배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

다음 프로토콜의 전반적인 목표는 여러 세포 판독값을 동시에 모니터링함으로써 게놈 규모의 유전자 기능 분석을 가능하게 하는 것입니다. 본 시연에서는 P 53, WINT 및 KRAS 경로의 활성을 각각 모니터링하기 위해 Firefly RAN 및 Cipro Dina Luciferase 기반 리포터를 사용합니다. 이 세 가지 리포터는 관심 유전자를 표적으로 하는 irna와 함께 대장암 세포주인 HCT one 16 세포에 공동 형질전환됩니다.

이어서, 세포 용해물에서 반딧불이 루시페레이스(firefly luciferase)와 바닐라 루시페레이스(vanilla luciferase) 활성을 측정하며, 분비 효소인 Cipro DEA 루시페레이스의 활성은 배양액에서 측정합니다. 얻어진 중간 결과는 분석 시스템의 재현성뿐만 아니라, 세 가지 암 관련 경로 내 유전자들의 공통 및 고유 작용을 밝혀내는 능력을 보여줍니다.

마이크로어레이(microray)나 다색 프로브(multicolor pries)와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포 전사 출력물을 관찰하는 저렴하고 보편적이며 비용 효율적인 방법이라는 점입니다. 이 방법은 분자 표적 치료 전략의 개발과 같은 암 연구 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 일시적 형질전환(transient transfect) 프로토콜은 IL과 스크리닝 설정을 위한 최소한의 사전 시간 투입만으로 가능하지만, 웰 간 신호 가변성을 증가시킬 가능성이 있습니다. 이는 웰의 절대적인 수치 대신 리포터 비율을 분석함으로써 보완할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 80~90%까지 합류(confluent)된 HCT 16 세포가 담긴 10 cm² 플레이트 5개를 PBS로 세척한 후, 각 플레이트의 세포를 트립신 처리(trypsinization)하여 회수하십시오.

1 mL의 trypsin 용액을 사용한 후, 2% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 포함된 10 mL의 DMEM으로 중화합니다. 부유된 세포를 50 mL 원심분리관으로 옮기고 약 130 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 10 mL의 배지에 다시 부유시킵니다.

세포 계수기로 세포 수를 센 후, mL당 10⁵ cells의 세포 현탁액을 제조합니다. 멀티 드롭 자동 액체 분주기를 사용하여 다음 단계를 위해 150 mL의 세포 현탁액을 준비합니다. 96-웰 배양 플레이트의 각 웰에 100 µL 또는 10⁴ cells를 분주합니다.

이 경우 세포 현탁액은 1296-웰 플레이트에 분주하기에 충분한 양이어야 합니다. transfection 혼합물을 준비하는 동안, 세포가 담긴 플레이트를 5% carbon dioxide가 포함된 37 °C 인큐베이터에서 배양하십시오. 여기에 사용된 고품질 리포터 컨스트럭트 DNA는 표준 MIDI prep 키트를 사용하여 분리하였으며, 최종 농도가 1 mg/mL가 되도록 희석하였습니다.

각 리포터에 대해, P 53, FL 30 µL, eight X-T-C-F-R-L 30 µL, elk one G 30 µL, U-A-S-C-L 6 µL, 그리고 H₂O 4 µL를 혼합하여 100 µL의 리포터 컨스트럭트 스톡 용액을 준비합니다. 이렇게 하면 리포터의 최종 비율이 1:1:1:0.2이고 최종 DNA 농도가 0.3 mg/mL인 DNA 혼합물이 됩니다. 다음으로, 1296개를 트랜스펙션하기에 충분한 양의 I-R-N-A-D-N-A 트랜스펙션 혼합물을 준비합니다.

웰 플레이트에서 리포터 컨스트럭트 스톡 용액 80 µL를 QIAGEN 이펙팅 키트의 EC 버퍼 8 mL에 희석하여 최종 농도가 3 µg/mL인 DNA 용액을 준비합니다. 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 DNA 용액 20 µL를 분주합니다. 96-웰 플레이트의 개수는 테스트할 irna 풀의 수에 따라 달라집니다.

예를 들어, 이 경우에는 평가를 위해 4개의 96-well 플레이트가 필요합니다. Biome 자동 액체 핸들러를 사용하여 384가지의 서로 다른 siRNA 풀 중 각 5 µM siRNA 2 µL를 희석된 DNA 스톡이 포함된 PCR 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 다음으로, DNA-siRNA 플레이트의 각 웰에 enhancer 용액 1 µL를 첨가합니다.

인핸서 반응이 실온에서 5분 동안 일어나도록 둡니다. 그 후, 각 웰에 transfection 시약 3 µL를 첨가하고 실온에서 10분 동안 더 배양합니다. transfection 복합체 형성을 중단시키기 위해, PCR 플레이트의 각 웰에 2% FBS와 1% penicillin streptomycin이 포함된 DMEM 10 µL를 첨가합니다.

HCT 116 세포가 포함된 96웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 각 트랜스펙션은 3반복으로 수행되므로, 세포가 들어 있는 96웰 플레이트의 각 웰에 트랜스펙션 혼합물 10 µL를 옮깁니다. 동일한 혼합물을 세포가 포함된 추가 96웰 플레이트 2개에도 동일하게 처리합니다.

세포를 transfection 혼합물과 함께 37 °C, 5% carbon dioxide가 포함된 습윤 환경에서 36시간 동안 배양합니다. 세포 transfection 후 36시간이 지나면, Luciferase 활성을 측정할 준비가 됩니다.

본 연구는 배양 배지로 분비되는 리포터 하나와 세포질에서 발현되는 다른 두 개의 리포터 등 여러 리포터를 포함하고 있습니다. 배양액 내의 Cipro Dina luciferase 또는 CL 활성을 검출하기 위해 배양 배지와 세포 용해물 모두에서 측정을 수행합니다. 배지 복제 플레이트.

흰색 불투명 96-웰 플레이트에 배지 20 µL를 분주합니다. 멀티드롭을 사용하여 각 웰에 CL 분석 버퍼 20 µL를 추가합니다. 다음으로, 각 웰에 Cipro Dina Lucifer 및 기질 10 µL를 추가하고 루미노미터를 사용하여 반딧불이 루시퍼레이스(firefly luciferase) 및 바닐라 루시퍼레이스(vanilla luciferase) 활성을 검출하여 CL 활성을 측정합니다. 단, 먼저 세포 용해물을 준비해야 합니다.

각 플레이트를 거꾸로 뒤집어 배지를 싱크대에 버림으로써 세포에서 배양액을 제거합니다. 뒤집힌 플레이트를 페이퍼 타월 위에 가볍게 두드려 남은 배지를 제거합니다. 각 세포 웰에 1x passive lysis buffer 30 µL를 첨가합니다.

플레이트를 중속으로 설정된 플랫폼 로커에 올리고 상온에서 5분 동안 반응시킵니다. 5분 후, 각 세포 웰에 luciferase assay 시약 20 µL를 첨가하고 루미노미터를 사용하여 즉시 firefly luciferase 활성을 측정합니다. 다음으로, stop and glow 시약을 첨가하여 firefly luciferase 활성을 억제한 후 luciferase 활성을 측정합니다.

멀티플렉싱을 수행하기 전에 세 가지 서로 다른 스크리닝 플랫폼의 견고성을 개별적으로 평가하였습니다. 명시된 대장암 세포주에 WNT, beta-Catenin, P53 또는 KRAS를 각각 표적으로 하는 siRNA 풀과 함께 8개의 XTCF, PP, 53, ta, Luke 또는 ALK1 Firefly Luciferase 인코딩 리포터 컨스트럭트를 트랜스펙션하였습니다. 각 세포주에 대한 경로 관련 유전형이 표시되어 있습니다.

각 스크리닝 플랫폼의 효능은 관련 신호 전달 경로에서 이러한 유도 효과의 재현성을 통해 평가되었습니다. 이러한 대표적 결과에서 알 수 있듯이, betaine과 siRNA는 RKO 세포의 8가지 XTCF 리포터 활성에 영향을 주지 않았습니다. 이는 각각 APC 경로가 결핍되어 억제 단백질이 부족하거나, 활성화된 형태의 β-catenin을 발현하는 DLD-1 및 HCT116 세포와는 대조적입니다.

이후, 이 리포터들을 함께 사용하여 이 그래프들에 표시된 siRNA 풀을 통해 Wnt beta-catenin, P53 및 KRAS 신호 전달 경로의 유전자 활성을 동시에 측정할 수 있음이 입증되었습니다. Y축에는 상대적 루시퍼라아제 활성이 표시되어 있으며, X축에는 해당 표적 유전자를 타겟팅하는 siRNA가 표시되어 있습니다. 예를 들어, beta-catenin을 타겟팅하는 siRNA 풀은 Wnt beta-catenin 경로의 활성을 감소시키지만, P53 및 KRAS 경로에는 유의미한 영향을 미치지 않습니다.

다중 리포터 시스템을 개발할 때는 형질전환 효율과 리포터 신호의 목적에 맞게 대상 세포주를 최적화하는 것이 중요합니다.