동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

이 절차의 전반적인 목표는 숙주 헬라 세포와 상호 작용하는 동적 소형 HIV one 입자를 이미징하여 상관 형광 및 초저온 전자 현미경 방법의 사용법을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 유리 바닥 배양 접시의 금 파인더 EM 그리드에서 발뒤꿈치 세포를 도금하고 성장시킨 다음 발뒤꿈치 세포를 GFP로 표지된 HIV 1 입자로 감염시킴으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 HIV 1 감염 세포의 타임 랩스 고속 3D 라이브 셀 컨포칼 이미지를 수집하고 유리화 후 단일 입자 역학에 대한 자동화된 3D 입자 추적으로 이미지를 분석하는 것입니다.

살아있는 세포 이미징 데이터와 동일한 바이러스 입자인 샘플은 추가적인 고해상도 3D 초저온 전자 단층 촬영 분석을 위해 극저온 형광 이미지에 위치합니다. 마지막 단계는 HIV one 입자를 포함하는 식별된 모든 위치에 대해 기울어진 cryo EM 투영 시리즈를 수집하고 imad 소프트웨어를 사용하여 가중 백 프로젝션 알고리즘으로 3D 탐을 재구성하는 것입니다. 궁극적으로, 첨단 3D 상관 생세포 형광 현미경 검사와 고해상도 초저온 전자 단층촬영을 사용하여 동적 회절, 제한된 바이러스 입자 및 숙주 세포와의 상호 작용을 직접 시각화합니다.

우리의 연구는 HIV 1 감염 이벤트만 직접 시각화할 수 있는 상관 관계 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다.이러한 방식으로 현미경, 초저온 형광 현미경 및 초저온 전자 단층 촬영과 같은 라이브 셀 형광을 결합함으로써 라이브 셀 및 초저온 형광 신호를 사용하여 초저온 전자 단층 촬영에서 샘플링을 크게 안내할 수 있습니다. 또한, 초저온 전자 단층촬영(cryo-electron tomography)에서 얻은 구조 정보는 형광 표지 표적의 라이프스타일 이미징을 통해 사용할 수 있는 동적 기능 데이터로 보완될 수 있습니다. 이 기술 또는 기존 방법의 주요 장점은 고해상도 3D 산호 전자 단층 촬영 접근 방식을 사용한 고급 상관 고속 3D 라이프스타일 이미징이 감염 초기 단계에서 HIV 유형 1 및 숙주 세포 상호 작용과 같이 본질적으로 포착하기 어려운 동적 이벤트를 연구하는 데 적용된다는 것입니다.

세포 배양을 위한 그리드를 준비하기 위해 글로우 200 메시 R의 탄소 측을 25 밀리암페어 미만의 25 밀리암페어 이하로 방전합니다. 밀리리터 섬유 닌 용액당 50마이크로그램의 40마이크로리터 방울에 탄소 면이 아래로 향하게 하여 EM 그리드를 파이버 닌으로 코팅합니다. 소독 플레이트를 위해 UV 광선 아래 조직 배양 후드에 2시간 동안 그대로 두십시오.헬라 세포는 유리 바닥 배양 접시에서 밀리리터당 10-4번째 세포의 2배 밀도로 그리드에 올려놓습니다.

적절한 보충제와 함께 DMEM에서 HIV 감염 전 약 18시간 동안 5% 이산화탄소로 섭씨 37도에서 세포를 배양하고, 유리 바닥 배양 접시의 헬라 세포에 형광 세포 추적기를 추가하고 접시를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하여 형광 염료를 흡수합니다. PBS로 세포를 세척하고 50 마이크로 리터의 예열 된 신선한 배지를 첨가하십시오. 접시를 섭씨 37도의 스윕 필드 컨포칼 스캐너 현미경의 살아있는 세포 챔버에 놓습니다. cryo EM은 상대적으로 얇은 시료 영역을 필요로 하기 때문입니다.

정사각형당 1개에서 3개의 세포를 포함하는 여러 필드를 선택하고 가장 널리 퍼져 있을 때 두 개의 유사분열 단계 사이의 세포를 선택하고 향후 이미징을 위해 NIS 요소 소프트웨어와 함께 이러한 위치를 평평하게 저장합니다. 다음으로, G-F-P-V-P-R 및 바이러스 입자를 포함하는 VSVG, 의사 유형 HIV ONE 입자로 세포를 EM 그리드를 방해하지 않도록 주의하면서 접시의 하단 웰에 감염시킵니다. 이미징을 위한 위치가 이미 선택되고 바리안이 추가된 직후에 저장되었기 때문에 이전에 선택한 위치에서 20-40분 동안 타임 랩스 고속 3D 컨포칼 이미지를 수집합니다.

컨포칼 라이브 셀 이미징 직후, 배양 접시를 얼음으로 냉각된 구리 블록에 놓고 cryo EM 시료 준비실로 옮깁니다. EM 그리드를 특수 핀셋에 로드하고, 0.2미크론 형광 마이크로스피어와 혼합된 15나노미터 금 비드 용액의 마이크로리터를 그리드에 즉시 놓고 여과지로 잔류 배양 배지를 빠르게 닦아냅니다. 형광 미세구는 형광등과 Cryo-EM 사이의 상관관계를 돕기 위해 사용됩니다.

최상의 결과를 얻을 수 있도록 최적화된 블로팅 매개변수로 플런지 동결을 위해 유리화 장치에 핀셋을 로드합니다. 초저온 형광 현미경 검사 절차를 시작하려면 건조 질소 가스 라인을 대물 렌즈 위에 놓인 슬리브에 연결하여 렌즈를 따뜻하고 서리가 없도록 유지하고, 집에서 제작한 극저온 형광 샘플 스테이지를 도립 형광 현미경에 장착합니다. cryos 샘플 스테이지의 액체 질소 주입구를 자체 가압 작업자에 연결하고 액체 질소 오버플로 보호 배출구를 적절한 용기에 넣습니다.

냉동 수화 샘플 그리드를 구리 블록의 EM 표본 카트리지에 넣고 그리드를 제자리에 유지하기 위해 상단에 사전 냉각 C 클립 링을 놓습니다. 카트리지를 극저온 스테이지 검색의 내부 챔버에 놓고 살아있는 세포 이미징 데이터에서 동일한 바이러스 입자를 찾습니다. EM 그리드에는 인덱스가 있기 때문에 라이브 셀 이미지와 극저온 형광 이미지 모두에서 그리드에서 동일한 입자를 쉽게 국소화할

장시간 작동하는 대물 렌즈가 있는 광학 현미경을 사용하여 극저온 조건에서 식별된 위치에서 극저온 DIC 및 형광 이미지를 획득합니다. 극저온 형광 이미징 중에는 극저온 스테이지의 액체 질소 수준을 주기적으로 확인하고 필요에 따라 자체 가압 작업자로 다시 채워 극저온 전자 단층 촬영을 위해 샘플 스테이지를 섭씨 마이너스 170도 미만으로 유지합니다. 샘플 그리드를 140 x의 배율로 저선량 검색 모드에서 전계 방출 건이 장착된 전자 현미경의 극저온 전송 스테이션에 로드합니다.

극저온 형광 이미지가 획득된 영역 또는 그리드 사각형을 식별합니다. 상관 영역의 저배율 cryo EM 이미지를 기록하고 3, 500 x의 배율로 저선량 검색 모드에서 스테이지 파일에 위치를 저장합니다. 100미크론 대물렌즈 조리개 검색을 삽입하고 GFP 신호와 관련된 모든 위치를 2단계 파일에 저장합니다.

틸트 각도 범위, 전자량, 디포커스 값 및 틸팅 방식을 포함하여 틸트 시리즈를 획득하기 위한 단층 촬영 매개변수를 설정합니다. 저장된 모든 위치에 대한 틸트 시리즈를 획득하여 이 절차를 시작합니다. Tomo Graham 계산의 여러 단계를 동시에 조정하거나 따를 수 있도록 메인 창을 구성하고, 필요한 매개 변수를 수정하고, 각 처리 단계에 필요한 특정 프로그램을 실행합니다.

마지막 단계에서는 주 잔차 오차가 0.6 미만인 완전 정렬된 스택을 생성하고 가중 역투영 알고리즘을 사용하여 탐을 재구성합니다. 바이러스 입자의 동적 거동을 특성화하기 위한 Im 모드에서. HIV one에 감염된 헬라 세포는 고속 컨포칼 라이브 셀 현미경으로 이미지화되었으며 입자 움직임은 자동화된 3D 입자 추적으로 분석되었습니다.

이 대표적인 그림에서 노란색 화살촉으로 표시된 단일 녹색 형광 바이러스 입자는 몇 분의 시간 경과를 피하기 위해 프레임 사이에 3분 간격의 3D 컨포칼 스택에서 추적되었습니다. 이는 마지막 컨포칼 라이브 셀 이미지 수집과 급락 동결 사이에 발생할 수 있습니다. cryo 형광 현미경 스테이지는 cryo EM 카트리지 내의 냉동 수화 샘플을 이미징하기 위해 설계 및 구성되었습니다.

광학 현미경에서 패널 A는 구리 극저온 샘플 스테이지를 냉각하는 데 사용되는 액체 질소로 채워진 자체 가압 doer를 보여줍니다. 패널 B는 흰색 화살촉으로 표시된 내부 챔버와 함께 cryos 샘플 스테이지의 상단 내부 모습을 보여줍니다. 샘플 그리드는 검은색 화살표로 표시된 구리 블록 플랫폼의 중앙에 있는 E EM 시편 카트리지에 배치됩니다.

이 플랫폼은 비극성 전자 현미경과 함께 사용하기 위해 추가되었습니다. 시료 그리드가 로드되면 카트리지는 cry 형광을 위해 내부 챔버로 옮겨졌습니다. 현미경 패널 C와 D는 비극성 초저온 전자 현미경과 함께 사용하기 위해 그리드를 제자리에 유지하기 위해 구리 링을 배치하기 전과 후의 표본 카트리지를 각각 보여줍니다.

첨단 상관 생명 세포 현미경 검사 및 초저온 전자 단층 촬영을 위한 절차의 유용성은 숙주 발뒤꿈치 세포와 상호 작용하는 형광 표지된 HIV V one 입자의 직접 시각화를 통해 입증됩니다. 패널 A에 표시된 극저온 광학 현미경 스테이지로 기록된 DIC 이미지는 패널 B에 표시된 GFP 태그 입자의 극저온 형광 이미지와 중첩됩니다. 빨간색 패널 C, D 및 E는 각각 140 x 3, 500 x 및 27, 500 x에서 패널 B와 C에 원형으로 표시된 형광 입자를 포함하는 영역의 저선량 Cryo-EM 이미지입니다.

패널 E의 삽입은 단층 촬영 틸트 시리즈 패널을 획득한 후 기록된 확대 이미지이며, FG 및 H는 Z 방향으로 21나노미터의 거리로 분리된 3개의 4나노미터 두께의 단층 촬영 슬라이스를 보여줍니다. 입자와 helo 세포막 사이의 연결은 삽입 및 패널 E의 투영 이미지와 단층 촬영 슬라이스 모두에서 화살표로 표시됩니다. 패널 F와 g에서.

당사는 타임 랩스, 컨포칼 리포 세포 형광 이미징 및 초저온 전자 단층 촬영을 사용하여 동적 바이러스 및 멸균 상호 작용을 분석하기 위한 고급 상관 관계 접근 방식을 제공하기 위한 간단한 프로토콜 세트를 제시했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 형광 이미지와 전자 현미경 이미지 간의 정확하고 신뢰할 수 있는 상관 관계가 까마귀 전자 단층 촬영의 성공적인 획득에 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에서 설명하는 데이터는 세포 신호 전달 표면 수용체 내재화와 같은 세포 생물학의 동적 세포 과정과 관련된 수많은 응용 분야에 유용할 것입니다.