배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

다음 프로토콜의 전반적인 목표는 여러 세포 판독을 동시에 모니터링하여 유전자 기능에 대한 게놈 규모 조사를 가능하게 하는 것입니다. 이 시연에서는 Firefly RAN 및 Cipro Dina Luciferase 기반 리포터를 사용하여 각각 P 53 WINT 및 KRAS 경로 활동을 모니터링했습니다. 이 3명의 기자는 결장직장암 세포주인 HCT one 16 세포에 관심 유전자를 표적으로 하는 irna로 간이 침대를 절단합니다.

그 후, 반딧불이 및 바닐라 루시페라아제 활성은 Cipro DEA 루시퍼라아제의 활성이 세포 용해물에서 측정됩니다. 배양물에서 분비된 효소가 측정됩니다. 분석 시스템의 재현성뿐만 아니라 이 세 가지 암 관련 경로 내에서 유전자의 공유되고 고유한 작용을 밝힐 수 있는 능력을 보여주는 중간 정도의 결과를 얻었습니다.

마이크로레이 또는 다색 프라이와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전사 세포 출력을 보는 저렴하고 보편적이며 비용 효율적인 방법이라는 것입니다. 이 방법은 분자 표적 치료 전략 개발과 같은 암 연구의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 당사의 일시적인 transfect 프로토콜 노력은 IL이고 스크린 설정을 위한 최소한의 초기 시간 투입이지만, 우물의 절대 실패를 보는 대신 보고서 비율을 살펴봄으로써 반박할 수 있는 신호 변동성을 잘 증가시킬 수 있습니다.이 절차를 시작하려면 80-90% confluent HCT one 16 cells의 10cm 제곱 플레이트 5개를 PBS로 세척한 다음 각 플레이트에 대해 트립신 화제로 세포를 수확합니다.

1ml의 트립신 용액을 사용한 후 2%FBS와 1%페니실린을 함유한 DMEM 10ml로 중화시킵니다. 스트렙토마이신은 부유 세포를 50ml 원뿔형 튜브로 전달하고 약 130G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 10ml의 배지에 재현탁시킵니다.

세포 계수기로 세포 수를 세고 10에서 밀리리터당 5번째 세포가 있는 세포 용액을 만듭니다. 멀티 드롭 자동 액체 디스펜서 플레이트를 사용하여 다음 단계를 위해 150ml의 세포 현탁액을 유지하십시오. 100 마이크로리터 또는 10 내지 4 세포를 96 웰 배양 플레이트의 각 웰에 배치한다.

이 경우의 세포 현탁액은 1296을 도금하기에 충분해야 한다. 웰 플레이트는 트랜스펙션 혼합물을 준비하는 동안 5% 이산화탄소가 함유된 인큐베이터에서 섭씨 37도의 세포와 함께 플레이트를 인큐베이션합니다. 여기에 사용된 고품질 리포터 구성 DNA는 표준 MIDI 준비 키트를 사용하여 분리하고 밀리리터당 1밀리그램의 최종 농도로 희석했습니다.

각 리포터에 대해 P, 53, FL 30 마이크로 리터, 8 X-T-C-F-R-L, 30 마이크로 리터, 엘크 1 G 4 6 마이크로 리터 및 H 2 오 4 마이크로 리터를 결합하여 리포터 구성 스톡 용액 100 마이크로 리터를 준비합니다. 이것은 리포터의 최종 비율이 1 대 1 대 1 대 0.2이고 최종 DNA 농도가 밀리리터당 0.3 밀리그램인 DNA 혼합물을 초래할 것입니다. 다음으로, 1296을 형질주입하기에 충분한 I-R-N-A-D-N-A 형질주입 혼합물을 제조한다.

웰 플레이트는 80 마이크로 리터의 리포터를 QIAGEN 효과 키트로부터 8 밀리리터의 EC 버퍼에 담가 용액을 구성하여 최종 농도가 밀리리터 플레이트당 3 마이크로그램인 DNA 용액을 얻습니다.20 마이크로리터의 DNA 용액을 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 96개의 웰 플레이트의 수는 테스트할 irna 풀의 수에 따라 달라집니다.

예를 들어, 이 경우 평가하려면 4개의 96웰 플레이트가 필요합니다. 384개의 서로 다른 SiR A 풀은 바이옴 자동 액체 처리기를 사용하여 각 5마이크로몰 siRNA 2마이크로리터를 희석된 DNA 스톡이 포함된 PCR 플레이트의 해당 웰로 이동합니다. 다음으로, DNA siRNA 플레이트의 각 웰에 1마이크로리터의 인핸서 용액을 추가합니다.

인핸서 반응이 실온에서 5분 동안 일어나도록 합니다. 그런 다음 각 웰에 3마이크로리터의 effecting transfection 시약을 추가하고 추가로 10분 동안 실온에서 배양합니다. transfection complex 형성을 중지하려면 PCR 플레이트의 각 well에 2%FBS 및 1%penicillin 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 10마이크로리터를 추가합니다.

인큐베이터에서 HCT 1개 16개 세포가 들어 있는 1296 웰 플레이트를 회수합니다. 10 마이크로리터의 형질주입 혼합물을 세포를 포함하는 96 웰 플레이트의 각 웰로 이동시키며, 각 형질주입은 3회에 걸쳐 수행될 것이다. 동일한 혼합물을 세포를 포함하는 2개의 추가 96웰 플레이트에 적용됩니다.

5% 이산화탄소가 함유된 가습 환경에서 섭씨 37도의 형질주입 혼합물로 세포를 36시간 동안 배양합니다.세포 형질주입 후 36시간. Luciferase 활동을 측정할 준비가 되었습니다.

이 연구에는 여러 명의 리포터가 포함되어 있기 때문에 한 명은 배양 배지로 분비되고 다른 두 명은 세포 세포질에서 발현됩니다. 배양 배지와 세포 용해물 모두에서 측정값을 얻어 배양물에서 Cipro Dina luciferase 또는 CL 활성을 검출합니다. 미디엄 레플리카 플레이트.

20 마이크로 리터의 배양 배지를 백색의 불투명 한 96 웰 플레이트에 제공합니다. 멀티 드롭을 사용하여 각 웰에 20마이크로리터의 CL 분석 버퍼를 추가합니다. 다음으로, 각 웰에 10마이크로리터의 Cipro Dina Lucifer와 기질을 추가하고 광도계를 사용하여 CL 활성을 검출하여 반딧불이 루시퍼라아제 및 바닐라 루시퍼라제 활성을 검출한 후 세포 용해물을 먼저 만들어야 합니다.

각 플레이트를 거꾸로 뒤집어 배지를 싱크대에 던져 세포에서 배양 배지를 제거합니다. 종이 타월에 거꾸로 된 접시를 부드럽게 두드려 남은 매체를 제거합니다. 30마이크로리터의 1개 x 수동 용해 완충액을 세포의 각 웰에 추가합니다.

실온에서 5분 동안 중간 속도로 설정된 플랫폼 로커에 플레이트를 놓습니다. 5분 후, 20마이크로리터의 루시페라제 분석 시약을 세포의 각 웰에 추가하고 광도계를 사용하여 즉시 반딧불이 루시페라제 활성을 측정합니다. 다음으로, 정지 및 발광 시약을 추가하여 반딧불이 루시퍼라제 활성을 소멸시킨 다음 루시페라제 활성을 측정합니다.

멀티플렉싱하기 전에 세 가지 다른 스크리닝 플랫폼의 견고성을 개별적으로 평가했습니다. 지시된 대장암 세포주는 각각 WINT beta-Catenin P 53 또는 KAS를 표적으로 하는 siRNA 풀과 함께 8개의 XTCF PP 53 ta Luke 또는 ALK one Firefly Luciferase 인코딩 리포터 구축물로 형질주입되었습니다. 각 세포주에 대한 경로 관련 유전자형이 표시됩니다.

각 스크리닝 플랫폼의 강도는 관련 신호 전달 경로에 대한 이러한 유도 효과의 재현성에 의해 평가되었습니다. 이러한 대표적인 결과에서 볼 수 있듯이, 베타인과 siRNA는 RKO 세포에서 8개의 XTCF 리포터 활성에 영향을 미치지 않습니다. DLD 1 및 HCT 1 16 세포는 각각 A PC 경로가 결핍되어 있는 반면, 억제 단백질은 베카 테닌의 활성화된 형태를 발현합니다.

그 후, 이러한 리포터들은 이러한 그래프에 표시된 IRNA 풀을 사용하여 바람 베타-카테닌 P 53 및 KRAS 신호 전달 경로의 유전자 활성을 동시에 측정하는 데 함께 사용될 수 있음을 보여주었습니다. 상대적인 루시페라제 활성은 Y축에 표시되며, 표시된 관심 유전자를 표적으로 하는 siRNA는 X축에 표시됩니다. 예를 들어, 베타-카테닌을 표적으로 하는 siRNA 풀은 바람의 베타-카테닌 경로 활성을 감소시키지만 P 53 및 KRA S 경로에는 큰 영향을 미치지 않습니다.

멀티플렉스 리포터 시스템을 개발하려고 시도하는 동안, transfection 영역과 리포터 신호 의도에 대한 관심 세포주를 최적화하는 것이 중요합니다.