮은 사본 번호를 유지 오리스에 필요한 DNA의 대량의 정화를위한 화학 유도에 높은 사본 번호가 생성이 벡터는 두 가지 복제 기원을 수행합니다. 또한, P [acman] 벡터는 세균 첨부 (attB) 사이트가 장착되어 있습니다. attB 사이트는 초파리 게놈 8,9에서 소정의 방문 사이트에 큰 DNA 조각의 설립을 허용 ΦC31 integrase-매개 transgenesis위한 기판 역할을합니다. 우리는 끝 아웃 상동 재조합 10,11에 대한 대상 벡터로 사용할 수있는 P [acman] 벡터 (P [acman]-KO 1.0라고도 함) 생성 한. 시스템에 타겟팅 기술을 통합하는 끝을 밖으로 유전자, 우리는 2 FRT와 두 개의 I-SCEI 사이트를 추가했습니다. 우리는 또한 P [acman]-KO 1.0에 상동 팔을 통합하는 프로세스를 간소화하기 위해이 수정 된 벡터 내의 게이트웨이 카세트를 포함했다. 이 대상 벡터에 관심 거의 모든 게놈 영역을 소개하는 신속하고 간단한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜에서 우리는 P [acman]-KO 1.0 및 방법 내생 현장을 대상으로 생체 내에서이 벡터를 동원하는 방법을 사용하여 대상 벡터를 엔지니어링하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 목적을 위해 우리는 관심의 유전자를 대체하기 위해 RFP / 칸 카세트를 사용하지만 항생제 선택 마커를 포함하는 카세트의 다양한이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 우리는 카세트의 집합에 대한 설계하고 성공적으로 사용했습니다유전자 교체 및 태그 10,11.

<table><tbody><tr><td>SW102 재조합 가능 박테리아</td><td>NCI-Frederick</td><td>재조합 박테리아 (SW102, SW105 및 SW106)</td><td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx" target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td></tr><tr><td>TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>포함 CopyControl 유도 용액</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA 중합효소</td><td>Aligent Technology Inc.</td><td>600670</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean 젤 DNA 회수 키트</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>사용 Gateway BP ClonaseII 효소 키트</td><td>Invitrogen</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>P[acman]KO1.010</td><td>Buszczak 및 Hiesinger Labs</td><td>요청</td><td></td>시</tr><tr><td>pENTR RFP-Kan11</td><td>Buszczak 및 Hiesinger Labs</td><td>Upon 플라이</td><td></td></tr><tr><td>스탁</td><td>요청 블루밍턴 재고 센터</td><td>재고 번호: 25680, 25679</td><td>y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14의 Sb1</td></tr><tr><td>Electroporation 기계</td> PC 단위 <td>165-2662</td><td></td>큐벳 피셔 상표<td>를 가진 Biorad GenePulser Xcell</td></tr><tr><td></td><td></td><td>#FB101</td><td></td></tr></tbody></table>

에서 상동 재조합 구문을 recombineering<em&gt; 초파리</em

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

내생 유전자 좌위의 빠르고 대규모 조작 기술의 지속적인 발전은 인간의 질병 관련 연구를위한 유전자 모델 생물로 초파리의 사용을 확대 할 것이다. 최근 몇 년 동안 상동 재조합 recombineering 같은 기술 발전을 볼 수있다. 그러나 명백한 널 돌연변이 또는 태그 내생 단백질을 생성하는 것은 대부분의 유전자 상당한 노력이 남아있다. 여기, 우리는 생체 내에서 내생 궤적을 대상으로하고 조작하는 데 사용할 수있는 벡터를 생성하는 recombineering 기반 복제 방법을 사용하는 방법을 설명하고 보여 구체적으로, 우리는 세 가지 기술의 조합을 설립했습니다. (1) BAC의 transgenesis / recombineering ( 2) 끝 아웃 상동 재조합 (3) 게이트웨이 기술은 내생 게놈 유전자 좌를 조작하기위한 강력하고 효율적이며 유연한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 방법 (1) 디자인 individua에 대한 단계별 세부 사항을 제공L 벡터, (2) 간격 수리 (3) 방법 recombineering의 두 번째 라운드를 사용하여 이러한 벡터에서 관심의 유전자를 바꾸거나 태그를 사용하여 상동 재조합 벡터로 게놈 DNA의 큰 조각을 복제하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 또한 녹아웃, 또는 노크의를 통해 태그 유전자를 생성하기 위해 생체 내에서 이러한 카세트를 동원하는 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 쉽게 병렬로 여러 대상에 채택하고시의 적절하고 효율적인 방법으로 초파리의 게놈을 조작하기위한 수단을 제공 할 수 있습니다.

LA와 RA 상동 팔의 증폭은 500 bp의 제품을 생산해야하며, PCR-SOE 반응은 1.0 KB 제품 (섹션 2.1-2.4; 그림 2) 산출해야한다. 2.5 절에서 수행 BP 반응은 일반적으로 제품의 수율 평균 5-100 식민지의 매우 효율적이고 세균의 변형이다. 거의 PCR로 테스트 한 모든 식민지는 예상 PCR 제품 표시를 선택하십시오. recombineering의 첫 번째 라운드 (3 절) 동안 소화 P의 변환 후 20-40 식민지를 얻을 것으로 예상 [acman] SW102 세포로 LA와 RA 팔을 포함하는-KO-1.0. 이러한 클론 40-60 %가 원하는 재조합 제품을 수행한다. 모든 식민지가 같은 열 충격 세포에 비해 경우 비 열 충격 컨트롤은 거의 포함해야합니다. 샘플 및 제어 플레이트 모두 식민지의 같은 번호의 모양은 일반적으로 포경 플라스미드의 존재 또는 다른 오염 물질을 나타냅니다. 이 경우, 실험 수오LD는 삭제 및 반복,...

상동 재조합 기술은 크게 발전<em&gt; 초파리</em&gt; 분자 정확한 돌연변이의 생성을 가능하게함으로써 유전학. recombineering의 최근 채용 한 DNA의 큰 조각을 조작으로 그들을 변환 할 수 있습니다<em&gt; 초파리</em<sup&gt; 6</sup&gt;. 방법은 신속하게 대규모 상동 재조합 벡터를 생성하기 위해 이러한 기술을 결합하여 여기에 제시 하였다.

에서 상동 재조합 구문을 Recombineering<em&gt; 초파리</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

이 절차의 전반적인 목표는 내인성 oph 유전자 좌위를 타겟팅하고 조작하는 데 사용할 수 있는 대형 상동 재조합 벡터를 빠르게 생성하는 것입니다. 이는 먼저 관심 있는 게놈 영역을 포함하는 백 클론(back clone)을 선택함으로써 달성됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 상동 재조합 벡터에 상동 암(homology arms)을 클로닝하는 것입니다.세 번째 단계는 gap repair를 사용하여 게놈 DNA를 상동 재조합 벡터에 클로닝하는 것입니다. 마지막 단계는 게놈 영역을 타겟팅 카세트로 교체하는 것입니다. 궁극적으로, 이러한 절차를 통해 재조합 기반 기술을 사용하여 drosophila의 명확한 null 돌연변이를 생성하거나 내인성 단백질에 태깅을 하기 위한 Enzo 상동 재조합 타겟팅 벡터를 설계하게 됩니다.또한, 서면 원고에는 녹아웃 또는 녹인을 통한 태그 유전자를 생성하기 위해 이러한 카세트를 in vivo에서 어떻게 이동시키는지에 대한 프로토콜이 포함되어 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 여러 표적에 병렬적으로 쉽게 적용할 수 있으며, oph 게놈을 적시에 효율적으로 조작할 수 있는 수단을 제공한다는 점입니다. 이 목표를 달성하기 위해, 본 방법은 재조합 및 gateway 기술을 결합하여 상동 재조합 벡터를 생성합니다.기존의 제한효소 및 리가아제 클로닝과 달리, 이러한 기술들은 DNA의 크기나 서열에 제한을 받지 않으므로 클로닝 과정을 용이하게 합니다. 본 프로토콜에서는 유전자 녹아웃을 위한 타겟팅 카세트를 제작하는 방법을 설명하지만, 이는 사실상 원하는 어떤 방식으로든 내인성 유전자좌(locus)를 조작하는 데 사용될 수 있습니다. 여기에는 관심 유전자의 태깅, 관심 유전자를 GAL4로 교체, 또는 단백질 절단이나 리포터 라인 제작이 포함됩니다. 관심 유전자인 CG 3 2 0 9 5가 포함된 벡터를 획득하십시오.이 예제에서는 gene@flybased.org에서 유전자를 검색합니다. 백(backs) 목록을 얻으려면, stocks and reagent 섹션 아래에서 genomic clones라고 명명된 섹션을 확인하십시오.사용 가능한 옵션 중에서 관심 유전자의 상류(upstream)로 최소 10 kilobases, 하류(downstream)로 5 kilobases를 포함하는 클론을 찾으십시오. 이 영역들은 상동성 암(homology arms)으로 사용됩니다. 이는 백본의 5' 말단

recombineering-homologous-recombination-constructs-in-drosophila

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

이 비디오에서는 방사선 표지된 프로브를 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈에서 상동 재조합 이벤트를 식별하는 Southern blotting 기술에 대해 설명합니다. 상동 재조합 이벤트를 포함하는 DNA 영역은 프로브 결합 DNA를 포함하는 막이 X선에 노출될 때 뚜렷한 띠로 나타납니다.

마우스 배아 줄기 세포 게놈에서 상동 재조합을 검출하기 위한 서던 블로팅(Southern Blotting)

유전자 표적화 방법론을 사용하여 knockout, knock-in 및 tagged 대립유전자가 있는 형질전환 마우스를 생성할 수 있습니다.  여기에서는 E. coli에서 재조합하는 개선된 방법, 즉 'subcloning plus insertion'이라고 하는 재조합 방법을 설명하며, 이는 맞춤형 유전자 표적화 벡터를 빠르게 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

서브 클로닝 플러스 삽입 (SPI) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 Recombineering 방법

이 프로토콜은 초파리의 눈 / 더듬이 가상적인 디스크 (EAD에게)에서 형광 표시, 유 전적으로 정의 클론 종양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 세 번째 령 유충과 방법을 시각화하고 유전자 발현 변화와 종양 침입을 정량화를 처리하는 방법에서 EAD 뇌를 해부하는 방법에 대해 설명합니다.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

단백질은 종종 다른 세포 기능을 발휘할 수있는 여러 도메인을 포함한다. 유전자 녹아웃 (KO)이 기능의 다양성을 고려하지 않는다. 여기, 우리는 다양한 기능 영역 또는 단백질의 변이의 분자 해부를 허용 KO 배아 줄기 세포에서 재조합 중재 카세트 교환 (RMCE) 기반 구조 - 기능 접근 방식을보고합니다.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

여기, 우리가 첫 번째 코딩 exon 유전자의 전사 드라이버 대체 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 방법 제시. CRISPR/Cas9-기반 방법 대체 유전자의 생 규칙에서 transactivator 시퀀스를 장소 따라서 유전자 특정 spatiotemporal 패턴에 독점적으로 transctivator 식을 촉진 한다.

게놈을 편집 하 여 초파리 에서 조직 관련 이진 전사 시스템을 생성 하기 위한 효율적인 전략

여기, 우리 남부 럽 그리고/또한 PCR를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 발생 하는 동종 재결합 이벤트를 식별 하는 데 자세한 프로토콜 제시. 이 메서드는 nonmuscle myosin II 유전자 대체 마우스 모델 기술을 사용 하 여 전통적인 배아 줄기 세포 기반 동종 재결합 중재 대상의 세대에 의해 exemplified입니다.

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

이 프로토콜의 목표는 인간 질병과 관련된 희귀 유전자 변이체의 기능적 결과를 평가하기 위해 Drosophila melanogaster에서 생체 내 실험의 설계 및 성능을 설명하는 것입니다.

Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

이 논문은 초파리의 phiC31 인테그라제 매개 형질전환효소를 예로 들어 형질전환파리를 생성하기 위한 중요한 단계인 배아 미세주입에 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

초파리의 형질전환을 위한 배아 미세주입

Drosophila에서 Wolbachia 세균 감염

배우세요 초파리에서 상동 재조합 벡터를 생성하는 재조합 기법을 활용한 유전자 조작 방법입니다. 이 기술은 정밀한 널 돌연변이 생성과 내인성 단백질 표지에 활용됩니다.

에서 상동 재조합 구문을 Recombineering

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