형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 효모 세포 내에서 단일 분자 특이성으로 mRNA 분자의 존재를 검출하는 것입니다. 먼저, lyase 함유 완충액을 사용하여 효모 세포를 포름알데히드로 고정합니다. 대부분의 세포가 위상차 현상을 보이지 않을 때까지 세포를 투과화합니다.

다음으로, 투과화된 세포를 형광 표지된 단일 가닥 DNA 분자와 함께 배양한 후, 플라즈마 세척된 커버슬립 위에 세포를 고정합니다. 최종적으로, 형광 현미경을 통해 얻은 결과로 단일 세포 내 mRNA 분자의 존재 여부와 위치를 상세히 파악할 수 있습니다. 유전자 발현 분석, 마이크로어레이 및 노던 블롯과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 단일 세포 내에서 개별 mRNA를 시각화할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 전사 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에는 세포 집단 내 세포당 arm RNA 수를 정량화하여 프로모터 수준의 조절 모델에 정보를 제공하는 것이 포함됩니다. 또한 세포 주기 동안 전사체의 국소화 및 반감기를 결정하는 데에도 사용할 수 있습니다.

플라스마 전처리 진공 챔버 내의 슬라이드 위에 커버 슬립을 배치합니다. 그다음 진공 챔버를 마이크로웨이브에 넣고 밀봉되었는지 확인합니다. 펌프가 작동하기 시작하면 스위치를 켭니다.

진공 장치를 켜고 마이크로웨이브 전원을 켠 다음, 플라즈마가 보이면 5초 후에 정지시킵니다. 그다음 진공 장치를 끄고 펌프를 끕니다. 진공 챔버를 꺼냅니다.

그 후 세척된 면이 위로 오도록 커버슬립을 12-웰 플레이트로 옮깁니다. 효모를 A 600이 약 0.1에서 0.2가 될 때까지 배양합니다. 최소 배지에서 10 mL의 세포는 약 10회의 하이브리다이제이션을 수행하기에 충분한 양입니다.

37% formaldehyde를 배지 부피의 1/10만큼 직접 첨가하고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 세포를 3000 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠렛을 1 mL의 buffer B에 다시 현탁하여 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

마이크로 원심분리 튜브에서 1 mL의 차가운 buffer B로 두 번 세척합니다. 13,000 RPM에서 1분 동안 원심분리합니다. 그다음, 1 mL의 sphero plating buffer를 넣고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.

대부분의 세포가 검게 변할 때까지 몇 분 간격으로 세포를 현미경으로 관찰하십시오. 그 후, 얼음처럼 차가운 버퍼로 두 번 세척하십시오. B. 3,500 RPM의 낮은 속도로 원심 분리하십시오.

70% ethanol 재현탁액 1 mL를 첨가하십시오. 펠릿을 부드럽게 현탁하여 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하거나 -20 °C에서 무기한 보관하십시오. 하이브리다이제이션 용액을 준비하려면 하이브리다이제이션 완충액 100 µL에 프로브 1~3 µL를 첨가하십시오.

그 다음 볼텍싱 후 원심분리합니다. 우리는 세 가지 서로 다른 프로브 세트를 사용하여 세 가지 서로 다른 유전자를 동시에 이미징했습니다. 이제 고정된 효모 샘플을 원심분리하고 세척 버퍼를 흡입하여 제거합니다.

혼성화 용액을 첨가하고 37 °C에서 완만한 흔듦과 함께 하룻밤 동안 암소에서 배양한 후 다음 날 꺼냅니다. 깨끗한 커버글라스 립을 0.01% polylysine 150 µL로 5분 동안 처리합니다. 그런 다음 흡입하여 제거하고 공기 중에서 건조시킵니다.

슬라이드를 증류수로 3회 세척하고 공기 중에서 건조시킵니다. 1X SSC로 1회 세척한 후, 세포를 0.1 µg/mL 농도로 갓 조제한 DAPI 염색액 150 µL에 현탁합니다. 세포 현탁액의 일부를 폴리라이신 처리된 커버슬립 위에 분취하여 30분 동안 배양합니다. 이어서, 프로롱 골드 마운팅 매질을 실온에서 해동합니다.

슬라이드 위에 3 µL를 떨어뜨립니다. 그다음 커버슬립에 에탄올 약 0.5 mL를 추가합니다. 12-웰 플레이트에서 핀셋으로 커버슬립을 잡고 들어 올려 공기 중에서 건조시킵니다.

커버슬립의 세포 면이 마운팅 매질(mounting medium)에 닿도록 뒤집어 놓은 후, 어두운 곳에서 수 시간 또는 하룻밤 동안 굳힙니다. 가장자리를 매니큐어로 밀봉하고 이미징을 진행합니다. 기준점을 중심으로 총 거리 5 µm 범위 내에서 0.2 µm 간격으로 Z-stack 이미지를 촬영합니다.

각 프로브 세트에 해당하는 각 염료 채널에 대해 이미징을 반복합니다. 그런 다음 동반 텍스트에 상세히 설명된 대로 진행하십시오. 워터셰드 분할(watershed segmentation)을 통해 세포를 식별하려면, 방사형 그래디언트(radial gradient)를 사용하여 스팟을 식별하고 가우시안 피팅(Gaussian fit)을 사용하여 스팟을 측정하십시오.

일반적으로 히스토그램은 FISH 이미지로부터 계산되며, 단일 세포 내에 존재하는 mRNA의 수를 결정하는 데 사용됩니다. 현미경 기반 RNA 정량 분석의 중요한 장점은 전사체의 국소화 정보를 얻을 수 있다는 점입니다. 예를 들어, 이 FISH 방법은 유도성 CCB CBF 단일 대립유전자를 가진 단일 세포 내의 mRNA를 식별하기 위해 단일 프로브를 사용합니다.

전사 부위에 많은 mRNA 분자가 존재하기 때문에, 핵 내 전사 부위의 존재와 위치를 쉽게 식별할 수 있습니다. 서로 다른 유전자의 mRNA를 표지하기 위해 다양한 염료를 사용하면 동일한 세포 내에서 여러 mRNA 종의 정량 분석이 용이해집니다. 본 실험에서는 효모 세포를 alpha factor와 sorbitol이 존재하는 환경에서 배양하였습니다. Stelara 프로브를 사용한 결과, 붉은색 FUS one 개시 부위로 표시된 페로몬에만 반응하는 세포 하나가 데이터에 나타납니다.

동시에, 다른 세포는 주로 소르비톨에 반응하고 있으며, 여기서 S TL one 시작 부위는 녹색으로 표지되어 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 숙달 시 효모 내의 단일 mRNA 분자를 표지하고 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 이틀이면 적절하게 수행할 수 있습니다.

세포 농도가 충분히 조밀한지 확인하십시오. 시료가 희석된 경우에는 더 많은 시야를 촬영하고 저장해야 합니다.