소설 생체 문화 방법

이 절차의 전반적인 목표는 생체 외 배양을 위해 배아 심장을 절제하는 것입니다. 이것은 먼저 임신한 암컷 쥐에서 자궁 뿔을 채취함으로써 이루어집니다. 다음으로, 배아를 채취하여 해부를 준비합니다.

그런 다음 배아의 흉벽을 열어 심장을 시각화합니다. 마지막으로, 심장을 절제하여 희석된 마트리겔이 함유된 배양 우물에 넣습니다. 궁극적으로 명시야 현미경으로 관찰하여 건강한 살아있는 심장을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

rocking culture와 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 심장을 bead에 접합된 단백질과 같은 국소 제제 또는 matrigel에 작은 분자를 추가하는 것과 같은 전역 제제로 치료할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 심장의 특정 부분 내의 사건을 온전한 전체 기관의 맥락에서 검사할 수 있기 때문에 심혈관 질환 치료로 확장됩니다. 원하는 배아 날에 임신한 쥐를 안락사시킨 후, 해당 기관에서 승인한 기술을 사용하여 복강을 열고 자궁 뿔을 꺼내 절제하기 전에 암컷에게 70%의 에탄올을 자유롭게 분사합니다.

자궁 뿔을 차가운 XPBS가 들어있는 페트리 접시에 넣고 헹굽니다. 해부할 준비가 될 때까지 접시를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 정중선을 통해 자궁 뿔을 잘라 부착된 배아 자루를 드러냅니다.

배아 자루를 잘라 열고 차가운 PBS가 있는 두 번째 페트리 접시에 배아를 넣습니다. 자궁 뿔이 있는 접시를 얼음 위에 놓습니다. 배아의 목을 베인 후 배아를 등에 눕히고 자릅니다.

흉벽을 열어 심장과 폐를 시각화합니다. 스테이지에 따라 흉벽이 비쳐 버릴 수 있습니다. 유전형 분석을 수행해야 하는 경우 배아의 꼬리를 저장하십시오.

겸자를 사용하여 심장을 조심스럽게 들어 올리고 아래의 혈관을 자릅니다. 그런 다음 마음을 자유롭게 하기 위해 큰 그릇 위를 잘라냅니다. 필요한 경우 외부 조직을 제거하십시오.

차가운 PBS로 채워진 24개의 우물 접시 중 한 우물에 심장을 넣고 얼음 위에 놓습니다. 모든 배아 심장을 분리하기 위해 해부를 반복합니다. 층류 후드에서 차가운 마트리 겔과 원하는 배양 배지를 1:1 비율로 결합하면서 묽은 마트리 겔을 얼음 위에 유지합니다.

500-1000 마이크로 리터의 용액을 24 웰 배양의 웰에 피펫팅합니다. 얼음에 접시를 담습니다. 절제된 심장을 조심스럽게 골라 배양 접시가 들어 있는 마트리겔의 개별 우물에 넣습니다.

내장된 심장의 방향이 중요한 경우 70% 에탄올을 사용하여 도립 현미경과 주변 공간에 자유롭게 분사합니다. 그런 다음 후드에서 작업한 후 얼음 위의 매트 젤의 우물에 심장을 넣습니다. 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 매트 젤이 응고되기 시작할 때 심장의 방향을 빠르게 잡습니다.

배양 접시를 가습된 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 마트리 겔이 약 30분 동안 응고되도록 합니다. 심장이 들어있는 각 웰에 중간 크기의 예열 배양액 1 밀리리터를 첨가하십시오. 심장은 적어도 4일 동안 문화에 남아 있을 수 있습니다.

원하는 경우 cyto 16과 같은 형광 살아있는 세포 다이를 추가합니다. 라이브 심장을 시각화하기 위해 사진은 심장이 삽입된 위치에 따라 보이는 심장의 측면으로 제한됩니다. 전체 마운트 이미징 또는 절편을 수행할 경우 배양 배지를 제거합니다.

차가운 포름알데히드 4%로 대체하고 얼음 위에 30분 동안 접시를 올려 놓습니다. 마트리겔이 용해된 후 고정제와 마트리겔을 새 포름알데히드로 교체하고 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 심장을 고정합니다. PBS 또는 Triss로 심장을 씻고 추가 분석이 있을 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오.

생체 외에서 24시간 동안 배양하면 관상동맥 혈관 구조는 여기에서 볼 수 있듯이 자궁에서 유지된 비교적 나이가 많은 배아에서 절제된 심장과 유사하게 보입니다. E 16.5에서 절제하고 4일 동안 생체 외에서 배양한 심장에 대한 Hemat, toin 및 eoin 분석은 대동맥 벽과 심장의 심실 및 심실 중격 심근을 포함한 전반적인 형태가 순환 부족에도 불구하고 손상되지 않은 상태를 보여줍니다. 관상동맥 골은 화살촉으로 표시된 것처럼 분명합니다.

그러나 화살표로 표시되고 h와 d 및 DAPI로 관찰된 DNA 단편화는 소형 심근과 대혈관 주변에서 분명합니다. 더욱이, 심근은 체외 배양 심장이 여전히 박동하고 있음에도 불구하고 자궁에서 발달한 E 18.5 배아의 심장에 비해 밀도가 낮습니다. 따라서 이러한 심장이 유지될 수 있는 기간이나 단계에는 제한이 있습니다.

이 배양 기술은 또한 심장을 형광 라벨링하는 데 사용할 수 있으며, 배양 후 내피 특정 형광 염료로 하트를 48시간 동안 배양할 수 있습니다. 이 경우 시각화는 심장의 방향과 조직의 불투명도에 따라 제한됩니다. 심실 심근을 통한 후속 조직학적 절편은 cyto 16이 외부 세포층을 관통하여 심실 내의 심하 혈관을 표지할 수 있음을 확인하고 여기에서 입증된 바와 같이 is selectin과 공동 국소화할 수 있음을 확인합니다.30시간 동안 생체 외 배양 후 E 14.5 배아에서 절제된 심장은 심방과 심실 사이에서 일관된 수축성과 페이싱을 보여줍니다.

이 기술을 수행할 때 심장을 절제할 때 부드럽고 조심하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 배아 마우스 심장을 절제하고 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.