Name: 형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석 제자리에서 하이브리드 사카 cerevisiae의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 단일 분자 수준으로 mRNA를 검출하고 정량화하는 형광 제자리 하이브리드화(FISH) 기법을. 이 방법은 전사 조절 및 전사체 국소화 연구에 활용됩니다.

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본 연구는 보조금 GM046406 (DB)로하여 정량 생물학의 일반 의료 과학 센터 (GM071508)의 국립 연구소에 의해 지원되었다. RSM은 NSF 대학원 연구 원정대의 자금을 인정합니다. MNM는 루이스 - Sigler 원정대에 의해 지원됩니다. 우리는 신진 대사주기 프로젝트에 자신의 기여에 도움이 토론과 전 회원 알레그라 Petti는과 니콜라이 Slavov에 대한 Botstein 실험실의 구성원을 인정하고 싶습니다. 우리는 우리가 FISH 방법을 시작하기 위해 다니엘 Zenklusen와 로버트 싱어 감사합니다.

그림 1과 2는 물고기 실험 절차 및 FISH 이미지를 정량화에 사용되는 이미지 분석 파이프 라인의 회로도이다. 1. 준비 할 솔루션 * 아래 솔루션은 가수 프로브와 함께 사용하기위한 것입니다. 스텔라리스 프로브를 사용하는 경우, 하이브리드 버퍼 및 세척 버퍼 모두에서 &quot;10 %의 포름 아미드&quot;로 &quot;40 % 포름 아미드&quot;을 대체합니다. 하이브리드 버퍼에 추가로 변경 스텔라리스 프로브를 사용하여 (1) 1g 덱스 트란 황산을 추가하고 (2) 10 ㎎ ssDNA에 포함되지 않습니다이다. 버퍼 B 8 ML 1 M KH 2 PO 4 41.5 ML 1M K 2 HPO 4 소르비톨 109.3 g Spheroplasting 버퍼 890 μL 버퍼 B 100 μL VRC 10 μL 25,000 U / ㎖ Lyticase 2 μL β-메르 캅 토 에탄올 &lt;강해&gt; 하이브 리다이 제이션 버퍼 (10 ㎖, 최종 볼륨) 10 ㎎ E. 대장균 tRNA의 10 ㎎ ssDNA하기 * 100 μl의 200 mM의 VRC 주식 50 MG / ML BSA의 40 μL 1 ML 20X SSC 4 ML 40 % 포름 아미드 * 핵산 무료 물 (10 ㎖ 최종 볼륨) 1g 덱스 트란 황산 * * 하이브리드 버퍼 편의를 위해 -20 ° C에서 0.5 ML의 aliquots에 보관 될 수 있습니다. (50 ml의 최종 볼륨) 버퍼를 씻어 5 ML 20X SSC 20 ML 40 % 포름 아미드 * 핵산 무료 물 (50 ML 최종 볼륨) 버퍼 레이블 1.06 g 나트륨 탄산염 100 ML DEPC 물 pH가 9 2. 프로브 라벨 (가수 프로브 만) 우리는 ABI 올리고 뉴클레오타이드 합성 장치를 사용하여 사내 합성하여이 프로브를 얻을 수 있습니다. Typic동맹은 4-5 ~ 50 염기쌍 올리고 뉴클레오티드는 바람직하게는 10 적어도 8 + BP 이격 여러 thymidines에 대한 아미노 알릴 티미 딘을 대체, 관심의 유전자 상동하는 합성된다. CY 염료를 사용하는 경우 때문에 오존 민감성, 우리는 오존이없는 시설에서 작동합니다. <ol><li> ~ 5 프로브를 취득하고 100 μL 물에 resuspend을 - Nanodrop 분광에 체크 농도를. </li><li> 얼마나 많은 프로브 / 유전자, 10 μg의 올리고 뉴클레오티드 / 유전자의 전체 조합에 따라 (예를 들면 5 프로브 / 유전자가 다음 2 ㎍ / 프로브를 원하는 경우). </li><li> QIAquick 염기 제거 키트 프로토콜에 따라 프로브를 정화 QIAquick 열을 사용합니다. </li><li> 버퍼 PN이 결합 된 프로브 및 믹스의 볼륨을 합계하기 위하여 10 볼륨을 추가합니다. </li><li> QIAquick 열에 샘플을 적용 - 총 부피가 750 ㎕의보다 큰 경우, 각 스핀에 볼륨의 절반을 사용하여 두 번 스핀 다운 </li><li> 1 분 동안 서 보자. </li><li> 6,000 rpm에서 1 분 원심 분리기. </li><li> 750 μL 버퍼 PE로 씻으십시오. </li><li> 원심 분리6,000 rpm에서 1 분. </li><li> 건조 13,000 rpm에서 1 분간 통해 흐름과 재 스핀 열의 폐기하십시오. </li><li> H 2 O의 pH가 7.0 및 8.5에서이며 막에 직접 배치되어 있는지 확인하십시오 - 새로운 microcentrifuge 관 50 μL H 2 O와 용출의 DNA에있는 장소 QIAquick 열입니다. </li><li> 1 분 동안 서 보자. </li><li> DNA를 용출하는 13,000 rpm에서 1 분간 원심 분리기. </li><li> 45 ℃에서 DNA를 냉동 건조 </li><li> 를 Resuspend 10 μL 라벨 버퍼에 펠렛과 염료를 건드리지 않고 염료의 튜브에 추가합니다. </li><li> 또 다른 10 μL 라벨 버퍼 반복합니다. </li><li> 소용돌이와 염료 DNA의 튜브를 스핀 다운. </li><li> 알루미늄 호일로 튜브를 포함하고 레이블을 RT O / N에 어두운 곳에서 보관하십시오. </li><li> QIAquick 염기 제거 키트 프로토콜을 반복합니다. 두 개의 차이점 수행 - 프로브에 200 μL PN 버퍼를 추가하고 열 배를 통해 표시된 프로브를 넣어. - 용출 전에 무소속 염료를 씻어하기 위해 버퍼 PE 3 세척을 수행합니다. </li><li> AF터 용출은 Nanodrop 분광을 통해 농도를 얻을 수 있습니다. 라벨 효율은 일반적으로 단일 가닥 DNA의 ~ 0.25 pmol의 / NG입니다. </li></ol> 3. coverslip을 준비 <ol><li> 플라즈마 부리로 가지런 히 진공 챔버 (의 슬라이드에 배치 coverslips는 <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (더 중심 가까이). </li><li> 전자 레인지에 진공 챔버 넣어 봉인되어 있는지 확인합니다. </li><li> 펌프를 켜고는 먼저 펌프가 시작되고 한 번 진공 청소기의 전원을 켭니다. </li><li> 전자 레인지를 켜고 플라즈마 표시 후 5 초를 중지합니다. </li><li> 펌프 후 진공을 해제합니다. </li><li> 진공 챔버를 당겨 집게 (추락 한 사람들은 다시 청소해야합니다)와 coverslips를 제거합니다. </li><li> 장소는 12 - 웰 플레이트의 세척면을 위로하여 coverslips를. </li></ol> 4. 고정 절차 <ol><li> 최소한 미디어의 주위에 0.1-0.2의 OD 600 효모 성장. 세포를 10 ml의 충분한 FO를 얻을 수R ~ 10 별도의 교잡. </li><li> 성장 미디어 (문화의 10 ㎖ + 1 ML 37 % 포름 알데히드)에 직접 1 / 10 부피 37 % 포름 알데히드를 추가하고 45 분 동안 앉아 보자. </li><li> microcentrifuge 관 (1 분간 13,000 rpm으로 회전 수) 1 ML 얼음 차가운 버퍼 B와 배 씻는다. </li><li> spheroplasting 버퍼 1 ML을 추가합니다. </li><li> 15 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 대부분의 세포 (즉, 위상 밝은하지 않음) 검정 때까지 세포에게 현미경으로 몇 분마다 확인합니다. </li><li> 저속 (~ 3,500 RPM)에서 회전, 차가운 얼음 버퍼 B와 배 씻는다. </li><li> 70 % 에탄올 1 ML을 추가 부드럽게 resuspend을 4에서 하룻밤 남겨 ° C (-20 ° C에서 무한정 저장할 수 있습니다.) </li></ol> 5. 하이브리드 절차 <ol><li> 하이브리드 솔루션을 준비 : 하이브리드 버퍼 100 μL에, 그 프로브의 1-3 μL, 소용돌이와 원심 분리기를 추가합니다. 가수 프로브는 프로브 세트 당 8-10 NG 총 (즉, 당 유전자)를 사용합니다. 우리는 3 DIF와 동시에 3의 유전자까지 몇 군데있다ferent 표시된 프로브 설정합니다. </li></ol> 을 열기 전에 실내 온도에 하이브리드 솔루션을 따뜻하게해야합니다. 스텔라리스 프로브를 들면, 그것은 1 μL 1:10 각각 1:20, 1:50 한 최적 확인할 수있는 프로브 1:100 희석 작업을 추가하여 4 별도의 혼성화 반응을 시작하는 것이 좋습니다. 스텔라리스 프로브의 작업을 희석는 하이브리드 버퍼에 준비가되어 있습니다. <ol start="2"><li> 원심 분리기 (모든 후속 단계, 3,500 RPM, 5 분) 고정 세포 (예를 들어, 200 μL)와 에탄올을 멀리 대기음. </li><li> 부드럽게 하이브리드 버퍼와 같은 비율 포름 아미드를 포함 1 ML 세척 버퍼에 resuspend을. 2-5 분 동안 서 보자. </li><li> 샘플 및 대기음 세척 버퍼를 원심 분리 한 후 하이브리드 솔루션을 추가합니다. 부드러운 흔들림과 어둠 속에서 품어, 37 O / N ° C. </li></ol> 참고 : 다음 절차의 coverslips에 / 영상 셀을 적용합니다. W에 대한참조 다른 반응성 산소 종 헤매다 솔루션을 포함한 96 - 웰 플레이트에 / 영상 세포를 애슁 <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols합니다.</a> <ol start="5"><li> 다음 날, 또는 사전에 깨끗한 (절차 참조) 5 분 150 μL 0.01 % 폴리-L-라이신과 커버 전표를 처리합니다. 흡입, dH보다 2 O와 배 세척하고 건조시켜 건조 할 수 있습니다. </li><li> 아침, 샘플 세척 버퍼 1 ML을 추가 부드럽게 resuspend을, 원심 분리기 및 대기음 후, 30 분 동안 37 ° C에서 세척 버퍼와 부화의 또 다른 1 ML에 resuspend을. </li><li> 2X SSC + 0.1 % 셰이커에 대한 RT에서 트리톤 X-100 15 분 씻어. </li><li> 그것은 설치하기 전에 RT까지 올 수 있도록 냉동고 매체를 장착보십시오. </li><li> 셰이커에 RT 15 분에 1X SSC로 세척. </li><li> PBS (0.1 ㎍ / ㎖) 최종 150 μL의 세포를 resuspend에 DAPI를 희석. </li><li> 청소 / 폴리리스 - trea 위에 자리 솔루션12 잘 플레이트 테드 커버 전표, 최소 30 분 그대로. </li><li> 용액을 제거 (당신은 백업으로 여분의 커버 슬립에 배치 할 수 있습니다) 1 ML 1X PBS로 3 배 씻는다. </li><li> 슬라이드 (Invitrogen 사 P36934)에 골드 설치 매체를 연장 3 μl를 놓습니다. 당신이 매체를 마운트의 건조 방지하기 위해 여러 커버 전표가있는 경우라도이 하나를 수행합니다. </li><li> 핀셋으로 잡고 12 - 웰 플레이트에 coverslip을 위해 ~ 0.5 ML의 에탄올을 추가 건조 커버 슬립과 공기를 제거합니다. </li><li> 매체를 마운트에 슬립 세포 쪽 덮개를 아래 어둠 속에서 강화 몇 시간 또는 O / N하자 놓습니다. </li><li> 매니큐어 가장자리를 밀봉 이미지로 이동합니다. </li></ol> 6. 올림푸스 IX-81 거꾸로 현미경 개요와 세포 이미징 <ol><li> 이미지 수집을 위해 우리는 Slidebook (지능형 imaging.com) 소프트웨어와 100X, 1.45 NA, TIRFM 오일 목적을 사용합니다. 크로마 필터 세트 (시약 참조) 시리얼 GFP, DAPI, CY3, Cy3.5와 Cy5에 이미징을위한. </li><li> DAPI 필터를 사용찾아 세포에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 참조 점으로이 설정합니다. </li><li> 총 거리 0.2 μM의 크기 (25 평면)과 5 μM 인 참조 점을 중심으로 이미지의 Z - 스택을 가져 가라. 각 염료 채널 (즉, 각 프로브 세트)에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 이미지 분석을위한 16 비트 TIFF로 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 7. 이미지 분석 개요 (가수 프로브) 아래 우리는 우리가 MATLAB에서 물고기 이미지를 분석에 사용할 계산 방법의 개요를 제공합니다. 사용 관련 MATLAB 함수는 오른쪽 괄호 있습니다. 알고리즘과 임계 값은 현재 가수 스타일의 프로브에서 데이터를 조정합니다. 스텔라 스타일의 프로브를 사용하면 특히 최종 필터링 단계 (7.8)에 약간의 조정이 필요합니다. 셀 식별 15 <ol><li> DAPI 이미지 16 글로벌 임계 값을 사용하여 배경에서 별도 세포 [graythresh]. </li><li> 확장 최대 값 함수에게 [메신저를 사용하는 핵을 식별extendedmax]. </li><li> 유역 알고리즘 씨앗 같은 핵을 사용하여 세그먼트 세포 [유역]. </li></ol> 각각의 형광 채널 반점 찾기 <ol start="4"><li> 배경을 정상화하고 잡음 비율로 신호를 개선하기 위해 tophat 변환을 수행 [bwmorph]. </li><li> 각 장소에 대한 포커스에있는 레이어 (Z-평면)을 식별하는 최대 값 찾기 [imregionalmax]. </li><li> 방사형 그라디언트에 선형 피팅 모델을 사용하여 잠재적 인 장소를 필터링합니다. </li></ol> 측정 지점의 강도 및 필터 하나 대 다수의 프로브 신호 <ol start="7"><li> 이전에 발견에 초점 레이어와 추정 강도 17 자리로 2D 가우시안 프로파일을 맞 춥니 다. </li><li> 임계 값 (히스토그램 기반)을 사용하여 약점을 필터링합니다. 가수 형 프로브의 경우이 중요하지만, 스텔라리스 프로브 덜 수 있습니다. </li><li> 각 셀에 지점을 계산합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이해가되지 선언합니다.

지금까지, FISH는 주로 낮은 처리량 방법이다. CY3, Cy3.5와 Cy5에 염료의 사용은 한 번에 세 가지를 하나의 세포에서 조사 할 수 유전자의 수를 제한합니다. 몇 가지 추가 프로브 개발되었다 (스텔라) 만 구별 프로브의 수는 여전히 대부분 7시에 있습니다. 이 제한을 피하기 위해 여러 형광체를 사용하여 조합 라벨 전략은 서로 다른 mRNA의 종 19,20에 대한 바코드를 생성하는 데 사용되었습니다. 가장 최근 트라 베 뮌데, 그리고 카이 단일 효모 세포 19 물고기와 동시에 32 종을 정량화하기 위해 광학 및 분광 바코드를 사용했습니다. 이 최근의 조합 방법의 한 가지 제한은 초 고해상도 현미경의 사용을 필요로합니다. 바코드 프로브를 구별하는 데 필요한 분석도 매우 복잡합니다. 우리는 CY3과 Cy3.5 물고기 실험에 대한 Cy5에 바람직 있다는 것을 발견했다. Cy5에 염료의 한계 중 하나는 감도photobleaching에 있습니다. 하지만 스텔라는 최근 photobleaching에 더 저항으로 광고하는 Cy5에 변종을 개발했으며,이 기술 문제를 해결할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 프로브의 가격이 미래에 감소해야하지만, 프로브 세트 당 $ 1,000 - 그것은 또한 물고기를 주목할 구현하는 고가의 방법이며 가수 스텔라 두 프로브는 일반적으로 $ 700의 비용합니다. 시약 및 효율 라벨 살려주는 가격이 낮은 범위로 아래 가수 프로브를 제공합니다. 주요 기술 과제 중 하나는 복잡한 스팟 결정하는 알고리즘의 구현을 필요로 하나 대 다수의 프로브 점의 분리이다. 이 특정 실험 설정에 대한 이미지 분석 매개 변수를 조정하기 위해 광범위한 수동 검토를 취할 수 있습니다. 관련 MATLAB 함수와의 연산 파이프 라인의 개요는 프로토콜의 7 장에서 제공됩니다. 이 문제는 약간 만있을 스텔라리스 프로브에 의해 완화된다<html> 프로브 당 하나의 레이블. 따라서 신호를 확인하기 위해 여러 프로브 colocalization을해야합니다. 물고기가 세포를 고정 필요로하기 때문에, 시간이 지남에 추적 개별 셀을 촉진하지 않습니다. 이전에, 우리는 각각의 대사 순환 효모 인구 6 유전자 발현의 역학을 재구성하는 물고기 스냅 샷 데이터를 사용했습니다. 대사 순환은 사전에 굶주린 연속 배양에서 관찰되고, 산소 소비 인구가 전체의 집단적 진동이 특징입니다. 이러한 진동은 산소 소비의 각 단계에서 모든 효모 유전자의 절반을 발생 성적표의 게놈 전체의 진동과 연관되어 있습니다. 우리는 신진 대사 사이클이 동기화 연속 효모 문화에 존재하는지 확인하기 위해 노력했다. 존재하는 경우, 동기 인구의 반 상관 관계가 있습니다 성적도 상관 성적에 대한 동기화 단일 셀 및 그 반대의 반대로 상호 연계되어야한다. ENT &quot;시간의 mRNA 생산의 역학을 재구성&gt;은, 관찰 스냅 샷 데이터는 기본 동작의 모델에서 기대되는 것과 비교해야합니다. 이러한 경우에 이론적 인 한계가있다&quot;유전자 발현 데이터의 스냅 샷 &quot;을 결정하는 데 사용 될 수 있습니다 기본 유전자 발현 역학과 어떤 모델의 종류는 21 구별 할 수 있습니다. 신진 대사 사이클 데이터가 아닌 직접 시간적 진동의 존재를 표시하는 경우, 통계 측정은 벌크 마이크로 어레이와 일치하는 셀 자율 진동 프로그램이 실제로 있다는 것을 입증하기 위해 구현되었다 측정.

대량 측정 기법을 사용하여, 그것을 분석 한 세포 1 ~ 성적표 또는 전사 활동의 수를 할 수 없습니다. 유전자 발현의 기자로 그 발기인에 의한 형광 단백질을 사용하면 어느 정도이 문​​제를 해결하지만, 접을 수있는 형광 단백질에 필요한 시간은 초기 역학을 모호하게 할 수 있습니다. 장수 형광 단백질은 mRNA의 수명을보고 할 수 없습니다. FISH 방법은 단일 분자 해상도로, 핵 전사 개시에서 단일 세포의 후속 성숙과 부패에, 그것의 전체 수명주기 동안 분석의 mRNA에 사용할 수 있습니다. DNA 요소를 조사하기 위해 방사능 RNA 프로브를 사용하여 핵산 시각화를위한 현장 실험의 원래. 이들은 개구리 Xenopus의 laevis의 2 마우스 조직 3 위성 DNA의 난소에서 리보좀 DNA를 시각화 포함되어 있습니다. 현장 exper에는의 첫 번째 형광iment 특정 DNA 서열는 4 프로브 형광 표시가 RNA 분자를 사용했습니다. 현장에서 RNA를 시각화하는 형광 프로브의 첫 번째 응용 프로그램은 닭 근육 조직 문화 5 굴지의 유전자 발현의 시각화했다. 더 최근에, 신진 효모, 물고기 효모 신진 대사 사이클 6시 전사의 진동을 조사하는 데 사용되었습니다, 세포주기의 진행 7 및 유사 분열 8시 mRNA의 성적의 공간 현지화 동안의 mRNA 붕괴. FISH 더 모든 효모 유전자의 절반 이상을 구성하는 구조적 전사 유전자에 상관 관계가없는 변동은 상관 관계가없는 전사 개시 9에서 발생하는 것을 보여주기 위해 효모에 사용되었습니다. 비 효모 종, 생선은 마우스 소장 10 줄기 세포 마커를 식별하고 세포 운명의 불완전한 투과도는 C의 확률 유전자 발현 변동 될 수 있는지 결정하기 위해 사용되었습니다엘레 간스의 배아 11. 여기에 설명 된 FISH 방법은 메시지의 mRNA 염료 라벨, 단일 가닥 DNA 프로브를 교배하여 작동합니다. 세포는 몇 군데와의 mRNA가 자리 검출 알고리즘을 사용하여 계산됩니다. 단일 가닥 프로브는 DNA 합성기로 생성하고 표시 (가수 프로브로 여기에서 참조) 또는 미리 표시된 프로브 (스텔라리스 프로브) 12,13 상업적으로 주문할 수 있습니다. 가수 스텔라리스 프로브 사이의 주요 차이점은 스텔라리스 프로브 (~ 20 BP) 등의 주권 등으로 설명 프로브 당 하나의 레이블과 짧은 동안 가수 프로브는 더 이상 (~ 50 BP)와 아르 다라는 것입니다 14. 또한, 스텔라 접근 방식은 가수 (각각 유전자 당 ~ 30 대 5 프로브)보다 유전자 당 더 많은 프로브를 사용합니다. 아래에서 우리는 프로브의 두 유형의 사용을 설명하는 프로토콜을 제공합니다. 2 장에서는, 우리는 아미노 알릴 티미 딘을 함유 프로브 W 레이블을위한 프로토콜을 제공합니다선택한 사이클 염료 i 번째. 단일 mRNA의 지점을 식별하는 데 필요한 계산 절차의 개요는 7 장에서 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>바나딜 리보뉴클레오시드 복합체</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>리티케이스</td><td>시그마</td><td>L5263</td><td></td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Roche</td><td>1010954001</td><td></td></tr><tr><td>BSA (RNase free)</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapt&#8211; 탄올</td><td>피셔</td><td>03446l</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 딜락테이트</td><td>시그마</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X (RNase 무료)</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>Shelton Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 설페이트</td><td>시그마</td><td>D6001</td><td>또는 등가</td></tr><tr><td>식염수-구연산나트륨(SSC) 20X</td><td>VWR</td><td>82021-484</td><td></td></tr><tr><td>포름 아미드 (탈 이온)</td> <td>Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가없는 물</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>알파 -D- 포도</td>당 <td>시그마</td><td>158968</td><td>GLOX 용액</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>100 % 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포도당 산화 효소</td><td>시그마</td><td>G0543</td><td>GLOX 용액</td></tr><tr><td>카탈라제</td><td>시그마</td><td>C3155</td><td>GLOX 솔루션</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>MP Biomedicals</td><td>150710</td><td></td></tr><tr><td>폴리리신(0.01%)</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Warner Instruments</td><td>Cs-18R15</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Mounting Medium</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 뉴클레오티드 제거 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>FISH 프로브</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>원하는 mRNA 서열에 대한 맞춤 주문</td></tr><tr><td>유리 바닥 96웰 플레이트</td><td>Nunc</td><td>265300</td><td>커버슬립</td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td>의 대안 <td>BD Falcon</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>Cy3, Cy3.5, Cy5 염료</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>monofunctional NHS-ester</td></tr><tr><td colspan="4"> 장비</td></tr><tr><td>Plasma-Preen I Cleaner</td><td>Terra Universal</td><td>9505-00</td><td>컨트롤러(Cat #9505-17 옵션)</td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Alcatel</td><td>205SDMLAM</td><td>Plasma-Preen</td></tr><tr><td>Widefield Fluorescence Microscope</td><td>작동용 Olympus</td><td>IX81</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>100X 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td>1-UB617R</td><td></td></tr><tr><td>광원</td><td>X-Cite</td><td>XCT 10-A</td><td>또는 동급</td></tr><tr><td>필터 세트</td><td>Chroma</td><td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td><td></td></tr><tr><td>Cooled CCD 또는 EMCCD 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-98-24ER</td><td></td></tr></tbody></table>

형광을 사용하여 mrna의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

현장 하이브리드 화에 형광 (FISH) 방법은 하나의 기본 세포 환경에서 핵산을 검출 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 하나의 효모 세포에서의 mRNA의 수를 정량화하기 위해 FISH를 사용하기위한 프로토콜을 제공합니다. 세포는 그 어떤 조건에서 재배하고 고정 투과 할 수있다. 그 후, 형광 염료에 결합 여러 개의 단일 가닥 deoxyoligonucleotides이의 mRNA 레이블을 시각화하는 데 사용됩니다. 하나의 mRNA 분자의 회절 형광 셀 당의 mRNA의 수를 확인하고 계산하는 자리 탐지 알고리즘을 사용하여 계량입니다. 북부 오, RT-PCR 유전자 발현 마이크로 어레이의 더 많은 표준 정량화 방법은 대량 인구의 평균의 mRNA에 대한 정보를 제공하는 반면, FISH는 단일 분자 해상도에서 단일 세포에서 계산하고이 mRNA가 국산화 모두를 용이하게합니다.

그림 3은 FISH 이미지에서 계산 및 단일 세포에 존재의 mRNA의 수를 결정하는 데 사용되는 일반적인 히스토그램을 보여줍니다. 현미경 기반의 RNA 정량의 중요한 장점은 한 성적 증명서의 국산화에 대한 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 우리는 유도 CBF1 대립 유전자 (그림 4)와 단일 세포의 mRNA를 식별하는 물고기를 사용. 많은 mRNA의 분자 전사의 사이트에 존재하기 때문에, 우리는 핵 내에서 전사 사이트의 존재와 위치를 식별 할 수 있습니다. 다른 유전자의 라벨의 mRNA에 서로 다른 염료를 이용하여, 하나는 같은 셀에서 여러 mRNA의 종을 정량화 할 수 있습니다. 이 방법을 설명하기 위해 효모 세포는 α-인자와 소르비톨의 면전에서 배양 하였다. FUS1 전사 (Quasar670 염료, 레드)은 α-인자에 의해 유도된다. STL1 전사 (준 항성은 570 염료, 녹색) 세포 삼투압의 증가에 의해 유발된다 ( <stronG&gt; 그림 5). 그림 4는 가수 프로브와 물고기의 예입니다. 그림 5는 스텔라리스 프로브와 물고기의 예입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> 그림 1. FISH 실험 절차의 회로도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> 그림 2. 이미지 분석 파이프 라인의 개략도. 최종 반점은 오른쪽 그림에서 결정됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> 그림 3. 가수 프로브를 사용하여 특정 유전자에 대한 현장 강도의 히스토그램 </strong&gt;. 조사 강도는 내부 (적색)와 외부 (파란색) 세포를 모두 계산됩니다. 낮은 강도의 반점은 소음 또는 단일 프로브 중 하나입니다. 실제 mRNA의 메시지는 여러 개의 프로브로 표시되어 있습니다. 스텔라리스 프로브를 사용하는 경우, 하나의 프로브는 임계 값과 필터링을 적절하게 조정해야하므로 적은 감지하고 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> 그림 4. 가수 물고기 절차의 대표적인 결과. 이 실험에서, CBF1 전사가 유도 프로모터 18에 활성화됩니다. 핵은 DAPI 파란색 염색된다. CBF1의의 mRNA가 CY3 - 라벨 프로브로 태그됩니다. 흰색 화살표는 핵 CBF1 전사 사이트의 존재를 강조 표시합니다. 단일 mRNA의 성적은 세포질에서 볼 수 있습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> 그림 5. 스텔라 FISH 절차의 대표적인 결과. 마타 효모 세포가 동시에 30 NG / ML α-팩터 10 분 소르비톨 825 M에 노출 된 동시에 FUS1 (준 항성은 670, 빨강)와 STL1 (준 항성은 570, 녹색) 성적 증명서 탐색 하였다. 강조 상자에서, 우리는 하나의 셀이 페로몬에만 응답 (FUS1 시작 사이트, 빨강)과 또 다른 주로 (녹색, STL1 시작 사이트) 소르비톨에 응답 볼 수 있습니다.

이 프로토콜은 형광을 수행하기위한 실험 절차를 설명<em&gt; 현장에서</em단일 분자 해상도에서 단일 세포의 mRNA를 카운트하기위한&gt; 하이브리드 (FISH).

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 효모 세포 내에서 단일 분자 특이성으로 mRNA 분자의 존재를 검출하는 것입니다. 먼저, lyase 함유 완충액을 사용하여 효모 세포를 포름알데히드로 고정합니다. 대부분의 세포가 위상차 현상을 보이지 않을 때까지 세포를 투과화합니다.다음으로, 투과화된 세포를 형광 표지된 단일 가닥 DNA 분자와 함께 배양한 후, 플라즈마 세척된 커버슬립 위에 세포를 고정합니다. 최종적으로, 형광 현미경을 통해 얻은 결과로 단일 세포 내 mRNA 분자의 존재 여부와 위치를 상세히 파악할 수 있습니다. 유전자 발현 분석, 마이크로어레이 및 노던 블롯과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 단일 세포 내에서 개별 mRNA를 시각화할 수 있다는 점입니다.이 방법은 전사 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 세포 집단 내 세포당 arm RNA 수를 정량화하여 프로모터 수준의 조절 모델에 정보를 제공하는 것이 포함됩니다. 또한 세포 주기 동안 전사체의 국소화 및 반감기를 결정하는 데에도 사용할 수 있습니다.플라스마 전처리 진공 챔버 내의 슬라이드 위에 커버 슬립을 배치합니다. 그다음 진공 챔버를 마이크로웨이브에 넣고 밀봉되었는지 확인합니다. 펌프가 작동하기 시작하면 스위치를 켭니다.진공 장치를 켜고 마이크로웨이브 전원을 켠 다음, 플라즈마가 보이면 5초 후에 정지시킵니다. 그다음 진공 장치를 끄고 펌프를 끕니다. 진공 챔버를 꺼냅니다.그 후 세척된 면이 위로 오도록 커버슬립을 12-웰 플레이트로 옮깁니다. 효모를 A 600이 약 0.1에서 0.2가 될 때까지 배양합니다. 최소 배지에서 10 mL의 세포는 약 10회의 하이브리다이제이션을 수행하기에 충분한 양입니다.37% formaldehyde를 배지 부피의 1/10만큼 직접 첨가하고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 세포를 3000 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠렛을 1 mL의 buffer B에 다시 현탁하여 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.마이크로 원심분리 튜브에서 1 mL의 차가운 buffer B로 두 번 세척합니다. 13,000 RPM에서 1분 동안 원심분리합니다. 그다음, 1 mL의 sphero plating buffer를 넣고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.대부분의 세포가 검게 변할 때까지 몇 분 간격으로 세포를 현미경으로 관찰하십시오. 그 후, 얼음처럼 차가운 버퍼로 두 번 세척하십시오. B. 3,500 RPM의 낮은 속도로 원심 분리하십시오.70% ethanol 재현탁액 1 mL를 첨가하십시오. 펠릿을 부드럽게 현탁하여 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하거나 -20 °C에서 무기한 보관하십시오. 하이브리다이제이션 용액을 준비하려면 하이브리다이제이션 완충액 100 µL에 프로브 1~3 µL를 첨가하십시오.그 다음 볼텍싱 후 원심분리합니다. 우리는 세 가지 서로 다른 프로브 세트를 사용하여 세 가지 서로 다른 유전자를 동시에 이미징했습니다. 이제 고정된 효모 샘플을 원심분리하고 세척 버퍼를 흡입하여 제거합니다.혼성화 용액을 첨가하고 37 °C에서 완만한 흔듦과 함께 하룻밤 동안 암소에서 배양한 후 다음 날 꺼냅니다. 깨끗한 커버글라스 립을 0.01% polylysine 150 µL로 5분 동안 처리합니다. 그런 다음 흡입하여 제거하고 공기 중에서 건조시킵니다.슬라이드를 증류수로 3회 세척하고 공기 중에서 건조시킵니다. 1X SSC로 1회 세척한 후, 세포를 0.1 µg/mL 농도로 갓 조제한 DAPI 염색액 150 µL에 현탁합니다. 세포 현탁액의 일부를 폴리라이신 처리된 커버슬립 위에 분취하여 30분 동안 배양합니다. 이어서, 프로롱 골드 마운팅 매질을 실온에서 해동합니다.슬라이드 위에 3 µL를 떨어뜨립니다. 그다음 커버슬립에 에탄올 약 0.5 mL를 추가합니다. 12-웰 플레이트에서 핀셋으로 커버슬립을 잡고 들어 올려 공기 중에서 건조시킵니다.커버슬립의 세포 면이 마운팅 매질(mounting medium)에 닿도록 뒤집어 놓은 후, 어두운 곳에서 수 시간 또는 하룻밤 동안 굳힙니다. 가장자리를 매니큐어로 밀봉하고 이미징을 진행합니다. 기준점을 중심으로 총 거리 5 µm 범위 내에서 0.2 µm 간격으로 Z-stack 이미지를 촬영합니다.각 프로브 세트에 해당하는 각 염료 채널에 대해 이미징을 반복합니다. 그런 다음 동반 텍스트에 상세히 설명된 대로 진행하십시오. 워터셰드 분할(watershed segmentation)을 통해 세포를 식별하려면, 방사형 그래디언트(radial gradient)를 사용하여 스팟을 식별하고 가우시안 피팅(Gaussian fit)을 사용하여 스팟을 측정하십시오.일반적으로 히스토그램은 FISH 이미지로부터 계산되며, 단일 세포 내에 존재하는 mRNA의 수를 결정하는 데 사용됩니다. 현미경 기반 RNA 정량 분석의 중요한 장점은 전사체의 국소화 정보를 얻을 수 있다는 점입니다. 예를 들어, 이 FISH 방법은 유도성 CCB CBF 단일 대립유전자를 가진 단일 세포 내의 mRNA를 식별하기 위해 단일 프로브를 사용합니다.전사 부위에 많은 mRNA 분자가 존재하기 때문에, 핵 내 전사 부위의 존재와 위치를 쉽게 식별할 수 있습니다. 서로 다른 유전자의 mRNA를 표지하기 위해 다양한 염료를 사용하면 동일한 세포 내에서 여러 mRNA 종의 정량 분석이 용이해집니다. 본 실험에서는 효모 세포를 alpha factor와 sorbitol이 존재하는 환경에서 배양하였습니다. Stelara 프로브를 사용한 결과, 붉은색 FUS one 개시 부위로 표시된 페로몬에만 반응하는 세포 하나가 데이터에 나타납니다.동시에, 다른 세포는 주로 소르비톨에 반응하고 있으며, 여기서 S TL one 시작 부위는 녹색으로 표지되어 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 숙달 시 효모 내의 단일 mRNA 분자를 표지하고 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 이틀이면 적절하게 수행할 수 있습니다.세포 농도가 충분히 조밀한지 확인하십시오. 시료가 희석된 경우에는 더 많은 시야를 촬영하고 저장해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.

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이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

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