Name: 배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 학습하세요 멀티플렉스 루시페라스 기반 스크리닝으로 P53, WNT, KRAS 암 신호전달 경로를 동시 분석하는 방법을 배우세요. HCT116 대장암 세포에서 유전자 기능을 효율적으로 연구할 수 있습니다.

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우리는 CPRIT (RP100119) 및 웰치 재단 (I-1665)의 자금 지원을 인정합니다.

전체 프로토콜은 약 사일 소요됩니다. 1. siRNA를 및 기자 형질에 대한 세포의 준비 우리는 여기에서 설명을위한 게놈 전체의 siRNA 라이브러리에서 siRNAs에의 작은 집합 (하나의 유전자를 대상으로 배 siRNAs에 구성된 각 풀에 96도 형식으로 384 가지의 siRNA 풀 배열)을 사용하여 siRNA의 라이브러리를 심문하기위한 프로토콜을 소개합니다. 이 특정 연구를 위해, 우리는 HCT116 비정상적인 Wnt의와 크라스 신호를 전시 세포와 p53의 활동을 이용합니다. 관심의 다른 세포 프로세스를 심문을 목표로 연구에 적절한 셀 라인은 식별 유사한 방식으로 평가해야합니다. <ol><li> 2 % 철을 함유 Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) 10 mL로 중화 한 다음 트립신 솔루션 / 판 1 ㎖를 사용하여 트립신에 의해 PBS 다음 수확 세포와 80 % ~ 90 % 합류 HCT116 세포 5 × 10cm 2 판을 씻어탈 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 판. </li><li> DMEM / 2 % FBS / 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 10 ㎖에 50 ML 원뿔 튜브에 정지 세포를 전송하고 5 분 ~ 130 XG에서 centrifugate, 상층 액을 제거하고 다시 중단 세포 펠렛. </li><li> 셀 카운터와 세포 수를 계산 한 다음, 10 5 세포 / ml의 세포 솔루션을 만들어 다음 단계를위한 150 ML의 세포 현탁액을 유지합니다. 멀티 드롭 자동화 된 액체 디스펜서 (이제부터는 멀티 드롭)를 사용하여 96도 세포 배양 플레이트의 각 우물 판 (10) 4 셀 (100 μL). 세포 현탁액은 도금 12 × 96 웰 플레이트이 경우 충분합니다. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° 인큐베이터에서 C에서 세포와 번호판을 품어의 transfection 혼합물을 준비하는 동안. </li></ol> 2. 기자 구문 재고 솔루션을 준비 <ol><li> 분리 고품질 기자는 표준 midiprep 키트 (NucleoBond 엑스트라 미디가 제작하여 사용하여 DNA를 구성그리고 Clontech 사)는 각 기자 1 MG / ML의 최종 농도로 DNA를 희석. </li><li> 기자는 p53의-FL 30 μL, 8X TCF-RL, Elk1-GAL4의 30 μL, 10 μL UAS-CL과 함께 DNA의 혼합을 달성하기 위해 H 2 O 4 μL의 30 μL를 결합하여 주식 솔루션을 구축의 100 μl를 준비 기자의 최종 1:1:1:0.2 비율입니다. 이 DNA 혼합 원액의 최종 DNA 농도는 0.3 ㎎ / ML입니다. </li></ol> 3. siRNA를 / DNA 형질 믹스를 준비 프로토콜의이 부분에서, 우리는 12 × 96 잘 접시를 형질에 대한 충분합니다 siRNA의 / DNA 형질 믹스를 준비합니다. siRNAs는 4 X 96 웰 플레이트의이 테스트 라이브러리, 우리는 세중의 각 siRNA의 풀을 형질 것입니다. 우리가 사용하는 형질 시약 Effectene (Qiagen의)이라고합니다. 우리의 손이 배양 세포에의 siRNA 및 DNA의 동시 배달을 위해 작동하는 전용 시약이다. <ol><li> 기자 구조 주식 졸의 80 μl를 희석3 μg / ML의 최종 농도로 DNA 솔루션을 달성하기 위해 EC 버퍼 (Effectene 키트)의 8 ML의 ution. 일반적으로, 즉시 사용을위한 충분한 DNA 솔루션 믹스를 준비합니다. </li><li> 96도 / 플레이트의 각 웰이 DNA 솔루션의 플레이트 (20) μL. 96 잘 플레이트의 수는 siRNA의 풀 테스트 할 얼마나 많은에 따라 달라집니다. 예를 들어,이 경우에 우리는 384 다른 siRNA의 풀을 평가하는 4 × 96 웰 플레이트가 필요합니다. </li><li> 테스트 할 siRNAs는 5 μM의 주식 농도에 있어야합니다. 하지 않으면, 그들은 복제가 도금 및 각 라이브러리와 연관된 권장 희석 버퍼를 사용하여이 농도로 희석 할 수 있습니다. </li><li> 잘 Biomek 자동 액체 처리기와 희석 DNA 주식을 포함하는 PCR 플레이트의 해당 각 5 μm의 siRNA의 주식의 2 μl를 전송합니다. 연구의 규모에 따라 멀티 채널 피펫은 충분합니다. </li><li> 이제, 우리는 DNA / siRNA의 PLA의 각 웰에 증강 용액 (Effectene 키트) 1 μl를 추가합니다테. 이것은 다시 자동 액체 핸들러 또는 멀티 채널 피펫으로도 수행 할 수 있습니다. </li><li> 각 well에 Effectene 형질 시약의 3 μl를 추가하고 추가로 10 분 동안 RT에서 품어 증강 반응이 5 분 RT에서 발생 할 수 있습니다. </li><li> 형질 복잡한 형성을 중지하려면, PCR 플레이트의 각 웰에 10 ㎕의 DMEM / 2 % FBS / 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. </li><li> 세포 (세포 배양기에서 검색)을 포함하는 96 잘 플레이트의 각 웰에 형질 믹스의 10 μl를 전송합니다. 각 형질은 세중의에서 수행되므로, 동일한 믹스 세포를 포함하는 두 개의 추가 96 잘 접시에 적용됩니다. </li><li> 36 시간 동안 5 % CO 2 가습 환경에서 37 ° C에 추가 형질 혼합물로 세포를 품어. </li></ol> 4. 세포 샘플에서 루시 페라 제 활동을 결정 36 시간 후, 루시퍼 활동 측정을위한 준비형질 세포합니다. 엔드 포인트 당 실험 방식에 의해 결정해야한다. 본 연구에서는 36 시간의 배양 시간 이전 결과 결정 의미를 충분히 강력한 신호를 굴복했다. 이 연구는 여러 기자 (세포 세포질에서 발현 배지, 두 사람으로 분비 한) 통합으로, 우리는 모두 배양 배지뿐만 아니라 세포 파쇄물에서 측정 값을 얻을 것이다. <ol><li> 문화 매체 CL 활동의 탐지 : <ol><li> 배양액 20 μL은 복제 도금 흰색 불투명 96 웰 플레이트 (중 Biomek 액체 처리기 또는 멀티 채널 피펫을 사용)합니다. </li><li> 각 well에 CL 분석 버퍼 20 μl를 (시스템 대상)를 추가합니다. </li><li> 각 well에 Cypridina 루시페린 기판 (시스템 대상)의 10 μl를 추가하고 luminometer (예를 들어 BMG에 의해 생성 된 Pherastar 플레이트 리더)를 사용하여 CL 활동을 감지합니다. </li></ol></li><li> FL 및 RL 활동 감지 : <ol><li> C를 용해먼저 문화 매체를 제거하여 ELL 학생. 이것은 거꾸로 판을 켜고 싱크 매체를 던지기에 의해 신속하게 수행 할 수 있습니다. 나머지 매체는 부드럽게 종이 타월에 거꾸로 판을 눌러 제거 할 수 있습니다. 플랫폼 로커에 멀티 드롭과 장소를 사용하여 세포의 각 웰에 1X 수동 용해 버퍼 (Promega 사)의 30 μl를 추가 RT에서 5 분 중간 속도를 설정합니다 (Bellco이가 만드는 한 회사입니다.) </li><li> luminometer를 사용하여 멀티 드롭 즉시 측정 FL 활동을 사용 루시 페라 제 분석 시약 II (프로 메가 듀얼 루시 페라 키트의 일부)의 20 μl를 추가합니다. 다음으로, 추가 및 중지 FL 활동을 담금질하고 RL 활동의 측정을 허용합니다 저런 형광 시약 (Promega 사). 참고 : 확장 된 신호 지속 시간 (예 : 프로 메가에서 이중 글로 루시 페라 키트 등)을 허용 기판 믹스를 사용하지 않는 플래시 키트의 사용은 기판뿐만 아니라시 신속한 측정 (5 분 이내)이 필요합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

OK와 LL는 루시 페라 기술을 다중화와 관련된 특허 출원에 저자입니다.

처음으로 높은 처리량 화면을 접대하는 데 유용에 대한 온라인 리소스를 제공 루시퍼 기반 기자 시스템의 여러 조달업자 (예 : Promega 사 등, 대상 시스템, 뉴 잉글랜드 Biolabs가, 그리고 써모 피셔)가 있습니다. 또한, 유전자 발견 방법 및 RNAi의 기반 검사 결과는 다른 - 오 믹스 기반 데이터 셋과 통합 될 수 높은 처리량 스크린의 사용을 최적화에 대한 훌륭한 리뷰의 숫자는 도움 15,16해야합니다. 높은 처리량 화면에서 &quot;히트&quot;의 선택 방법은 본 보고서의 범위를 넘어서는 또 다른 토론의 주제입니다. 이 주제에 대한 몇 가지의 리뷰 17,18 사용할 수 있습니다. 그러나 transcriptionally 활성화 기자의 사용에 따라 화면에서 선택한 안타를 검증하는 중요한 기준은 측정 된 RT-PCR, qPCR에 사용하여 검증 표적 유전자에 동일한 효과를 유도하는 동일한 perturbagen (RNAi의 또는 화학적 기반)를위한 기능입니다또는 마이크로 어레이...

세포 생물 학적 과정의 다양한 배열을 모니터링 루시퍼 기반 기자의 다양한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 DNA의 대부분은 특정 세포 자극이나 교란에 의해 표현하는 유도 루시퍼 단백질을 인코딩 구성합니다. 가장 강력한 transcriptionally 기반 기자 합성 증강 요소 또는 유전자의 프로모터 영역 생리학 관련 전사 이벤트 1,2를보고 자신의 신뢰성을 잘 확립의 제어하에 루시 페라 제 효소의 발현을 배치합니다. 루시 페라 제 단백질 발현을 유도하는 GAL4-UAS를 활용 횡단 기자 루시퍼 시스템도 있습니다. GAL4는 효모 전사 활성과 UAS는 GAL4은 특별히 3의 하류에 배치 유전자 서열의 전사를 활성화하기 위해 바인딩을 증강이다. 루시퍼 시스템의 이러한 유형은 일반적으로 두 개의 DNA 플라스미드에 의해 지원됩니다 - 하나는 조절기와 융합 GAL4 단백질을 인코딩스피 관심의 단백질의 부분, 두 번째는 하나 이상의 UAS 시퀀스의 제어 아래에 배치 루시 페라 제 단백질을 인코딩합니다. 따라서, 세포 루시 페라 제 신호가 관심의 단백질의 활동 수준을 반영합니다. 루시 페라 기반 기자의 또 다른 일반적인 사용은 그 단백질 루시 페라 제 효소 4 융합 그것에 의하여 단백질의 안정성을 모니터링합니다. 하나의 잘 심문 한 어떤 기자의 특이성을지지 않습니다 수에 관계없이 기자의 종류,주의 위험 부담이 여기에 기록됩니다. 따라서, 실사가 어떤 연구 전략의 새로​​운 리포터 구조의 결합이 필요합니다. 루시 페라 제 효소 읽기 중 선택의 발현을 제어하는​​ DNA 요​​소의 신뢰성만큼 중요 할 수 있습니다. 반딧불 루시 페라 제 (FL)에 시판 구조에서 가장 일반적으로 사용되는 효소 반면, (경우와 같이 ATP를 필요로하지 않는 새로운 루시 페라 제 리포터 시스템의 출현FL-기반 반응) 또는 그이 연구 플랫폼의 효율성과 안정성을 개선 할 것을 약속 강한 신호를 방출 안정 효소를 통합합니다. 화학 연구에서 루시 페라 제 기자의 선택에 관한 중요 사항을 거짓보고에 상승을 줄 수있는 화학 물질 억제 FL의 감수성이다. 우리의 경험에서, 기판으로 coelenterazine 활용 등 Renilla의 또는 Gaussia 루시 페라 제 (각각 RL 및 GL) 등의 효소가 덜 쉽게 작은 분자 5에 의해 억제합니다. 다중 루시 페라 읽기 아웃에 대한 가장 일반적인 형식은 주로 순차적으로 하나의 샘플에서 효소 활동을 측정 할 수있는 기능을 사용하기 쉬운 키트의 가용성을 부여 FL과 RL의 사용을 수반한다. 대부분의 키트에 샘플을 먼저 동시에 secon를 산출하기 coelenterazine에 기탁되어 담금질 시약 다음 FL 활동의 수준을 나타 내기 위해 루시페린에 노출되는dary RL 신호. 이러한 GL하거나 사용하는 등 Cypridina 루시 페라 제 (CL), luciferases를 사용하여 높은 콘텐츠 데이터를 등장 생성을위한 가능성의 큰 번호와 같은 또 다른 기질로 분비 될 수있는 다른 luciferases의 추가와 함께. 이 기술을 사용하여 게놈 전체의 RNAi 화면의 예는 다음 6 찾을 수 있습니다. 이러한 기술적 진보는 차례가 크로스 토크 7을 제한하기 위해 루시 페라 제 효소의 각 유형을 냉각하는 특정 메커니즘의 개발에 박차를 가했다. 우리 손에, 우리는 GL 또는 CL 등의 분비 luciferases와 &quot;가장자리 효과&quot;(높은 역가 문화 접시의 가장자리와 관련된 세포 활동의 설명 할 수없는 경향)의 큰 주파수를 확인합니다. 그들은 세포 생존을 adulterating없이 신호 샘플링을 가능으로, 다른 한편으로는, 이러한 분비 luciferases은 운동 분석에 유용합니다. 여기에 제시된 연구를 위해, 우리는 동시에 세 개의 암 관련의 활동을 모니터링 할세포 과정 : p53의, 크라스, 그리고 Wnt의 신호 전달 경로. ,, 우리의 연구에 통합 기자 Clontech 사에서 pp53-TA-뤽 FL 기자 (이제부터는 p53의-FL 기자라고도 함) 8 Elk1-GAL4/UAS-CL 기자 시스템 (애질런트 이제부터는 엘크-1 기자)입니다 와 T-세포 인자 (또는 TCFS) 9-11로 알려진 Wnt의 경로 전사 규제에 의해 인식 여러 합성 증강 요소를 통합 8X TCF RL 기자.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>PathDetect Elk1 트랜스 보고 시스템</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>219005 경로 프로파일링 루시페라제 시스템 4 pp53-TA-Luc Vector</td><td>Clontech Lab Inc.</td><td></td><td></td>631914</tr><tr><td>Effectene 트랜스펙션 시약</td><td>Qiagen Inc.</td><td></td><td></td>301427</tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega Corp.</td><td>E1960</td><td></td></tr><tr><td>Cypridina Luciferase 분석 시약</td><td>표적 시스템</td><td>VLAR-1</td><td></td></tr><tr><td>HCT116 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Fluo 세포 독성 분석</td><td>Promega Corp.</td><td>G9260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>MultiFlo 마이크로플레이트 디스펜서</td><td>Labsystems Inc.</td><td>모델 832</td><td></td></tr><tr><td>Biomek FXP 실험실 자동화 워크스테이션</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A31842</td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar FS-다중 모드 HTS 마이크로플레이트 리더</td><td>BMG 랩텍 Inc.</td><td>0471-101A</td><td></td></tr><tr><td>브라이트 라인 Reichert 혈구 측정기</td><td>Hausser Scientific Company</td><td>1490</td><td></td></tr></tbody></table>

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

RNA 간섭 (RNAi의)를 사용하여 유전자 기능의 게놈 규모의 심문은 화학적으로 취급하기 쉬운 암 세포 취약점의 신속한 식별을위한 엄청난 약속을 보유하고 있습니다. 이 기술의 잠재력을 제한하면 신속하게 표현형 결과의 기계론의 기초를 묘사함으로써 분자 표적 치료 전략의 개발을 알리는 무능력이다. 우리는 주요 암 세포 관련 프로세스를 모니터링 할 수 있도록 다중 기자 시스템을 사용하여 대상 RNAi를 매개 유전자에 의한 세포의 표현형을 해체하기 위해 여기 방법을 설명합니다. 이 높은 콘텐츠 심사 방법은 다재다능하고 쉽게 큰 분자 라이브러리의 다른 종류의 검사를 위해 적용 할 수 있습니다.

대규모 게놈 시퀀싱 노력 12-14를 사용하여 다양한 암의 돌연변이 풍경을 매핑의 발전에도 불구하고, 우리는 여전히 그 자리에 개입 전략에 이러한 관측을 번역하기위한 체계적인 접근 방법을 가지고 있지 않습니다. / Wnt는 β-catenin 신호, p53의, 그리고 크라스 신호 - - 대장 암 (CRC), 세 가지 세포 프로세스의 구성 요소에 영향을 미칠 것으로 예상되는 돌연변이들은 창자의 세포 변화의 주요 드라이버입니다 제안 모든 종양의 99 %에서 발견된다 13. 따라서, 암 게놈 데이터 집합 가능성이 과정을 촉진 공통 분모 암을 지원하는 유전자 충실하고는 암 세포 취약점의 신속한 식별을 위해 악용 될 수 있습니다. 이 가설을 조사하기 위해, 우리는 / Wnt의 β-catenin 신호, p53의, 그리고 크라스 신호와 관련된 유전자 기능의 높은 처리량 심문 의무 전략을 고안했습니다. 우리는 첫 번째 싱글 reporte 각 기자 시스템의 특이성을 보여R 테스트 (그림 1)...

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

다음 프로토콜의 전반적인 목표는 여러 세포 판독값을 동시에 모니터링함으로써 게놈 규모의 유전자 기능 분석을 가능하게 하는 것입니다. 본 시연에서는 P 53, WINT 및 KRAS 경로의 활성을 각각 모니터링하기 위해 Firefly RAN 및 Cipro Dina Luciferase 기반 리포터를 사용합니다. 이 세 가지 리포터는 관심 유전자를 표적으로 하는 irna와 함께 대장암 세포주인 HCT one 16 세포에 공동 형질전환됩니다.이어서, 세포 용해물에서 반딧불이 루시페레이스(firefly luciferase)와 바닐라 루시페레이스(vanilla luciferase) 활성을 측정하며, 분비 효소인 Cipro DEA 루시페레이스의 활성은 배양액에서 측정합니다. 얻어진 중간 결과는 분석 시스템의 재현성뿐만 아니라, 세 가지 암 관련 경로 내 유전자들의 공통 및 고유 작용을 밝혀내는 능력을 보여줍니다.마이크로어레이(microray)나 다색 프로브(multicolor pries)와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포 전사 출력물을 관찰하는 저렴하고 보편적이며 비용 효율적인 방법이라는 점입니다. 이 방법은 분자 표적 치료 전략의 개발과 같은 암 연구 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 일시적 형질전환(transient transfect) 프로토콜은 IL과 스크리닝 설정을 위한 최소한의 사전 시간 투입만으로 가능하지만, 웰 간 신호 가변성을 증가시킬 가능성이 있습니다. 이는 웰의 절대적인 수치 대신 리포터 비율을 분석함으로써 보완할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 80~90%까지 합류(confluent)된 HCT 16 세포가 담긴 10 cm² 플레이트 5개를 PBS로 세척한 후, 각 플레이트의 세포를 트립신 처리(trypsinization)하여 회수하십시오.1 mL의 trypsin 용액을 사용한 후, 2% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 포함된 10 mL의 DMEM으로 중화합니다. 부유된 세포를 50 mL 원심분리관으로 옮기고 약 130 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 10 mL의 배지에 다시 부유시킵니다.세포 계수기로 세포 수를 센 후, mL당 10⁵ cells의 세포 현탁액을 제조합니다. 멀티 드롭 자동 액체 분주기를 사용하여 다음 단계를 위해 150 mL의 세포 현탁액을 준비합니다. 96-웰 배양 플레이트의 각 웰에 100 µL 또는 10⁴ cells를 분주합니다.이 경우 세포 현탁액은 1296-웰 플레이트에 분주하기에 충분한 양이어야 합니다. transfection 혼합물을 준비하는 동안, 세포가 담긴 플레이트를 5% carbon dioxide가 포함된 37 °C 인큐베이터에서 배양하십시오. 여기에 사용된 고품질 리포터 컨스트럭트 DNA는 표준 MIDI prep 키트를 사용하여 분리하였으며, 최종 농도가 1 mg/mL가 되도록 희석하였습니다.각 리포터에 대해, P 53, FL 30 µL, eight X-T-C-F-R-L 30 µL, elk one G 30 µL, U-A-S-C-L 6 µL, 그리고 H₂O 4 µL를 혼합하여 100 µL의 리포터 컨스트럭트 스톡 용액을 준비합니다. 이렇게 하면 리포터의 최종 비율이 1:1:1:0.2이고 최종 DNA 농도가 0.3 mg/mL인 DNA 혼합물이 됩니다. 다음으로, 1296개를 트랜스펙션하기에 충분한 양의 I-R-N-A-D-N-A 트랜스펙션 혼합물을 준비합니다.웰 플레이트에서 리포터 컨스트럭트 스톡 용액 80 µL를 QIAGEN 이펙팅 키트의 EC 버퍼 8 mL에 희석하여 최종 농도가 3 µg/mL인 DNA 용액을 준비합니다. 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 DNA 용액 20 µL를 분주합니다. 96-웰 플레이트의 개수는 테스트할 irna 풀의 수에 따라 달라집니다.예를 들어, 이 경우에는 평가를 위해 4개의 96-well 플레이트가 필요합니다. Biome 자동 액체 핸들러를 사용하여 384가지의 서로 다른 siRNA 풀 중 각 5 µM siRNA 2 µL를 희석된 DNA 스톡이 포함된 PCR 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 다음으로, DNA-siRNA 플레이트의 각 웰에 enhancer 용액 1 µL를 첨가합니다.인핸서 반응이 실온에서 5분 동안 일어나도록 둡니다. 그 후, 각 웰에 transfection 시약 3 µL를 첨가하고 실온에서 10분 동안 더 배양합니다. transfection 복합체 형성을 중단시키기 위해, PCR 플레이트의 각 웰에 2% FBS와 1% penicillin streptomycin이 포함된 DMEM 10 µL를 첨가합니다.HCT 116 세포가 포함된 96웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 각 트랜스펙션은 3반복으로 수행되므로, 세포가 들어 있는 96웰 플레이트의 각 웰에 트랜스펙션 혼합물 10 µL를 옮깁니다. 동일한 혼합물을 세포가 포함된 추가 96웰 플레이트 2개에도 동일하게 처리합니다.세포를 transfection 혼합물과 함께 37 °C, 5% carbon dioxide가 포함된 습윤 환경에서 36시간 동안 배양합니다. 세포 transfection 후 36시간이 지나면, Luciferase 활성을 측정할 준비가 됩니다.본 연구는 배양 배지로 분비되는 리포터 하나와 세포질에서 발현되는 다른 두 개의 리포터 등 여러 리포터를 포함하고 있습니다. 배양액 내의 Cipro Dina luciferase 또는 CL 활성을 검출하기 위해 배양 배지와 세포 용해물 모두에서 측정을 수행합니다. 배지 복제 플레이트.흰색 불투명 96-웰 플레이트에 배지 20 µL를 분주합니다. 멀티드롭을 사용하여 각 웰에 CL 분석 버퍼 20 µL를 추가합니다. 다음으로, 각 웰에 Cipro Dina Lucifer 및 기질 10 µL를 추가하고 루미노미터를 사용하여 반딧불이 루시퍼레이스(firefly luciferase) 및 바닐라 루시퍼레이스(vanilla luciferase) 활성을 검출하여 CL 활성을 측정합니다. 단, 먼저 세포 용해물을 준비해야 합니다.각 플레이트를 거꾸로 뒤집어 배지를 싱크대에 버림으로써 세포에서 배양액을 제거합니다. 뒤집힌 플레이트를 페이퍼 타월 위에 가볍게 두드려 남은 배지를 제거합니다. 각 세포 웰에 1x passive lysis buffer 30 µL를 첨가합니다.플레이트를 중속으로 설정된 플랫폼 로커에 올리고 상온에서 5분 동안 반응시킵니다. 5분 후, 각 세포 웰에 luciferase assay 시약 20 µL를 첨가하고 루미노미터를 사용하여 즉시 firefly luciferase 활성을 측정합니다. 다음으로, stop and glow 시약을 첨가하여 firefly luciferase 활성을 억제한 후 luciferase 활성을 측정합니다.멀티플렉싱을 수행하기 전에 세 가지 서로 다른 스크리닝 플랫폼의 견고성을 개별적으로 평가하였습니다. 명시된 대장암 세포주에 WNT, beta-Catenin, P53 또는 KRAS를 각각 표적으로 하는 siRNA 풀과 함께 8개의 XTCF, PP, 53, ta, Luke 또는 ALK1 Firefly Luciferase 인코딩 리포터 컨스트럭트를 트랜스펙션하였습니다. 각 세포주에 대한 경로 관련 유전형이 표시되어 있습니다.각 스크리닝 플랫폼의 효능은 관련 신호 전달 경로에서 이러한 유도 효과의 재현성을 통해 평가되었습니다. 이러한 대표적 결과에서 알 수 있듯이, betaine과 siRNA는 RKO 세포의 8가지 XTCF 리포터 활성에 영향을 주지 않았습니다. 이는 각각 APC 경로가 결핍되어 억제 단백질이 부족하거나, 활성화된 형태의 β-catenin을 발현하는 DLD-1 및 HCT116 세포와는 대조적입니다.이후, 이 리포터들을 함께 사용하여 이 그래프들에 표시된 siRNA 풀을 통해 Wnt beta-catenin, P53 및 KRAS 신호 전달 경로의 유전자 활성을 동시에 측정할 수 있음이 입증되었습니다. Y축에는 상대적 루시퍼라아제 활성이 표시되어 있으며, X축에는 해당 표적 유전자를 타겟팅하는 siRNA가 표시되어 있습니다. 예를 들어, beta-catenin을 타겟팅하는 siRNA 풀은 Wnt beta-catenin 경로의 활성을 감소시키지만, P53 및 KRAS 경로에는 유의미한 영향을 미치지 않습니다.다중 리포터 시스템을 개발할 때는 형질전환 효율과 리포터 신호의 목적에 맞게 대상 세포주를 최적화하는 것이 중요합니다.

a-multiplexed-luciferase-based-screening-platform-for-interrogating

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

Circadian 시계는 개별 세포 내 기능, 즉, 그들은 세포 자율적 있습니다. 여기, 우리는 비 침습적, 루시 페라 기반의 실시간 bioluminescence 기술을 사용하여 셀 자치 클럭 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 리포터 전지는 circadian 생물학을 공부를위한 다루기 쉬운, 기능 모델 시스템을 제공합니다.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

이 비디오에서는 약물의 민감하고 신속한 스크리닝을 위한 생물 발광 분석의 유용성을 강조하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 약물은 단독으로 또는 조합하여 작용 방식의 시너지 효과를 평가할 수 있습니다.

세포 생물 발광 기반 분석법: 조합 약물 스크리닝을 위한 고처리량 방법

이 비디오에서는 세포 내 ATP 수준을 세포 대사 활동의 마커로 사용하는 테스트 에이전트로 치료할 때 환자 유래 오가노이드에서 세포 생존력을 평가하기 위한 신속한 단일 추가 분석을 시연합니다. 세포 내 ATP 수준은 루시퍼라제/루시페린 반응을 사용하여 측정되며, 여기서 방출된 빛의 강도는 세포 생존력을 나타내고 차례로 테스트 에이전트의 성장 억제 효능을 나타냅니다.

ATP 기반 루시페라제 생존력 분석: 종양 오가노이드에 대한 시험제의 성장 억제 가능성을 평가하기 위한 동질적인 방법

이 동영상은 루시페라아제 태그가 지정된 단백질을 정량화하는 데 사용되는 루시페라아제 분석을 보여줍니다. 이 분석은 관심 단백질과 접합된 작은 단편과 결합하는 큰 단편으로 구성된 엔지니어링된 루시페라아제 효소를 사용합니다. 결합된 소단위체는 기질이 있을 때 발광 신호를 방출하는 활성 효소를 형성합니다. 그런 다음 이 신호는 광도계를 사용하여 정량화됩니다.

Luciferase Assay: 엔지니어링된 Nanoluciferase 시스템 기반 바이오리포터를 사용하여 발광 신호를 측정하는 고처리량 분석

우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

여기에 우리가 현재 큰 종양 억제기 (라트)의 키 니 아 제 활동을 계량 luciferase 기반 바이오 센서-Hippo 신호 전달 경로에 중앙 니. 이 바이오 센서는 다양 한 응용 프로그램 기본 및 변환 연구 마 통로 레 귤 레이 터에서 생체 외에서 그리고 vivo에서조사 목적에 있다.

Hippo 신호 Luciferase 기반 큰 종양 억제기 (라트) 바이오 센서를 사용 하 여 경로 활동 모니터링

전사 인자의 새로운 조절자를 확인하기 위해, 우리는 이중 luciferase 기반 의 전사 기자 분석을 사용하여 배열 된 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 RNAi 라이브러리를 선별하는 접근 법을 개발했습니다. 이 방법은 단일 실험에서 수백 개의 후보를 선별하는 빠르고 비교적 저렴한 방법을 제공합니다.

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

이 프로토콜은 종양 내 이질성을 포착하기 위해 다중 매개변수, 단일 오가노이드 약물 반응을 정량화하고 시각화하기 위한 중간 및 고처리량 오가노이드 약물 스크리닝 및 현미경에 구애받지 않는 자동 이미지 분석 소프트웨어를 위한 반자동 방법을 설명합니다.

벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

환자 유래 종양 오가노이드는 기초 및 중개 연구를 위한 정교한 모델 시스템입니다. 이 방법 기사에서는 다양한 오가노이드 표현형의 동시 역학 평가를 위한 다중 형광 라이브 셀 이미징의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

암의 환자 유래 오가노이드 모델에서 약물 반응을 위한 다중 라이브 셀 이미징

폐암에 대한 새로운 치료법 개발의 주요 과제에는 국소 질환이 전이성 질환으로 진행됨에 따라 종양 미세 환경을 모델링하는 것이 포함됩니다. 여기에서는 시간이 지남에 따라 질병의 생체 내 추적을 가능하게 하는 폐암의 동소 동계 모델을 확립하는 간단한 방법을 설명합니다.

폐암의 동계 동소 마우스 모델을 생성하기 위한 최소 침습적 방법

학습하세요 멀티플렉스 루시페라스 기반 스크리닝으로 P53, WNT, KRAS 암 신호전달 경로를 동시 분석하는 방법을 배우세요. HCT116 대장암 세포에서 유전자 기능을 효율적으로 연구할 수 있습니다.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

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