Name: 소설 생체 문화 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 배우세요 생체 외 배양을 위한 생쥐 태아 심장 절제 및 배양 방법으로, 희석된 Matrigel에서 장기간 관찰이 가능합니다. 이 기술은 심장 발달 및 선천성 심장 결함 연구에 활용될 수 있습니다.

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우리는 중요한 원고의 읽기 및 자금 지원을위한 NIH (부여 # R01HL061656)의 안드레아 포트 베리에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 배아의 마음을 절개 <ol><li> 승인 안락사 기술을 사용하여 원하는 배아 일에 시간 초과 임신 마우스를 안락사. 모든 실험은 채플 힐에서 노스 캐롤라이나 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. </li><li> 대충 해부하기 전에 70 % 에탄올로 여성 스프레이. 자궁을 검색하고 소비세하는 여성의 복강을 엽니 다. </li><li> 차가운 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)와 필요에 린스를 포함하는 페트리 접시에 자궁을 놓습니다. 첨부 된 배아 주머니를 노출 정중선을 통해 자궁을 열고 잘라. </li><li> 배아 주머니를 열고 잘라 배아를 검색 할 수 있습니다. 차가운 PBS로 두 번째 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 얼음 자궁 경적 페트리 접시를 돌려줍니다. </li><li> 가슴 벽에 대한 액세스를 개선하기 위해 태아의 목을 베십시오. 유전자형이 필요한 경우, 제거하고 얼음에 배치 에펜 도르프 튜브에 꼬리를 저장합니다. </li><li> 와그것의 뒤에 태아는 심장과 폐를 시각화하는 가슴 벽을 열고 잘라. 단계에 따라 가슴 벽이 투명 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 집게를 사용하여 마음을 들어 올려 아래의 혈관을 잘라. 그런 마음을 해방하는 큰 그릇 위에 잘라. 필요한 경우, 불필요한 조직을 제거합니다. </li><li> 차가운 PBS로 가득 찬 24 잘 접시의 잘 하나에 마음을 놓고 얼음에 접시를 놓습니다. </li><li> 마음은 모든 배아에서 적출 될 때까지 이전 단계를 반복합니다. </li></ol> 2. 문화 셋업 <ol><li> 층류 후드에 1:1 비율로 차가운 리겔하고 원하는 문화 매체 (Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM) 예를 들면 10 % 태아 소 혈청 (FBS)) 결합. 미리 따뜻한 문화 매체하지 않습니다. </li><li> 얼음도 얼음에 유지되는 24 잘 배양 접시의 잘으로 희석 용액의 피펫 500 ~ 1,000 μL의 희석 마트 리젤을 유지. </li><li> 후드에서 신중하게 픽업과 절제를 배치마트 리젤 함유 배양 접시의 잘 심장 얼음에 문화 접시를 유지하면서. </li><li> 임베디드 마음의 방향이 매우 중요합니다 경우 대충 70 % 에탄올로 거꾸로 현미경과 주변 공간을 스프레이. 후드 반면, 여전히 얼음 마트 리젤 함유 문화 판의 잘 절제의 마음을 놓으십시오. 그런 다음, 현미경 플레이트를 배치하고 신속하게 방향을 절제 마음을 마트 리젤이 응고하기 시작. </li><li> 가습 37 ° C 배양기 (5 % CO 2)에 배양 접시를 놓고 마트 리젤 약 30 분 동안 응고 할 수 있습니다. </li><li> 잘 마음을 포함하는 각에 1 ML 미리 예열 문화 매체를 추가합니다. </li><li> 마음은 적어도 나흘 문화에 남아있을 수 있습니다. 배지 2 일마다 변경하는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. 고정 및 시각화 <ol><li> 원하는 경우, 살아있는 마음을 시각화하기 위해 (예를 들어 SYTO-16) 형광 라이브 세포 염료를 추가합니다. 사진이 될 것입니다이 포함되었을 때의 위치에 따라 볼 수있는 마음의 측면에 제한됩니다. </li><li> 후 배양 분석 (예 : 전체 마운트 영상 또는 단면)을 수행 할 경우, 배양액을 제거하고 차가운 4 % 포름 알데히드로 교체합니다. 30 분 동안 얼음에 접시를 놓습니다. </li><li> 차가운 포름 알데히드와 얼음 마트 리젤의 용해를 촉진 한 후, 신선한 포름 알데히드와 (과 마트 리젤) 정착액을 교체하고 4에서 하룻밤 마음 ° C.를 해결 </li><li> 4 ° C까지 추가 분석에서 버퍼 (예 : PBS 또는 트리스) 및 저장과 마음을 씻으십시오. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

현재 문화권 시스템은 마우스 배아 심장 연구에 상당한 이점을 포즈. 이 문화 시스템도 문화 사일 후 괴사의 제한 징후와 심근 수축력과 관상 동맥 신경총을 보존합니다. 또한, 반 고체 매트릭스 문화 동안 자리에 코팅 구슬을 보유하는 것이 계약의 유연성을 허용하면서 개발 중심의 3 차원 형태를 유지하기 위해 충분한 지원합니다. 이러한 지원에도 불구하고,이 행렬은 살아있는 마음의 형광 분석을 허용하는 등 SYTO 16 개의 형광 염료 투과이다. 슬라이스 문화 방법은 모세관 작용에 7을 통해 산소를 유지하기 위해 공기 - 액체 계면에서 다공성 막에, 관상 동맥 신경 얼기의 그것의 부분을 포함, 심장 섹션을 배치합니다. 반면, 이전의 온 마음 배양 방법은 기능 관상 동맥 vasculat하기 전에 배아 나이에 락과 제한된 연구에 의존URE는 2,3,5이 필요합니다. 관상 동맥 신경 얼기는 공기 - 액체 인터페이스의 복잡성없이 형성 한 후 현재의 기...

최근 몇 년 동안, 형질 전환 마우스의 개발 심장 결함을 공부 지배적 인 모델 시스템이다. 그러나, 제브라 피쉬와 같은 다른 모델 생물은 마우스에 비해 상당한 장점을 가지고 입증했다. 제브라 피쉬의 세 가지 주요 장점은 배아에 대한 접근의 용이성을 위해, 계란의 외부 누워있다, 심장 개발을 쉽게 시각화 할 수 배아의 광학 투명성, 그리고에 작은 분자 치료를 적용의 용이성은 배아의 발달을 조절 1. 따라서, 배아 기관의 전직 자궁 내 성장을 허용하는 문화 기술의 발전은 적어도 부분적으로 제한 현재 형질 전환 생쥐의 발달 과정을 공부하는 연구자에 의해 경험 우회 것이다. 생체 심장 배양 시스템은 DIF 방법 작은 분자 및 분석 치료를 허용하는 병아리와 마우스 배아 모두에서 개발 된마음의 ferent 지역은 2-6 통신합니다. 전체 마우스 심장 문화, 마음 배아로 배아에서 채택 (E) 연령 12.5 흔들 2,3,5의 유무에 관계없이 배지에 배치 할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 배아 마음은 성공적 E13.5의 동등성을 배양하고 있고, 흔들 배양 마음은 오랫동안 3 일 (5 E10.5에서 시작) 3로 유지되고있다. 그러나, 연구는 이전 배아에서 마음의 성공적인 문화를보고있다. 마찬가지로, 구조 실험은 배양 배지 2 전 세계적으로 치료제를 적용 제한되었습니다. 마음은 절제 내장하고 vibratome를 사용하여 절편되는 슬라이스 문화 시스템은, 또한 E12.5 마우스 마음과​​ 햄버거 - 해밀턴 단계 36 (약 E16 마우스) 병아리 마음으로 두 어린 마음에 활용 된 이러한 출생 후 성인 마우스를 H로 2,4,6, 세 마음,earts 성인 인간의 마음 7,8. 배아 분석은 일반적으로 150 μm의 두께 섹션 2.4을 활용하고 있지만, 단면의 두께는 산소 부족 8 증거도없이 큰 500로 μm의 수 있습니다. 이러한 슬라이스 문화는 대부분 조각이 기간 9 내내 수축성 유지 보수와 문화 2 개월만큼 유지되고있다. 고립 된 심근의 연구에 비해, 이러한 슬라이스 문화는 이웃 세포 ​​유형과 심근의 공동 문화를 허용하고 생체 분석을위한 유용한 방법을 제공합니다. 그러나, 이러한 문화는 단순히 문화 매체의 마음을 (예 : vibratome에서 단면의 살아있는 심장을 포함) 배치보다 더 정교한 셋업이 필요하며 모든 분석은 분명 섹션에서 마음의 부분으로 제한됩니다. 제한 배양 배아 마우스 마음과​​ 형질 전환 생쥐 AVA의 재산에 대해 위에서 설명한 주어연구 ilable, 우리는 위버에 의해 개발 된 생체 폐 배양 시스템과 유사한 생체 마우스 심장 배양 시스템을 개발 하였다. 10 우리의 문화 시스템은 전체 배아 마우스 마음에서 리모델링 관상 동맥 순환의 장기 문화와 시각화를 허용합니다. 또한, 마트 리젤의 사용에 따라서 치료 에이전트와 지역화 된 치료를 제공, 구슬이 심장에 가까운 장소에서 개최 할 수 있습니다. 이 실험은 관상 동맥 형성 등의 과정에서 주어진 치료의 효과를 비교하기 위해 다른 개발 시점에서 수행 할 수 있습니다. 작은 분자는 리겔을 통해 확산 할 수 있기 때문에,이 문화 시스템은 또한 특정 세포 - 세포 연락처가 특정 개발 프로세스에 필요하거나 다른 한 지역에서 paracrine 신호가 있는지 여부를 확인하는 서로 가까이 심장의 문화를 해부 지역에 사용할 수 있습니다 필요. 이 배양 시스템비교적 간단하고, 슬라이스 문화 시스템과는 달리, 기본적인 문화 시약 및 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 수있는 셋업을 사용합니다. 간단히, 절개 배아의 마음은 반 고체 지원을 제공 희석 리겔에 배양한다. 이 지원은 계약의 마음을 허용하면서 심장의 3 차원 형태를 유지하기에 충분합니다. 이 시스템을 사용하여, 이전 마우스 배아 (E14.5-E16.5)의 전체 마음은 최대 네 개의 일을위한 문화 유지 될 수 있습니다. 전체 관상 동맥 혈관 따위는 슬라이스 문화 달리, 유지, 그래서 마음의 다른 지역에서 발생하는 신호 단서가 존재 남아있다. 또한, 살아있는 세포 형광 염료는 살아있는 마음의 시각화를 허용하도록 마트 리젤을 침투 할 수 있고, 단백질 복합 구슬 지역화 된 신호 소스를 제공하기 위해 심장 근처에 배치 할 수 있습니다. 함께, 이러한 장점은이 기술에게 embryon의 발달 과정을 연구하기위한 이상적인 방법을IC 마우스 마음입니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Timed-pregnant 마우스</td><td></td><td></td><td>관심 배아 단계에서 해부</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>성장 인자 감소 Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>13 </td></tr><tr><td>24웰 배양 플레이트</td>의 지시에 따라 사용 <td>Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Stereoscopic microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr></tbody></table>

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

마우스 발달 연구는 임신 기간 동안 태아의 어려움에 의해 방해된다. 따라서, 프로토콜은 분리하고 그 문화를 개별 기관이 모두 발달의 변화를 시각화하고 있도록 새로운 치료 전략의 방법을 제공하는 것이 필수적이다. 임신의 후반 단계에서 배아 심장의 장기 문화를 촉진하기 위해, 우리는 절제 마음이 반 고체, 희석 리겔에 배양되는 프로토콜을 개발했다. 이 기판은 3 차원 구조를 유지하기 위해 충분한 지원 제공하지만 지속적인 수축을 허용 할만큼 충분히 유연합니다. 간단히 말해서 마음이 배아에서 절제와 추위 마트 리젤의 혼합물에 배치 성장 매체로 1:1 희석. 희석 마트 리젤이 굳은 후 성장 배지 배양 접시에 추가됩니다. 배아 일 16.5로 늦게 절제의 마음 나흘 후 해부 가능한 하였다. 관상 동맥 신경 얼기의 분석이 방법은하지 않는 것을 보여줍니다관상 동맥 혈관 발달을 방해. 따라서, 우리는 배아 마음의 장기적인 문화의 새로운 방법을 제시한다.

이 기술을 사용하여, 마음은 3 차원의 형태를 유지하고 가능한 유지 등의 지속적인 수축 (동영상 1)로 표시. 이러한 수축은 심실에 비해 심방에서 지속적으로 더 유명하다. 문화에 따라, 마음은 고정 및 처리 특정 마커 식 또는 구조를 검사하는 면역 또는 조직학도합니다. 그림 1A는 고정, 24 시간 동안 배양 한 배아 마우스 심장의 심실과 대 혈관의 기초를 보여줍니다 대해 처리 할 수 있습니다 내피 세포의 레이블에 면역. 이 공 초점 현미경은 관상 동맥 혈관이 자궁 (그림 1B)에서 유지되었다 비교적 나이 배아에서 적출 심장 비슷 나타납니다 보여줍니다. 그러나 마음 교양 전직 생체 내에서 관상 동맥 혈관 자궁에서 유지 된 심장보다 작게 나타납니다 않습니다. 모두의 마음에, 일심실의 전자 apices은 조직에 항체의 더 나은 액세스를 허용하려면 제거되었습니다. <p class="jov...

마우스 발달 연구는 임신 기간 동안 태아의 어려움에 의해 방해된다. 임신의 후반 단계에서 배아 심장의 장기 문화를 촉진하기 위해, 우리는 절제 마음이 반 고체, 희석 리겔에 배양되는 프로토콜을 개발했다.

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

본 절차의 전반적인 목적은 ex vivo 배양을 위해 배아 심장을 적출하는 것입니다. 먼저 임신한 암컷 생쥐로부터 자궁각을 회수함으로써 이를 수행합니다. 그다음, 배아를 회수하여 해부를 준비합니다.그런 다음 배아의 흉벽을 절개하여 심장을 시각화합니다. 마지막으로, 심장을 적출하여 희석된 matrigel이 담긴 배양 웰에 넣습니다. 최종적으로 명시야 현미경으로 관찰함으로써 건강한 살아있는 심장의 결과를 얻을 수 있습니다.로킹 배양(rocking cultures)과 같은 다른 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 비드에 접합된 단백질과 같은 국소 제제 또는 마트리젤(matrigel)에 소분자를 첨가하는 것과 같은 전신 제제로 심장을 처리할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 의의는 심장의 특수 분절 내에서 발생하는 사건들을 온전한 장기 전체의 맥락에서 조사할 수 있게 함으로써 심혈관 질환 치료로까지 확장될 수 있다는 것입니다. 원하는 배아 일수에 맞춘 임신한 마우스를 안락사시킨 후, 소속 기관에서 승인된 기술을 사용하여 복강을 열고 자궁각을 회수 및 절제하기 전에 암컷 마우스에 70% ethanol을 충분히 분무하십시오.자궁각을 차가운 1x PBS가 들어 있는 페트리 접시에 넣고 세척합니다. 해부할 때까지 접시를 얼음 위에 둡니다. 그런 다음 자궁각의 중앙선을 따라 절개하여 부착된 배아낭을 노출시킵니다.배아낭을 절개하고 배아를 차가운 PBS가 담긴 두 번째 페트리 접시에 옮깁니다. 자궁각이 들어 있는 접시를 얼음 위에 둡니다. 배아의 머리를 제거한 후, 배아를 등으로 눕혀 절개합니다.심장과 폐를 관찰하기 위해 흉벽을 엽니다. 단계에 따라 흉벽이 투명할 수 있습니다. 유전자형 분석을 수행할 예정이라면 배아의 꼬리를 보존하십시오.포셉을 사용하여 심장을 조심스럽게 들어 올리고 아래쪽 혈관들을 절단합니다. 그런 다음 대혈관 위쪽을 절단하여 심장을 분리합니다. 필요한 경우, 주변의 불필요한 조직을 제거합니다.차가운 PBS로 채워 얼음 위에 놓인 24-웰 디쉬의 한 웰에 심장을 넣습니다. 해부를 반복하여 모든 배아 심장을 분리합니다. 층류 후드 내에서 희석된 matri gel을 얼음 위에 유지하면서, 차가운 matri gel과 원하는 배양액을 1:1 비율로 혼합합니다.24-웰 배양 접시의 각 웰에 용액 500~1000 µL를 피펫으로 분주합니다. 이를 얼음 위에 둡니다. 적출된 심장을 조심스럽게 집어 매트리겔이 포함된 배

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연구

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Biology

생물학

우리는 마우스 배아 피부의 해부와 생체의 문화를 설명합니다. 배양 시스템은 조직 표면에 걸쳐 공기 - 액체 계면을 유지하고 거꾸로 현미경의 이미징을 허용한다. Melanoblasts, 개발 피부의 구성 요소는, 형광 그들의 행동은 공 초점 현미경을 사용하여 관찰 할 수 있도록 표시되어 있습니다.

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

우리는 (E) 9.5 및 이후 단계 배아 일에 마우스 배아 내의 배아 또는 다 능성 세포로부터 유래 된 내인성 및 그래프트 세포의 세포 운명 및 표현형 모두를 모니터하기 위해, 염료를 주입하는 DNA 벡터, 바이러스, 세포를 일련의 방법을 설명 개발.

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

선천성 심장 결함으로 이어지는 돌연변이는 발달 중 심장 구조에 대한 생체 내 조사의 이점을 얻지만, 마우스 배아 심장에 대한 고해상도 구조 연구는 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 발달 중인 마우스 심장의 심근세포 특이적 구조를 평가하기 위한 강력한 면역형광 및 이미지 분석 방법을 제시합니다.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

여기에서는 외성장 배양 분석으로 일차 마우스 심외막 세포를 분리하고 생체 외 심장 배양 시스템을 사용하여 표피 유래 세포(EPDC)의 기능적 이동을 평가하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 EMT(epicardial epithelial-to-mesenchymal transition) 및 운동성의 유전적 및 화학적 조절자를 식별하는 데 적합합니다.

심 외막 파생물 문화 분석 및<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 심 외막 유래 세포 마이그레이션 평가

처음으로 우리는 발달 중인 심장 ex ovo에서 혈역학을 변경하기 위한 재현 가능한 밴딩 절차를 제시합니다. 이것은 유출로(OFT)를 부분적으로 수축시킴으로써 달성됩니다.

소설<em&gt; 예 비켜</em&gt; 밴딩 기법 닭 배아 시스템에서 심장 내 혈류를 변경할

외막은 심혈관 발달 및 재생에 필요한 다능성 심혈관 전구 세포와 부분비 인자의 필수 공급원입니다. 여기에서는 마우스 배아 심외막 세포를 배양하는 방법을 설명합니다.

마우스 배아 심장에서 심 외막 세포의 체외 배양에서

이 방법에서는, 배아 심장 조직 microdissected, 해리, 붙일 레이블 및 호스트 배아 조직으로 이식 수술이 있습니다. 이 개인 또는 조직 수준 발달 조직 아래 소성 hemodynamic 조건 및/또는 변경된 paracrine/juxtacrine 환경 공부를 위한 플랫폼을 제공 합니다.

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

우리는 프로토콜 검사 실의 특정 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부 마우스 배아에 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 심장 개발을 제시. 이 방법을 직접 노동 집약적인 조직화 학적인 방법 없이 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 형성의 각 단계를 시각화 수 있습니다.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

본 프로토콜은 생체외 신생아 뮤린 심장의 대동맥 캐뉼레이션 및 역행 관류를 기술한다.  해부 현미경과 무딘 작은 게이지 바늘을 사용하는 두 사람 전략은 신뢰할 수있는 통조림을 허용합니다. 종방향 수축 장력의 정량화는 좌심실의 정점에 연결된 힘 변환기를 사용하여 달성된다.

Langendorff 준비에서 신생아 뮤린 하트의 사용을위한 수정 된 기술

우리는 심장 전구 세포의 3D + 시간 이미징을 가능하게 하는 마우스 배아 배양 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비디오 툴킷은 텍스트 전용 출판물에서 얻기 어려운 성공적인 라이브 이미징에 필요한 핵심 기술을 다룹니다.

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

이 프로토콜은 발달 중인 마우스 심장에서 심장 세포의 전기천공법 기반 형질전환(transgenesis)을 위한 상세한 방법론적 프레임워크를 제시합니다. 여기에 제공된 비디오 자산은 이 다재다능한 기술을 쉽게 배울 수 있습니다.

마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

배우세요 생체 외 배양을 위한 생쥐 태아 심장 절제 및 배양 방법으로, 희석된 Matrigel에서 장기간 관찰이 가능합니다. 이 기술은 심장 발달 및 선천성 심장 결함 연구에 활용될 수 있습니다.

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