Name: 덕트 세포를 수집 배양 차 쥐 내부 수질 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 배우세요 쥐 신장 내수질집합관(IMCD) 세포 분리 및 배양 방법을 통해 아르기닌-바소프레신(AVP) 매개 수분 재흡수 메커니즘을 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 신생리학 및 수분 항상성 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (, KL 1415/3-2와 KL 1415/4-2 DFG)에 의해 지원되었다.

1. 준비하기 <ol><li> 배양 접시를 준비 <ol><li> 해동 콜라겐 유형 4에서 IV O / N ° C와 0.1 % 멸균 아세트산에 용해. 사용하는 볼륨은 세포가 파종을 작성할 수있는 요리의 종류와 수에 따라 달라집니다. 2 ㎍ / cm 2를 사용하십시오. </li><li> 적어도 RT에서 1 시간 동안 요리를 품어 증류수 (A. tridest)로 두 번 씻는다. </li><li> 요리가 제대로 건조하도록 허용합니다. </li></ol></li><li> 매체의 보완 <ol><li> 500 ML 매체에 1.75 g의 포도당을 추가하여 최대 4.5 g / L의 포도당 수준을 높일 수 있습니다. 매체 600 mosmol으로 조정하려면, 각각 200 mosmol 100 mosmol하여 삼투압을 증가, 100 mM의 NaCl을 100 MM의 요소를 추가합니다. </li><li> 600 mosmol DMEM 배지에 1 % 비 필수 아미노산, 1 % ultroser, 500 μM의 DBcAMP, 20 U / ㎖ 스타틴 0.25 ㎍ / ㎖ 겐타 마이신 (50 ㎍ / ㎖의 농도 원액 1:200 희석)을 추가 갓 준비의 날에. </li></ol></리&gt; <li> 효소 솔루션 <ol><li> 에 1 밀리그램 / ML 히알루 2.2 MG / ML 콜라를 추가 DPBS 함유 0.25 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신과 스타틴을. 2 신장 내부 medullae의 소화에 대한이 효소 용액 1 ㎖를 준비합니다. 이 솔루션은 여과 멸균되어야하며, 50 ML 팔콘 튜브에 저장됩니다. </li></ol></li></ol> 2. 차 쥐 내부 수질의 재배 덕트 (IMCD) 세포를 수집 모든 동물의 처리 절차는 로컬 및 연방 법률을 준수 실시하여야한다. <ol><li> CO 2의 쥐 (CO 2로 포화 상자) 또는 isoflurane을 (; ~ 2.5 % isoflurane을 가진 공기 흐름 350-400 ML / 분 U-400 마취 장치, Univentor 회사, 몰타)을 마취시키다. 흰 안쪽과 어두운 바깥 수질 경계의 정확한 검출을 허용 출혈 동물의 목을 베십시오. 또한, 출혈 격리 적혈구의 수를 최소화합니다. 신장을 제거하고얼음 겐타 마이신과 스타틴 (위 참조) 보충 멸균 DPBS에서 그들을 씻어. 모든 추가 단계는 무균 클린 벤치 조건 하에서 실시하여야한다. </li><li> 과도한 액체를 제거하는 살균 압축에 DPBS 용액으로부터 신장을 전송합니다. 멸균 집게와 가위로 지방 신장 캡슐을 제거합니다. </li><li> 신장은 여전히​​ 압축에 고정 바깥 쪽 (피질) 측의 종축 옆에 약간 잘라 데. 완전히 극복 할 수 있지만, 신장 골반에 연결 한 조각에 남기지 않도록해야합니다. </li><li> 곡선 가위로 조심스럽게 장미 반짝이는 외부 수질에 둘러싸여 흰 내부 medullae를 해부. 얼음에 60mm 배양 접시에 겐타 마이신과 스타틴을 포함 DPBS에서 그들을 수집합니다. </li><li> 모든 medullae이 고립 얼음에 수집되면, 그들은 그냥 버퍼로 덮여 수준으로 DPBS의 양을 줄일 수 있습니다. 5 큐브로 medullae를 잘라 살균 면도칼을 사용하여mm 3. </li><li> 화염으로 짧게 잡고 녹여 멸균 파스퇴르 피펫의 예리한 끝을 라운드. 피펫 계속하기 전에 냉각되어 있는지 확인합니다. </li><li> 둥근 파스퇴르 피펫을 사용하여 히알루 및 콜라게나 제 (1.3.1 참조) 갓 준비한 살균 효소 솔루션을 포함하는 50 ML 팔콘 튜브에 조직 현탁액을 전송합니다. 단단히 뚜껑을 닫고 37 ° C 1.5 일반 탁상 물 목욕 연속 교반 (220 rpm)가 아​​래에서 알을 품다 - 2 시간. </li><li> 서스펜션의 분쇄를 들어, 정지 균일 혼탁 될 때까지 라운드 파스퇴르 피펫 (위 참조)를 여러 번 내려 혼합물을 피펫. </li><li> 300 XG에서 5 분, 16 ° C.를위한 현탁액을 원심 분리기 상층 액을 버리고 침전물을 다시 겐타 마이신과 스타틴과 원심 분리기를 포함 DPBS에 철저 resuspend을. 한번이 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 완벽하게 보완 매체와 C에 씨앗을에서 세포를 resuspend을ulture 요리 및 / 또는 미세 역가 웰 플레이트. 2 medullae (1 동물)의 준비를 한 60mm 배양 접시에 충분한 세포를 얻을 것입니다. </li><li> 24 시간 후, 600 mosmol DMEM로 두 번 세포를 씻으 신선한 매체를 추가합니다. 다음 주에 세포를 2 ~ 3 회 (그림 1) 세척해야한다. 6-8일 파종 후 IMCD 세포 실험에 사용할 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 24 시간 동안 DBcAMP 및 스타틴없이 매체를 배양해야합니다. 그렇지 않으면 AQP2는 플라즈마 막에서 독점적 위치합니다. </li></ol>

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<li>Tamma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostaglandin+E2+analogue+sulprostone+antagonizes+vasopressin-induced+antidiuresis+through+activation+of+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho.</a> J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).</li>
<li>Maric, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+volume+kinetics+of+adherent+epithelial+cells+measured+by+laser+scanning+reflection+microscopy%3A+determination+of+water+permeability+changes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells.</a> Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).</li>
<li>Gonzalez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+stimulates+renin+in+inner+medullary+collecting+duct+cells+via+protein+kinase+C+and+independent+of+epithelial+sodium+channel+and+mineralocorticoid+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity.</a> Hypertension. 57, 594-599 (2011).</li>
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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 차 쥐 IMCD 세포의 준비 및 배양에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 방법은 하나의 쥐 20의 세포의 21cm 2까지 얻을 수 있습니다. 실험은 표준 세포 배양 장비가 필요하고 약 6 시간 안에 한 사람에 의해 수행 할 수 있습니다. 따라서이 방법은 표준 실험 방법으로 적합합니다. 차 쥐 IMCD 세포를 96 웰 플레이트에서 60mm 요리에 이르기까지 다양한 크기의 배양 접시에 분주 할 수 있습니다. 그러나 384도 형식의 성장을위한 절차는 최적화가 필요합니다. 우리는 성장 둔화로 60mm보다 큰 그릇을 사용하지 마십시오. 세포는 웨스턴 블롯, 면역 침전, DNA / RNA 분리, 면역 형광 현미경, 칼슘 2 + 이미징 및 전기 생리학 10,22,23 등 다양한 실험에 적합합니다. 파종 후 약 6-8일는 기본 IMCD 세포 confl로 ...

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Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

신장 집합관 주 세포, 아르기닌 바소프레신​​ (AVP)는 물 삽입을 자극하여 물을 재 흡수를 제어하는​​ 플라즈마 막에 채널 아쿠아 포린-2 (AQP2). AVP는 아데 cyclase의함으로써 캠프의 형성을 자극 G 단백질 결합 바소프레신​​ 2 형 수용체 (V2R)에 바인딩합니다. 이 신호 폭포의 개시 단백질 키나제 A (PKA)의 활성화로 연결됩니다. PKA는 플라즈마 막으로 세포 내 소포에서의 재분배를위한 주요 트리거입니다, 256 (S256) 세린에서 AQP2를 인산화. 막 삽입 삼투 기울기 및 미세 조정 몸 물 항상성을 따라 물을 재 흡수를 용이하게합니다. 때문에 AVP 분비 또는 AVP 활성화 신호 원인 또는 수차에 AVP-매개 물의 재 흡수의 조절 장애는 심각한 질병과 연관됩니다. V2R 또는 AQP2의 돌연변이에 의해 발생 감소 물을 재 흡수는 표고 반면, 신원 성 요붕증로 연결ated 혈장 AVP 레벨은 만성 심장 마비와 부적절한 항 이뇨 호르몬 분비 (SIADH)의 증후군 심혈관 질환의 과도한 수분 재 흡수와 연결되어 있습니다. AVP-매개 물을 재 흡수의 중요성뿐만 아니라 질병의 의미에서 유래한다. AQP2 베어링에 소포와 세포막과 융합의 AVP 유발 전위는 현재 잘 이해되지 않는 엄격 캠프에 의존 exocytic 프로세스를 나타냅니다. 캠프 의존 exocytosis에 대한 다른 예는 신장과 H의 레닌 분비 + 위장 분비한다. 따라서 신장 주요 세포에서 AQP2-전위를 지배하는 분자 메커니즘의 해명뿐만 아니라 다른 세포 유형에 비슷한 분자 프로세스를 이해하는 데 도움이뿐만 아니라 AVP-매개 물을 재 흡수의 장애와 관련된 질환의 치료에 대한 새로운 치료에 방법을 포장 수 있습니다 . E기계 제어 AQP2를 lucidating은 덕트 주요 세포 모델을 수집해야합니다. 이를 위해 다른 포유 동물의 신장 세포 라인의 숫자를 사용할 수 있습니다. 그러나 이러한 모델은 몇 가지 단점을 가지고있다. 많은 세포 시스템에서 AQP2의 단백질 수준 (표 1, M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 낮은 1-10 ectopically 다른 과발현 사람 (MCD4, WT10) 11,12 또는 쥐 (CD8) 13 AQP2. MCD4 및 COS​​-7 세포에서 V2 수용체가 표시되지 않습니다. 우리의 지식이 신장 내 수질 집합관, AQP2 발현이 가장 풍부한 신장의 그 부분에서 파생 가능한 모델로 영구 세포 라인은 없지만, 대뇌 피질 집합관 1,11,13-16에서 . 이러한 세포 모델은 예를 들어 널리 사용되는 불후의 mpkCCD (예를 들어, 17) 또는 최근에 설립 된 mTERT-CCD 14 세포주이다. 두 세포주 내생 적 표현 AQP2 및 V2R 그러나 그들은에서 파생되기 때문에대뇌 피질의 수집 덕트는 대부분 덕트 (IMCD) 세포를 수집하는 내부 수질에 비해 다른 프로테옴을 포함합니다. 그들은 예를 들어 다른 나 표현해야 + 교통 시스템입니다. 여기, 우리는 V2R 및 AQP2 내생 적 표현 문화의 기본 IMCD 세포 프로토콜을 제시한다. 이 모델은, 그러므로, 신장 수집 덕트에서 가장 밀접하게 생리적 상황을 나타냅니다. 문화를 확립하는 것이 필요하기는 표준 실험실 장비 기타 실험실은 쉽게이 방법을 채택 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>콜라겐 유형 IV 마우스</td><td>BD Biosciences</td><td>356233</td><td></td></tr><tr><td>히알루로니다아제</td><td>SIGMA</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 CLS-II</td><td>Biochrom AG</td><td>C2-22</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutMAX</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>21885108</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>SIGMA</td><td>N4014</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser G</td><td>Cytogen</td><td>15950-017</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>DBcAMP</td><td>BIOLOG</td><td>D009</td><td></td></tr></tbody></table>

덕트 세포를 수집 배양 차 쥐 내부 수질

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

아르기닌 바소프레신​​ (AVP)는 신장 덕트 주요 세포를 수집하고이를 미세 조정 몸 물 항상성에 의해 물을 재 흡수를 용이하게합니다. AVP는 세포의 표면에 바소프레신​​ V2 수용체 (V2R)에 결합함으로써 캠프의 합성을 유도합니다. 이 물 채널 아쿠아 포린-2 (AQP2)의 인산화의 변화를 선도하는 세포 신호 전달 과정을 자극한다. 단백질 키나아제 A는 AQP2를 phoshorylates함으로써 기본 소변에서 물을 재 흡수를 촉진 플라즈마 막으로 세포 내 소포에서 AQP2의 전위를 트리거합니다. 주요 세포에서 뇌하수체 또는 AVP 활성화 신호에서 AVP 방출의 수차는 각각 중앙 또는 신원 성 요붕증을 일으킬 수 있으며, 높은 혈액 혈장 AVP 레벨은 만성 심장 마비와 부적절한 항 이뇨 호르몬 분비 증후군 심혈관 질환과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 cultivati​​위한 프로토콜을 제시한다표현 V2R 및 AQP2는 내생 덕트 (IMCD) 세포를 수집, 차 쥐 내부 수질의합니다. 세포는 AQP2의 컨트롤을 기본 분자 메커니즘을 해명에 적합하며, 따라서 AVP-매개 물의 재 흡수의 조절 장애와 관련된 질환의 치료를위한 새로운 약물 표적을 발견 할 수 있습니다. IMCD 세포는 쥐의 신장 내 medullae에서 얻을 수 있습니다 및 6~8일 파종 후 실험에 사용됩니다. IMCD 세포는 일반 세포 배양 접시, 플라스크 및 다른 형식의 마이크로 타이 터 플레이트에서 배양 할 수있는 절차는 몇 시간이 필요하며, 표준 세포 배양 실험실에 적합합니다.

차 쥐 IMCD 세포의 성공적인 재배 6-8일 파종 후 합류 단층 (그림 2)가 발생합니다. 60mm 배양 접시 당 약 6 × 10 6 세포가 있습니다. 이들은 콜라겐 유형 IV, 기저막 구성 요소를 18로 코팅 된 것과 세포는 단단히 배양 접시에 부착. 따라서 IMCD 세포는 여러 철저한 세척 과정에서도 분리되지 않습니다. 까지 배양 세포의 80 %는 내생 V2R 및 AQP2를 표현한다. AQP2가 부족한 세포가 협재 세포 헨레, 바사 곧은 창자 또는 내부 수질 간질 세포의 루프의 얇은 사지에서 파생 된 비 IMCD 세포로 간주됩니다 반면, 이들은 주요 세포이다. 우리는 앞에서 설명한 바와 같이, 600 mosmol의 중간 삼투압는 AQP2 19 다운 규제를 방지 할 수 있습니다. 또한, AQP2 발현은 막 투과 캠프 아날로그 DBcAMP와 매체를 보완하여 유지됩니다. AQP2 플라즈마 MEMB을 줄이기 위해RANE 표현함으로써 그 세포...

아르기닌 바소프레신​​ (AVP)는 신장 주요 세포에 의해 물을 재 흡수를 촉진을 통해 몸에 물 항상성의 미세 조정을 제어합니다. 여기, 우리는 AVP-매개 물 재 흡수를 기본 분자 메커니즘의 해명에 적합한 덕트 세포를 수집 차 쥐 내부 수질의 재배를위한 프로토콜을 제시한다.

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

본 절차의 전체적인 목적은 VP 매개 수분 재흡수를 연구하는 데 적합한 쥐의 일차 내수질 집합관 세포 또는 IMCD 세포를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 쥐의 신장을 적출함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 주변의 외수질 및 피질로부터 내수질을 분리하는 것입니다.다음으로, 개별 세포를 분리하기 위해 내부 meli를 효소적으로 소화합니다. 마지막 단계는 주세포(principal cells)를 현탁 및 선택한 후, 이를 배양 접시에 접종하는 것입니다. 최종적으로 세포를 접종하고 6~8일이 지나면 실험에 사용할 준비가 됩니다.본 세포 배양 시스템은 VP 매개 수분 재흡수의 기저에 있는 분자적 메커니즘과, 가능하게는 다른 CAP 의존적 TIC 프로세스를 규명하는 데 적합합니다. 또한, 이 시스템은 VP 매개 수분 재흡수의 조절 장애와 관련된 질환의 치료를 위한 새로운 신약 후보 물질 및 약물 표적 발굴에 활용될 수 있습니다. 해당 절차는 본 연구실의 박사과정 학생과 연구원인 Beata Eman 및 Andrea Giller가 시연할 예정입니다.여기의 타임라인 장면을 따라, 배양 접시를 collagen type four로 코팅하십시오. 다음 날 실험을 수행하기 전날에, 먼저 배지와 효소 용액을 준비하십시오. 새로 준비한 DMEM 배지에 보충제를 첨가하십시오.효소 용액을 준비하려면, 1 mg/mL의 hyaluronidase와 2.2 mg/mL의 Collagenase를 DPBS 필터에 첨가하십시오. 해당 용액을 멸균한 후 50 mL Falcon 튜브에 보관하십시오.소화된 신장 내수질(inner medulla) 2개당 1mL의 효소 용액을 준비하십시오. 본 프로토콜에서 가장 어려운 단계는 내수질의 박리입니다. 성공적인 박리를 위해, 안락사 후 동물로부터 혈액을 제거하여 내수질과 외수질(outer medulla) 사이의 반짝이는 경계선을 더 쉽게 식별할 수 있도록 합니다.신장을 제거하여 미리 준비한 멸균 DPBS에 보관합니다. 멸균 상태에서 Gentamicin Nystatin이 첨가된 DPBS 용액으로부터 신장을 꺼내어 멸균 거즈 위로 옮긴 후 과량의 액체를 제거합니다.다음으로, 멸균된 메스를 사용하여 거즈에 고정된 상태에서 지방성 신장 캡슐을 제거합니다. 외측 또는 피질 쪽의 세로축을 따라 절개합니다. 이때 완전히 절단하지 말고 신우 부분에서 여전히 하나로 연결된 상태로 남겨두어야 합니다.다음으로, 은은한 장밋빛의 외수질과 흰

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이것은 갓 태어난 새끼 쥐의 우수한 경추 신경 (SCG)에서 기본 교감 신경을 분리하고 문화하는 방법을 설명하는 프로토콜입니다.

쥐 우수한 자궁암 신경 (SCG)에서 Culturing 교감 신경에 대한 프로토콜

우리는 쥐 배아에서 hippocampal과 대뇌 피질의 신경 세포를 분리하고 문화에 빠른 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 우리가 거​​의 순수의 연결을 문화가 요구되는 실험을 수행할 수 있습니다.

쥐 배아 신경 세포의 분리 및 문화 : 빠른 프로토콜

이 비디오에서는 광범위한 분자 생물학 및 세포 배양 연구를 위해 신장 세뇨관 상피 세포를 분리하고 정제하는 단계를 보여줍니다.

쥐 신장 세포 분리: 신장 세뇨관 상피 세포의 1차 배양을 분리하고 생성하는 기술

이 비디오는 쥐의 척추에서 등뿌리신경절(DRG) 세포를 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다. 척추에서 절제된 DRG는 효소로 처리되고 기계적으로 해리되어 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 세포는 각각 신경교세포 증식을 제한하고 신경 세포 성장을 촉진하는 억제제와 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양됩니다.

쥐의 척추 기둥에서 1차 등뿌리 신경절 세포 배양 확립

이 프로토콜 절연, 문화, 및 석 회화의 쥐 파생 밸브 중간 셀의 calcific 대동맥 밸브 질환 (CAVD)의 높은 생리 적 체 외에서 모델에 설명합니다. 이 쥐 모델의 착취 셀 및 분자 메커니즘이 복잡 한 병 적인 과정을 기초에 CAVD 연구를 촉진 한다.

절연 및 기본 쥐의 밸브 중간 세포: 관상동맥 밸브 석 회화를 공부 하는 새로운 모델

이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

부 신 피 질에서 분 비 하는 호르몬은 스트레스와 질병에 대 한 동물에 대 한 중요 합니다. 여기, 우리는 문화 기본 쥐 프로토콜 부 신 셀을 제시. 그것은 부 신 steroidogenesis와 지질 생 합성의 약의 메커니즘을 조사 하기 위한 좋은 생체 외에서 플랫폼을 수 있습니다.

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성인 쥐 요로 방광에서 1 차신경및 glia의 격리 그리고 문화

이 논문은 우수한 자궁 경부 신경교에서 배아 쥐 동정 뉴런의 격리 및 배양에 대해 설명합니다. 또한 면역 세포화학 염색및 질량 분광 분석을 위한 신경 추출물을 준비하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

형태학적 및 프로테오믹 분석을 위한 배아 우수한 자궁 경부 간리아에서 쥐 동정 신경을 배양

이 논문은 신생아 Sprague-Dawley(SD) 쥐에서 1차 망막 뮐러 세포를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차에는 안구 적출, 망막 조직 해부, 세포 추출 및 식별, 후속 세포 배양을 위한 주요 고려 사항이 포함됩니다.

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배우세요 쥐 신장 내수질집합관(IMCD) 세포 분리 및 배양 방법을 통해 아르기닌-바소프레신(AVP) 매개 수분 재흡수 메커니즘을 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 신생리학 및 수분 항상성 연구에 활용됩니다.

덕트 세포를 수집 배양 차 쥐 내부 수질

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