소설 고해상도

본 절차의 전반적인 목적은 정상 뇌 및 뇌종양 관련 혈관으로의 시간 경과에 따른 모집 패턴을 따라 골수 유래 전구세포의 고해상도 단일 세포 이미지를 얻는 것입니다. 이는 공여 마우스에서 경골과 대퇴골을 제거하여 형광 표지된 골수 전구세포를 얻은 다음, 해당 세포를 방사선 조사를 받은 수용 마우스에 주입함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 두개창 챔버 내부의 키메라 마우스에서 두개강 내 GB M 이종 이식편을 생성하는 것입니다.

다음으로, 마우스에 입체정위 유도 방사선을 포함한 다양한 치료 요법을 실시합니다. 마지막 단계는 이광자 공초점 현미경으로 마우스를 이미징하는 것입니다. 궁극적으로, 이 방법론은 다양한 모델에서 두개강 내 혈관 형성 메커니즘을 동적으로 연구하는 데 활용될 수 있습니다.

ex vivo 조직의 조직병리학과 같은 기존 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 뇌 내 혈관 형성과 관련된 결정적인 역동적 정보를 연구할 수 있다는 점입니다. 이를 통해 두개내 신생혈관 형성 기전과 관련된 핵심적인 질문들에 답할 수 있습니다. 이 방법은 두개내 신생혈관 형성에 대한 통찰을 제공하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 두개내 허혈이나 뇌졸중, 신경퇴행성 질환 및 뇌로의 종양 세포 전이 기전과 같은 뇌의 다른 체계 및 질병 과정에도 적용될 수 있습니다.

본 영상의 목적상 엄격한 무균법을 따를 수 없었습니다. 이에 따라 시청자가 실험 절차의 방향을 더 명확하게 파악하고 상세히 볼 수 있도록, 생물안전 작업대(biosafety hood)의 개구부를 12 inch 이상으로 넓게 열어두었으며 동물에 드레이프를 씌우지 않았습니다. 실제 실험 시에는 무균법을 엄격히 준수해야 합니다.

GFP 공여 마우스의 형광 발현을 확인하는 것으로 이 절차를 시작하고, 기관 동물 보호 위원회 가이드라인에 따라 안락사시킵니다. 다음으로, 무균 상태에서 양쪽 뒷다리를 세척하고 경골과 대퇴골을 적출합니다. 뼈에 붙어 있는 모든 불필요한 조직을 제거합니다.

그런 다음 추출한 4개 뼈의 양 끝에서 엔드 플레이트(end plates)를 제거합니다. 22게이지 바늘과 1 mL의 멸균 PBS를 사용하여 내부를 세척합니다. 골수가 모두 씻겨 나가면 뼈가 투명하게 변합니다.

그 후, 추출한 골수 현탁액을 혼합합니다. 이때, 호스트 마우스 3마리를 재구성하기에 충분한 양인 약 20 million cells가 포함되어 있어야 합니다. 다음으로, 27 gauge 투베르쿨린 바늘 3개를 준비하고 각각의 바늘에 골수 현탁액 300 µL를 흡입합니다.

마우스를 보정기에 위치시킨 상태에서, 방향을 잡기 위해 꼬리의 등쪽 표면을 표시합니다. 그다음, 이전에 조사를 마친 마우스 3마리의 꼬리 외측 정맥에 현탁액을 주입합니다.

무균 조건 하에 본 절차에 따른 nod skid 마우스를 준비합니다. chimeric 골수 nod skid 마우스를 마취시키고, IACUC 승인을 받은 선제적 진통제를 투여합니다. 각막 탈수를 방지하기 위해 티어 젤(tear gel)을 도포합니다.

먼저 Betadine 용액으로 머리를 세척한 다음, 알코올로 세척하고 과도한 털을 제거합니다. 그 후 알코올을 사용하여 하부의 두피를 추가로 세척합니다. 양쪽 귀의 중간 지점에서 눈 바로 위까지 절개합니다.

첫 번째 절개 부위 양측의 두피를 제거하여 하부 두개골이 약 5 mm 정도 드러나게 합니다. 그다음 두개골 표면의 해부학적 지표를 확인합니다. 이어서 epinephrine이 함유된 2% lidocaine 용액을 주입하여 골막을 확인하고 들어 올립니다.

그 후 날카로운 도구를 사용하여 골막을 두개골 표면에서 박리합니다. 그런 다음 2.7 millimeter TR refine drill을 사용하여 Lambda와 bgma로부터 동일한 거리에 있는 두개골 우반구의 2.7 millimeter 원형 골편 부위를 약화시킵니다. 이때 하부의 경막과 조직을 보호하기 위해 드릴로 뼈를 관통하지 않도록 주의하십시오.

이제 박리 도구, 핀셋, 치과용 훅을 사용하여 약해진 골편을 신중하면서도 조절된 힘으로 제거합니다. 다음으로, 30 gauge Hamilton 시린지에 10 µL의 세포 현탁액을 충전하고 바늘을 정위 고정틀에 배치합니다. 그런 다음 마우스를 정위 고정틀에 고정합니다.

바늘을 이후 생성된 윈도우의 중심점에 맞춘 다음, 바늘이 피질 표면에 닿을 때까지 내립니다. 그런 다음 디지털 좌표를 리셋합니다. 이제 바늘을 피질 조직 내부로 3.2 millimeters만큼 내립니다.

그다음 0.2 millimeters를 후퇴시킨 후 3 millimeters 깊이에서 주입합니다. 깊이 주입은 분당 10 microliters의 속도로 수행해야 합니다. 주입이 완료되면 바늘을 1분 동안 그대로 둔 다음 천천히 후퇴시킵니다.

그런 다음 프레임에서 마우스를 제거합니다. 이어서, 멸균 PBS 방울을 사용하여 뇌 표면의 수분을 유지하십시오.

2.7 mm 윈도우를 밀폐하기 위해 뇌 표면에 3 mm 커버 슬립을 놓습니다. 그런 다음 주변의 두개골을 건조시킵니다. 이어서, 두피 조직을 두개골에 접착하고 커버 슬립을 고정하기 위해 vet bond를 도포합니다.

너무 많이 도포하면 유리 아래로 새어 나와 이미징 성능이 저하될 수 있으므로 주의하십시오. 다음으로, 후드 내에서 신선한 치과용 아크릴 분말과 용액을 혼합한 후 22 gauge 바늘을 사용하여 vet bond 위에 혼합물을 도포합니다. 밀폐를 확실히 하기 위해, 유리 커버슬립을 덮지 않도록 주의하면서 아크릴이 유리 커버슬립의 가장자리와 약간 겹치게 도포하십시오.

이 단계에서는 마취된 마우스를 자체 설계한 XAD 2 25 정위 방사선 조사기 내부의 맞춤형 머리 고정 장치에 배치합니다. X선 튜브를 피크 전압 40 kV, 전류 0.05 mA로 설정하고 2 mm 알루미늄 필터를 통해 360도 콘빔 CT 스캔을 수행합니다. 획득한 영상을 사용하여 방사선 ISO 센터가 우측 뇌반구를 향하고 등쪽-배쪽(dorsal ventral) 방향에서 중앙에 위치하도록 스테이지를 조정합니다.

방사선 조사 부위를 설정하기 위해 사용할 수 있는 콜리메이터의 종류가 매우 다양하며, 이는 해당 모델의 적응성이 뛰어남을 보여줍니다. 본 실험에서는 반구형 조사를 위해 8 mm × 11 mm 콜리메이터를 사용합니다. 반구형 콜리메이터를 X RAD 2 25 정위 방사선 조사기에 삽입하십시오.

콜리메이터를 통해 상단과 하단 모두에서 단일 CT 직교 영상을 획득하고, 해부학적 골 구조를 확인하며 모니터 상에서 스테이지 위치를 수동으로 미세 조정하여 머리의 위치가 정확한지 확인하십시오. XAD 2 25 IRRADIATOR 알루미늄 필터를 0.93 millimeter 구리 처리 필터로 교체하십시오. 그런 다음 X선 튜브 프로그램을 225 peak illa voltage 및 13 milliamps에서 실행하고, 상단에서 AP 방향으로 방사선량의 절반을 조사하십시오.

갠트리를 하단 위치로 되돌리고, 하단에서 PA 방향으로 방사선량의 나머지 절반을 조사합니다. 이 과정에서, 이전에 두개내 창을 생성한 마우스를 마취시키고 알코올 스프레이를 사용하여 창을 세척합니다. 생성된 키메라 마우스에 통합된 형광색소에 따라 공초점 현미경의 채널을 설정합니다.

또는, 영상 촬영 세션 간의 가변성을 줄이기 위해 이전 설정을 재사용하십시오. 이 경우 영상 촬영에 필요한 태그를 외측 꼬리 정맥에 주입하며, 혈관 시각화를 위해 dextran을 사용합니다. 마우스를 맞춤 제작된 머리 고정 장치 위에 뒤집어 놓은 뒤, 성형 가능한 플라스티신으로 지지하여 머리가 레이저와 수직이 되도록 하고, 고정 장치를 이동식 현미경 스테이지 위에 평평하게 올리십시오.

첫 번째 채널 레이저를 켜고, 챔버 창에 비친 레이저 빔의 교차점을 직접 확인하여 두개내 창의 중앙에 위치시킵니다. 5배 렌즈를 사용하여 전체 창의 각 채널 이미지를 촬영하고, 이를 10배 및 20배 장거리 렌즈를 이용한 다른 고해상도 이미지의 맵으로 활용합니다. 이 도식은 수술 과정과 관련된 기술적 오류를 강조하며, 이러한 오류가 생성된 이미지에 미치는 영향을 보여줍니다.

윈도우 아래에 갇힌 공기는 이미지에서 기포로 나타납니다. 유리에 쌓인 아크릴 잔여물은 far red 채널에서 자가형광을 띠며 시야의 일부를 가리게 됩니다. 마찬가지로, 이미징 중 윈도우에 묻은 오염 물질은 이미지에서 자가형광성 반점으로 나타납니다.

완벽한 두개내 창(intricranial window)이라 할지라도 현미경으로 관찰하면 문제가 발생할 수 있습니다. 호흡 아티팩트로 인해 이미지에 줄무늬가 생길 수 있으며, 프레임 위 마우스의 위치 설정이 부적절할 경우 이미지가 분절될 수 있습니다. 레이저가 조직의 일부만 가로지르므로, 사후 이미지 프로세싱을 통해 CFP 태그 세포를 위한 추가 채널을 생성하여 CFP 이미지에서 GFP 이미지를 감산함으로써 실제 CFP 신호를 확인할 수 있습니다.

또한, 콜라겐 4형 섬유의 제2고조파 생성(second harmonic generation) 자가형광 특성을 이용하여 혈관의 기저막을 이미징할 수 있습니다. 5개의 형광 채널을 사용할 수 있으므로 사용자는 본 논문에서 설명한 새로운 미러링 모델을 매우 유연하고 적응력 있게 활용할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 수술 과정에서 사용되는 위험 물질들에 유의하는 것이 중요합니다.

또한 장기 영상 촬영 동안 뇌 조직이 손상되지 않도록 세심하고 꼼꼼하게 주의를 기울이는 것이 필수적입니다. 이 영상을 시청하고 나면 형광 표지된 전구세포를 가진 키메라 마우스를 제작하는 방법을 충분히 이해하게 될 것이며, 결과적으로 치료적 개입 여부에 따른 종양 세포 이식 후 두개내 혈관의 고해상도 실시간 영상을 캡처할 수 있게 될 것입니다.