소설 고해상도 생체 내 이미징 기술

이 절차의 전반적인 목표는 시간에 따른 정상 뇌 및 뇌 종양 관련 혈관 조직에 대한 모집 패턴을 따르는 골수 유래 전구 세포의 고해상도 단일 세포 이미지를 얻는 것입니다. 이는 기증자 마우스에서 경골과 대퇴골을 제거하여 형광 골수 전구 세포를 얻은 다음 해당 세포를 방사선 수용 마우스에 주입함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 두개골 창 챔버 내부의 키메라 마우스에서 두개내 GB M 이종이식편을 생성하는 것입니다.

다음으로, 마우스는 정위 유도 방사선을 포함한 다양한 치료 요법을 받습니다. 마지막 단계는 2광자 컨포칼 현미경에서 마우스를 이미지화하는 것입니다. 궁극적으로 이 방법론은 다양한 모델에서 두개내 혈관형성의 메커니즘을 동적으로 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

체외 조직의 조직병리학과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 뇌의 혈관 형성과 관련된 중요한 동적 정보를 연구할 수 있다는 것입니다. 따라서 우리는 두개간 신생혈관형성의 메커니즘을 둘러싼 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법은 두개내 신생혈관형성에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있지만, 두개내 허혈 또는 뇌졸중 신경퇴행성 질환 및 종양 세포가 뇌로 전이되는 메커니즘과 같은 뇌의 다른 시스템 및 질병 과정에도 적용할 수 있습니다.

이 비디오의 목적을 위해 우리는 엄격한 무균 기술을 따를 수 없었습니다. 이와 같이, 생물 안전 후드는 12 인치를 초과하고 동물을 드레이프하지 않습니다., 보는 사람이보다 선명한 이미지와 더 나은 접근을 허용, 실험 작업을위한 절차의 방향을 잡을 수 있습니다. 무균 기술은 엄격히 따라야 합니다.

GFP 기증자 마우스의 형광 발현을 확인하고 기관 동물 관리 위원회 지침에 따라 안락사시키는 것으로 이 절차를 시작합니다. 다음으로, 무균 상태에서 작업하는 동안 양쪽 뒷다리를 청소하고 경골과 대퇴골을 제거합니다. 뼈에서 여분의 조직을 모두 제거합니다.

그런 다음 추출된 4개의 뼈의 양쪽 끝에서 종판을 제거합니다. 22게이지 바늘과 1밀리리터의 멸균 PBS로 세척합니다. 골수가 모두 씻겨 나가면 깨끗해집니다.

그 후, 추출된 골수 현탁액을 혼합합니다. 글쎄요, 그것은 약 2천만 개의 세포를 포함해야 하며, 이는 3개의 숙주 쥐 재구성에 충분합니다. 다음으로 3 27 게이지 투베르쿨린 바늘을 준비하고 각각 300 마이크로 리터의 골수 현탁액을 뽑습니다.

마우스가 고정 장치에 있는 동안. 등 꼬리 표면을 표시하여 방향을 잡습니다. 그런 다음 이전에 조사된 3개의 측면 꼬리 정맥에 현탁액을 주입합니다.

이 절차에서 Nod skid 마우스는 무균 조건에서 작동합니다. 키메라 골수 결절 스키드 마우스를 마취하고 IACUC 승인 선제 진통제를 투여합니다. 각막 탈수를 방지하기 위해 눈물 젤을 바르십시오.

먼저 베타딘 용액으로 머리를 닦은 다음 알코올로 머리를 닦고 여분의 머리카락을 제거하십시오. 그런 다음 알코올로 두피를 더 청소하십시오. 귀 중간 지점에서 눈 바로 위까지 절개합니다.

첫 번째 절개 부위의 양쪽 두피를 제거하여 아래에 있는 두개골의 약 5mm를 노출시킵니다. 그런 다음 두개골 표면의 해부학적 랜드마크를 식별합니다. 다음으로, 2% 리도카인에 에피네프린 용액을 주입하여 골막을 확인하고 들어 올립니다.

그런 다음 날카로운 도구로 두개골 표면에서 골막을 절개합니다. 그런 다음 2.7mm TR refine drill을 사용하여 Lambda와 bgma에서 같은 거리에 있는 두개골의 오른쪽 반구에 있는 2.7mm 원형 뼈 플랩을 약화시킵니다. 아래에 있는 경막과 조직을 보호하기 위해 드릴로 뼈를 관통하지 마십시오.

이제 절개부, 핀셋 및 치과 고리를 사용하여 의도적이지만 제어된 힘으로 약해진 뼈 피판을 제거합니다. 다음으로, 30 게이지 Hamilton 주사기에 10 마이크로 리터의 세포 현탁액을 장전하고 바늘을 정위 프레임에 놓습니다. 그런 다음 정위 프레임에 마우스를 놓습니다.

그 후 생성된 창의 중심점에 바늘을 정렬하고 피질 표면에 닿을 때까지 바늘을 내립니다. 그런 다음 디지털 좌표를 재설정합니다. 이제 바늘을 피질 조직 안으로 3.2mm 내립니다.

그런 다음 0.2mm를 후퇴시키고 3mm로 주입합니다. 깊이 주입은 분당 10 마이크로 리터의 속도로 수행해야합니다. 주사가 완료되면 바늘을 1분 동안 제자리에 두었다가 천천히 집어넣습니다.

그런 다음 프레임에서 마우스를 제거합니다. 그런 다음 뇌 표면에 수분을 유지하십시오. 멸균 PBS 한 방울을 사용합니다.

뇌 표면에 3mm 커버 슬립을 놓고 2.7mm 창을 밀봉합니다. 그런 다음 주변의 두개골 뼈를 말리십시오. 다음으로, 수의사 본드를 바르고 두피 조직을 두개골 뼈에 붙이고 덮개가 미끄러지도록 제자리에 고정합니다.

유리 아래로 누출되어 이미징 가능성이 감소하므로 너무 많이 바르지 마십시오. 다음으로, 후드에 신선한 치과용 아크릴 분말과 용액을 섞고 22 게이지 바늘을 사용하여 수의사 본드 위에 혼합물을 적용합니다. 단단히 밀봉하려면 유리 커버 슬립의 가장자리와 약간 겹치도록 아크릴을 바르되 유리 커버 슬립을 덮지 않도록 하십시오.

이 단계에서는 마취된 마우스를 집 안에서 설계된 XAD 2 25 정위 조사기에 넣은 맞춤형 머리 고정기에 넣습니다. 2mm 알루미늄 필터를 통해 40 피크 킬로 전압과 0.05 밀리암페어에서 작동하는 X선관으로 360도 콘 빔 CT 스캔을 얻을 수 있습니다. 이미지를 사용하여 방사선 ISO 중심이 오른쪽 반구를 향하고 등쪽 복부 방향의 중심이 되도록 스테이지를 배치합니다.

방사선을 목표로 하는 데 사용할 수 있는 다양한 콜리메이터가 있으며, 이는 모델의 적응성을 보여줍니다. 이 경우 반구 조사를 위해 8mm x 11mm를 사용합니다. 반구 시준기를 X RAD 2 25 정위 조사기에 삽입합니다.

콜리메이터를 통해 상단과 하단 모두에서 단일 CT 직교 이미지를 획득하여 해부학적 뼈 구조를 찾고 모니터에서 스테이지 위치를 수동으로 미세 조정하여 머리의 올바른 위치를 보장합니다. XAD 2 25 IRRADIATOR 알루미늄 필터를 0.93mm 구리 처리 필터로 변경합니다. 그런 다음 225 피크 일라 전압 및 13밀리암페어에서 X선관 프로그램을 실행하고 방사선량의 절반을 위에서 AP 방향으로 투여합니다.

갠트리를 하단 위치로 되돌리고 하단에서 PA 방향으로 방사선량의 후반부를 투여합니다. 이 절차에서는 이전에 생성된 두개내 창 마우스를 마취하고 알코올 스프레이를 사용하여 창을 청소합니다. 생성된 키메라 마우스에 통합된 형광 색소에 의해 결정된 대로 컨포칼 현미경의 채널을 설정합니다.

또는 이전 설정을 재사용하여 이미징 세션 간의 변동성을 줄일 수 있습니다. 이미징에 필요한 모든 태그를 측면 꼬리 정맥(이 경우)에 주입하고, 혈관 구조를 위해 dextran을 주입합니다. 성형 가능한 플라스틱으로 지지하고 헤드가 레이저에 수직이 되도록 하고 고정 장치를 이동식 현미경 스테이지에 평평하게 로드하여 맞춤형 헤드 리스팅에 마우스를 뒤집습니다.

첫 번째 채널 레이저를 켜고 챔버 창의 레이저 빔 교차점을 직접 바라봄으로써 두개내 창의 중앙에 배치합니다. 5x 렌즈로 전체 창에 대한 각 채널의 이미지를 촬영하고 10 x 및 20 x 장거리 렌즈로 다른 고해상도 이미지의 맵으로 사용하십시오. 이 회로도는 수술 과정과 관련된 기술적 오류를 강조하고 각 오류가 생성된 이미지에 미치는 영향을 보여줍니다.

창 아래에 갇힌 공기는 이미지에서 거품으로 볼 수 있습니다. 유리에 축적된 아크릴은 원적색 채널에서 자동 형광이며 시야의 일부를 차단합니다. 마찬가지로, 이미징 중 창의 먼지는 이미지에서 자동 형광 플렉스로 나타납니다.

완벽한 두개내 창조차도 일단 현미경으로 관찰하면 문제가 발생할 수 있습니다. 호흡 아티팩트는 라인된 이미지를 생성하지만 프레임에서 마우스를 잘못 배치하면 분할된 이미지가 생성됩니다. 레이저는 사후 이미지 처리로 조직의 일부만 교차하기 때문에 CFP 태그된 세포에 대한 추가 채널을 추가하여 CFP 이미지에서 GFP 이미지를 빼내어 실제 CFP 신호를 나타낼 수 있습니다.

또한, 콜라겐 4 섬유의 특징인 제 2 고조파 발생 자가형광을 활용하여 혈관 구조의 기저막을 이미지화할 수 있습니다. 5개의 형광 채널을 사용할 수 있기 때문에 사용자는 이 백서에 설명된 새로운 미러링 모델의 많은 유연성과 적응성을 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 수술 절차 중에 사용되는 위험한 제품을 염두에 두는 것이 중요합니다.

또한 장기 이미징 전반에 걸쳐 뇌 조직이 손상되지 않은 상태로 유지되도록 세심하고 세부 사항에 특별한 주의를 기울이는 것도 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 형광 전구 세포를 가진 키메라 마우스를 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 그 결과 치료 개입 여부에 관계없이 종양 세포 이식 후 두개내 혈관 구조의 고해상도 실시간 이미지를 캡처할 수 있을 것입니다.