Name: 동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: 학습하세요 상호 현미경법을 이용하여 HIV-1 바이러스 입자와 HeLa 세포 간 동적 상호 작용을 3차원 구조로 분석하는 방법을. 이 기술은 고속 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 크라이오 전자 단층 촬영을 결합하여 실시간 바이러스 행동을 시각화합니다.

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저자는 기술의 CRYO-형광 샘플 단계, 중국 과학 기술 대학의 Changlu 어르신과 쳉 쑤의 건설 트래비스 휠러 및 세포 생물학의학과 기계 공장 및 생리학, 피츠버그 대학교에 감사드립니다 안내, 원고의 중요한 읽기 박사 테레사 Brosenitsch. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (GM082251 &amp; GM085043)에 의해 지원되었다.

1. 탄소 코팅에 헬라 세포 배양, 골드 EM 찾기 그리드 <ol><li> 글로우 방전 25 초 25mA 이하 200 메쉬 R2 / 2 Quantifoil 금 EM 찾기 그리드의 탄소 쪽. </li><li> 코트 50 ㎍ / ㎖의 fibronectin의 용액 40 μL 비말로, 아래로, 탄소 측을 떠하여 피브로넥틴과 EM 그리드, 다음, 조직 문화 후드에서 2 시간 동안 UV 빛의 밑에 그것을 소독. </li><li> 판 헬라 유리 바닥 문화 접시에 2 × 10 4 세포 / ㎖ (총 2 ㎖ 문화)의 밀도 그리드 위에 세포 DMEM에서 5 % CO 2, 37 ° C에서 세포 성장을 4.5로 보충 약 18 시간 동안 G / L L-글루타민과 포도당, 10 % 열 - 불 활성화 된 송아지 태아 혈청, 100 단위 / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신. 헬라 세포는 O / N 문화 이후에 감염됩니다. </li></ol> 2. HIV-1 감염과 라이브 셀 이미징 <ol><li> 유리 바닥 문화에 형광 세포 추적기 (레드 CMTPX, 1 μL / 2 ㎖)를 추가접시 (단계 1.3)와 형광 염료의 최대 걸릴 수 있도록, 10 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> PBS로 세포를 세척하고 50 μL 사전 예열 신선한 매체를 추가합니다. </li><li> 37 ° C, 스윕 필드 공 촛점 스캐너 현미경에서 라이브 셀 챔버에 접시를 놓습니다. 그들은 cryoEM 이후 대부분의 스프레드 아웃과 평면 (그림 2C와 2D 참조) 때 상대적으로 얇은 영역을 필요로 두 개의 유사 분열 단계 사이의 세포와 1-3 셀 / 사각형이 포함 된 여러 필드 (10-15 위치)을 선택 샘플. 미래 영상 (단계 2.5)에 대한이 위치를 저장합니다. </li><li> (우리는 P24의 40 NG / ML을 포함하는 시료 40 μl를 사용) GFP-VPR을 포함 VSV-G 의사 입력 된 HIV-1 입자로 세포를 감염. 영상의 위치가 이미 선택되어 저장 되었기 때문에 접시의 바닥에 바이러스 입자를 추가 할 때, EM 그리드를 방해하지 않도록주의해야합니다. </li><li> 바로 비리의 추가 후, TI 수집20 ~ 40 분 이전에 선택한 위치에서 고속 3D 공 촛점 이미지를 (단계 2.3) 나 경과. </li><li> 공 촛점 이미지는 MetaMorph를 사용하여 인수 Imaris 소프트웨어 (그림 1 참조)를 사용하여 단일 입자 역학에 대한 자동화 된 3D 입자 추적하여 분석 하였다. 우리는 회절의 동적 동작을 상호 연관되어 있기 때문에 HIV-1 세포의 미세 구조, 시간 경과 라이브 세포 이미징 및 3D 입자 추적을 가진 입자는 결과에 매우 중요합니다. 그러나 큰 정적 구조, 간단한 형광 이미지 (살아있는 세포없이) 상관 관계 분석에 충분할 것입니다. </li></ol> 3. 냉동 수화 EM 샘플 준비 마지막으로 공 촛점 이미지와 샘플 극저온 고정 모음 사이의 시간 지연을 최소화하기 위해, FEI Vitrobot (또는 다른 유리화 장치) 형광 공 촛점 라이브 셀 이미지를 수집하는 동안 시작과 플 런지 냉동 준비를해야합니다.<ol><li> 유리화 장치의 전원을 켜고 22의 기후 온도를 설정 ° C, 100 %로 목표 습도, 7 초에 더럽히는 시간 및 대기를하고 1 초 시간을 드레인. </li><li> 플런저 듀어에 그리드 스토리지 박스를 배치하고 차가운 액체 에탄을 준비합니다. 유리화 장치에 듀​​어를 탑재합니다. </li><li> 즉시 공 촛점 라이브 세포 이미징 (2 절) 후 얼음 냉각 구리 블록에 배양 접시를 놓고 cryoEM 샘플 준비 방에 전송할 수 있습니다. 전문 핀셋에 EM 그리드를로드하고 빠르게 그리드에서 모든 미디어를 멀리 얼룩. 모래 바닥은 0.2 μm의 형광등 마이크로 즉시 격자에 배치와 함께 15 나노 골드 비드 솔루션의 4 μL를 혼합 한 후, 여과지, 수동으로 이루어집니다. 골드 비즈는 단층 데이터 수집 및 정렬을 돕기 위해 기준점 마커로 사용됩니다. 형광 마이크로는 (그림 2C-2F 참조) 형광등 cryoEM 이미지 사이의 상관 관계를 원조하는 데 사용됩니다. </li><li> 유리화 장치에 핀셋을 넣고 액체 에탄 16 동결을 몰아 내고 빠지게 할 장치를 지시합니다. 최상의 결과를 달성하기 위해 최적화 된 더럽히는 매개 변수는 다음과 같습니다 오점 시간, 7 초, 오점 오프셋 0, 배출 시간, 1 초, 온도 22 ° C, 습도 100 %. </li><li> 나중에 사용하기 위해 즉시 cryoET 이미징을위한 cryoEM 홀더, 또는 액체 질소 저장 듀어에 냉동 수화 격자를 전송합니다. </li></ol> 4. CRYO-형광 광학 현미경 홈 내장, 극저온 형광 샘플 챔버 및 단계 시스템 (그림 3) 단계 4.1-4.10를 수행해야합니다. 단계의 자세한 사양과 설명은 6월 등. 15에서 찾을 수 있습니다. <ol><li> 적어도 2 시간내는 형광 빛 현미경 (그림 3A 참조) 시작하기 전에 액체 질소로 자기 가압 액체 질소 듀어를 입력합니다. </li><li> homebuilt CRYO-F를 탑재이러한 올림푸스 IX 71로 거꾸로 형광 광학 현미경, 위에 luorescence 샘플 스테이지 15 (그림 3). </li><li> 자기 가압 듀어에 극저온 샘플 단계의 액체 질소 주입구를 연결하고 적절한 용기에 액체 질소 오버 플로우 방지 콘센트를 배치합니다. 렌즈가 온난하고 서리 무료로 유지하는 대물 렌즈 위에 배치 슬리브 건조 질소 가스 라인을 연결합니다. </li><li> 냉동 수화 샘플 그리드를로드 CRYO 단계 챔버 구리 블록 플랫폼 (그림 3B에서 검은 색 화살표)를 놓습니다. 냉각 및 자기 가압 충전 듀어에서 유입 라인을 통해 액체 질소 극저온 단계의 구리 챔버를 입력합니다. </li><li> 극저온 단계는 액체 질소 온도 (~ 4-6 분)에 도달하면, 극저온 단계로 그리드 스토리지 상자 (단계 3.5에서) 전송합니다. </li><li> 구리 블록 EM 표본 카트리지에 냉동 수화 샘플 격자를 놓고 G 클립C-링을 사용하여 장소를 제거하거나 상단에 미리 냉각 구리 반지 (그림 3D 블랙 화살촉)를 배치 격자의 쉬운 검색을 위해 또한 장소에 그리드를 유지하기 위해 한 후 (Polara 현미경 카트리지를 사용하는 경우) CRYO-형광 이미징 (비 Polara cryo - 전자 현미경을위한 경우). </li><li> CRYO 단계 (그림 3B 흰색 화살촉)의 내부 챔버에서 카트리지를 (단계 4.6)에 놓습니다. </li><li> 검색하고 살아있는 세포 이미징 데이터에서 동일한 바이러스 입자를 찾을 수 있습니다. EM 격자 인덱스를 가지고 있기 때문에 살아있는 세포 이미지와 CRYO-형광 이미지를 모두 그리드에 동일한 입자를 지역화하는 간단합니다. </li><li> 긴 작동 (2.7-4 mm) 대물 렌즈와 광학 현미경을 사용하여 극저온 조건에서 식별 된 위치에 CRYO-DIC와 GFP 이미지를 획득. CRYO-형광 이미징 동안 주기적으로, 극저온 무대와 리필을에서 액체 질소 레벨을 점검 필요, -170 아래의 샘플 단계를 유지하기 위해° C. </li><li> CRYO-형광 이미징이 완료되면, 조심스럽게 구리 블록 플랫폼 표본 카트리지를 반환하고 Polara 시스템과 미래 cryoET 분석을 위해 액체 질소 듀어에 카트리지를 보관하십시오. 비 Polara cryo - 전자 현미경을 사용하는 경우, 구리 반지를 제거 샘플 격자를 검색, 그리드 스토리지 박스에 배치하고, 시편 cryoET에 의해 검사 될 때까지 액체 질소 듀어의 표본을 저장합니다. </li><li> 데이터 분석의 경우, 인수 CRYO-DIC와 GFP 이미지를 오버랩 (단계 4.9에서 그림 4b 참조) 라이브 세포 이미징 시리즈에서 얻은 사람들과 극저온 형광 이미지 GFP 신호의 위치를 연관. </li></ol> 5. cryo - 전자 단층 촬영 <ol><li> 이러한 Polara G2 현미경으로 전계 방출 총을 탑재 전자 현미경의 극저온 전송 스테이션에 샘플 카트리지를로드합니다. </li><li> 140X, IDE의 배율에 따라 저용량 - 검색 모드ntify 및 스테이지 파일에 연결된 그리드 사각형 (단계 4.11부터) 저장합니다. </li><li> 3,500 X의 배율 낮은 복용량 검색 모드에서, 100 μm의 목표 조리개 검색을 삽입하고 두 번째 단계의 파일에 GFP 신호와 상관 관계가있는 모든 위치를 저장합니다. </li><li> 중요하지 않은 탄소 영역에서 얼음을 떨어져 연소, 무대 Y 기능을 사용하여, / 2과 경사 축 수정 - 저용량 노출 모드에서, 1 또는 2 E의 복용량에 빔 강도를 조정하는 빈 영역을 찾아 여러 개의 금 구슬. </li><li> 저용량 초점 모드에서, 2 ~ 3 μm의 초점 거리를 조정하고 경사 축에 평행 초점의 방향을 정렬 각도를 조정합니다. </li><li> 저용량 - 검색 모드에서 (단계 5.3에서) 저장 위치를​​ 기억, 표본 eucentric 높이를 조정하고 관심 영역의 기울기 범위를 확인합니다. 박람회에 8 ~ 10 ㎛ defocus 조명에서 - 매우 낮은 전자 선량 (/ 2 ~ 1 E)와 투사 이미지를 획득cryo - 전자 단층 촬영을 위해 상호 바이러스 입자를 확인하기 위해 우레 모드. </li><li> 저용량 초점 모드로 전환합니다. TEM 자동 기능 메뉴에서 자동 eucentric 높이를 앞에하고 초점 영역에 기능을 집중한다. </li><li> 틸트 시리즈를 구입하는 매개 변수를 설정합니다. / 2 총 용량 - 본 논문에서는 그림 4, 틸트 각도는 각각 3 °, 2 ° 경사 단위에서, °, 아래 이상 45 ° ± 70 범위는 6 μM이 초점 흐림 약 70 E와 함께 사용되었다. </li><li> 모든 저장 위치에 대한 단계 5.7 및 5.8를 반복합니다. 배치 단층 촬영 소프트웨어는 처리량을 증가하기 위해 여러 위치에서 자동 데이터 수집에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 6. IMOD 17을 사용하여 입체적으로 재구성 <ol><li> 최소 및 최대 밀도 값을 조정하고 큰 이미지의 변화로 인해 제외 할 모든보기가 있는지 확인하기 위해 원시 경사 시리즈를 검사합니다. </li><li> eTomo 및 축 유형, 픽셀 크기, 기준점 직경 등을 사용하여 설치 단층 촬영 패널을 시작합니다. com을 스크립트를 만들 수 있습니다. </li><li> 단층 계산의 여러 단계를 조정 / 동시에 따라야 할 수 있도록 메인 화면을 구성합니다. 필요한 매개 변수를 수정하고 각 처리 단계 (eTomo 자습서를 참조하여 필요한 특정 프로그램을 실행 <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ). </li><li> 최종 단계에서 전체 정렬 된 스택을 만들 (0.6 미만의 평균 잔차)와 IMOD에서 가중 다시 프로젝션 알고리즘을 사용하여 tomograms을 재구성. </li><li> 명암과 선명도를 향상시키기 위해 적절한 매개 변수와 함께 IMOD에서 구현 된 3D 비선형 이방성 확산 가장자리 향상 프로그램을 사용하여 잠재적 인 이해의 영역을 워터 마크. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

우리는 cryoET 다음 시간 경과 공 촛점 라이브 세포 형광 이미징을 사용하여 동적 세포 이벤트를 분석하는 고급 상호 접근 방식을 제공하는 프로토콜의 간단한 세트를 발표했다. 고해상도 cryoET와 3D 라이브 세포 이미징의 상관 관계를하는 우리의 방법론 개발은 숙주 세포로 희귀, 동적 (앞에서 정적보고되지 않은) 및 회절 바이러스 입자와의 상호 작용을 시각화 많은 도전 생물학적 문제를 조사하는 것이 중요합니다 . 살아있는 세포에서 특정 입자의 공간과 시간적 동작은 살아있는 세포 분석에 의해 특징 및 정의 감염 단계에서 바이러스 세포 상호 작용의 구조적 세부 사항은 탐구한다. 수제, 극저온 광학 현미경의 무대 cryoEM에 의해 캡처 살아있는 세포와 이미지에서 형광 빛을 이미지 사이의 직접적인 상관 관계를 촉진하는 데 사용됩니다. 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 포인트가있다최적의 데이터 수집 및 분석을 가지고 주문한다. 그리드의 가장자리에 경사 시리즈 수집을위한 시야의 방...

cryo - 전자 단층 촬영 (cryoET)는 세포와 조직의 3 차원 (3D) 시각화를 허용하고 근접에 생리 상태 1 분자 해상도에서 기본 세포 소기관 및 세포 구조의 조직에 대한 통찰력을 제공하는 강력한 이미징 기술입니다. 그러나, 그들의 방사선 민감도와 결합 흠 냉동 수화 시편의 본질적 낮은 콘트라스트가 어려운 세포 내부 관심 분야를 찾아 연속적으로 대상 영역을 손상시키지 않고 성공적으로 기울기 시리즈를 수행 할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 빛과 전자 현미경을 결합하여 상호 접근 방식이 필요합니다. 형광 라벨에 의해 강조 특정 기능을 식별 및 형광 광학 현미경에 의해 위치, 그리고 자신의 좌표는 고해상도 3D 구조의 데이터 수집을위한 전자 현미경으로 전송됩니다 수 있습니다. 이 상관 관계 방법은 대상의 위치를​​하는 데 도움이관심 REAS가 해결 될 수 있습니다. cryoEM (&lt;300 nm의)에 시료 두께 제한으로 인해, 현재 셀의 단지 주변 지역은 CryoET하여 3D 구조 분석에 적합합니다. 또한 밀링 9 유리체가 8 단면 또는 극저온 집중 이온빔 (FIB)에 의해 냉동 수화 시편의 두께를 줄이는 것은 상호 이미징의 기능을 확장 할 것이다. 이전에 상호 방법은 주로 대형 및 정적 구조 10-13 cryoET 데이터 수집을 용이하게하기 위해 사용되었다. 이 연구에서는 극저온 단계는 cryoEM 격자를 받아 직립 현미경 또는 거꾸로 현미경 10,11,14 중 하나에 맞게 구현되었습니다. 그리드를 전환하여 자신의 설계에 매우 간단 해 보이지만, EM 그리드에 대한 참여 단계를 전송하는 그리드, 변형 손상 및 오염 될 수있는 가능성을 증가 추가가 있습니다. 우리는 최근의 기술적 진보를 보여우리가 직접 감염 15 초기 단계에서 이러한 HIV-1과 숙주 세포의 상호 작용으로 촬영 자연 어려운 동적 인 이벤트를 시각화 할 수 있습니다 상호 현미경. 따라서 우리는 상관 관계를 촉진, 그리드 처리에 의한 시편의 손상을 최소화하기 위해 카트리지 시스템을 적응내는 빛 현미경 샘플 단계를 설계하고 구현하여이 작업을 수행. 우리의 디자인은 모두 극저온 빛과 cryo - 전자 현미경은 따라서 상호 프로세스를 능률화, 샘플 전송하지 않고 동일한 시편 홀더에 순차적으로 수행 할 수 있도록 통합 된 시편 카트리지 홀더가 포함되어 있습니다. 또한, 우리는 또한 기준점 표지로 형광 라텍스 구슬을 사용하여 정확하고 신뢰할 수있는 관계 절차를 구현했습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L 포도당 w/ L-글루타민</td><td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>F1141-1MG</td><td>EM 그리드에서 HeLa 세포 배양</td></tr><tr><td>Cell tracker</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>C34552</td><td>Red CMTPX</td></tr><tr><td>Protein A gold conjugates</td><td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td><td>15822-1</td><td>15nm 직경</td></tr><tr><td>0.2 &mu; m 형광 마이크로스피어</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>F8811</td><td>황록색 형광</td></tr><tr><td>열 불활성화 태아 송아지 소 혈청</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 배양 접시</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>골드 quantifoil finder EM grids</td><td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td><td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>70011-044-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Glow-discharge device 100X</td><td>EMS, Hatfield, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Polara G2 전자 현미경 및 전계 방출 건</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td>300keV</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI, Hillsboro, 또는</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX 71 현미경</td><td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td><td></td><td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA(2.7-4mm working distance) 대물 렌즈</td></tr><tr><td>Nikon TiE 현미경</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY</td><td></td>, <td>60X/1.35 NA 오일 이멀젼 대물 렌즈</td></tr><tr><td>Sweptfield 컨포칼 현미경 사용</td><td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tokai Hit live cell chamber</td><td>Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>극저온 형광 샘플 스테이지</td><td>기계</td><td></td><td>공장에서 만든 홈빌트, 설계는 참고 자료 15 참조.</td></tr></tbody></table>

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

cryo - 전자 단층 촬영 (cryoET은) 근접에 생리적 상태 1 분자 해상도의 세포 구조의 3D 시각화 할 수 있습니다. 그러나 cryoET와 숙주 세포 환경에서 각각의 바이러스 복합체의 직접 시각화는 특히 HIV-1의 경우, 바이러스 성 항목의 자주와 동적 인 특성으로 인해, 2 도전합니다. 시간 경과 라이브 세포 이미징 HIV-1 3-7 라이프 사이클의 여러 측면에 대한 정보의 큰 거래를 굴복 동안, 해상도는 살아있는 세포 현미경으로 여유가 (~ 200 nm의) 제한됩니다. 우리의 작품은 살아있는 세포 형광 현미경을 결합내는 형광 현미경 및 cryoET에 의해 HIV-1 감염의 초기 사건의 직접적인 시각화를 허용하는 상관 관계 방법을 개발을 목표로 하였다. 이러한 방식으로, 라이브 셀내는 형광 신호를 정확하게 cryoET에서 샘플링을 안내하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 구조 정보는 cryoET 수 있습니다 B에서 얻은동적 기능을 데이터로 보완 전자 형광 표지 대상의 라이브 세포 이미징을 통해 얻은. 이 비디오 문서에서는, 우리는 구조 HIV-1의 조사 및 3D 상호 고속 라이브 세포 이미징 및 고해상도 cryoET 구조 분석을 사용하여 호스트 세포 상호 작용에 대한 자세한 방법과 프로토콜을 제공합니다. HIV-1 입자에 감염 헬라 세포는 공 촛점 살아있는 세포 현미경으로 첫 번째 특징하였고, 같은 바이러스 성 입자를 포함하는 영역은 다음 차원 구조 자세한 내용은 cryo - 전자 단층 촬영을 이용하여 분석 하였다. 영상 데이터, 광학 이미징 및 전자 이미지의 두 세트 사이의 상관 관계는 집에서 내장내는 형광 빛 현미경 스테이지를 사용하여 달성되었다. 여기에 설명 된 방법은 바이러스 숙주 세포의 상호 작용 연구,뿐 아니라 세포 신호 전달, 막 수용체 인신 매매와 같은 세포 생물학의 광범위한 응용 프로그램, 그리고 많은 다른 동적 셀 프로세스뿐만 아니라, 도움이 될 것입니다. &lt;/ P&gt;

바이러스 입자의 동적 거동을 특성화하기 위해, HIV-1에 감염된 헬라 세포는 고속 공 촛점 살아있는 세포 현미경으로 몇 군데 있었다 및 입자의 운동은 (그림 1) 자동화 된 3D 입자 추적하여 분석 하였다. 마지막으로 공 촛점 라이브 셀 이미지 수집 및 플 런지 냉동 (이는 충분히 상관 HIV-1 입자를 잃을 수 있습니다)내는 형광 빛 현미경 단계 (그림 3 사이에 발생할 수있는 몇 분의 시간 경과를 방지하려면 ) 가벼운 현미경에 cryoEM 카트리지 내에서 이미지 냉동 수화 샘플 15을 위해 설계 및 건설되었다. 구리 블록 플랫폼 (그림 3B, 검은 색 화살표)과 구리 반지 (그림 3 차원, 화살촉)는 비 Polara 전자 현미경과 함께 사용하기 위해 추가되었습니다. 공 촛점 라이브 셀내는 형광 빛 현미경 및 cryoET의 상관 관계는 인덱스 금 Quantifoil 그리드 0.2 &a...

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

본 절차의 전반적인 목표는 호스트 HeLa 세포와 상호작용하는 역동적인 소형 HIV-1 입자를 이미징함으로써 상관 형광 광학 및 저온 전자 현미경(cryo-electron microscopy) 방법의 활용법을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 유리 바닥 배양 접시 내의 골드 파인더 EM 그리드에 HeLa 세포를 분주하여 배양하고, GFP가 표지된 HIV-1 입자로 HeLa 세포를 감염시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로, HIV-1에 감염된 세포의 타임랩스 고속 3D 살아있는 세포 공초점 이미지를 수집하고, 유리화 후 단일 입자 역동성을 분석하기 위해 자동화된 3D 입자 추적을 통해 이미지를 분석하는 것입니다.라이브 세포 이미징 데이터에서 확인된 것과 동일한 바이러스 입자 샘플을 저온 형광 이미지에서 찾아내어, 이후 고해상도 3D 저온 전자 단층 촬영 분석을 수행합니다. 마지막 단계는 HIV-1 입자가 포함된 것으로 확인된 모든 위치에 대해 기울인 저온 전자 현미경 투영 시리즈를 수집하고, imad 소프트웨어의 가중 역투영 알고리즘을 사용하여 3D 톰(tom)을 재구성하는 것입니다. 최종적으로, 첨단 3D 상관 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 저온 전자 단층 촬영을 통해 회절 한계의 동적인 바이러스 입자와 숙주 세포 간의 상호작용을 직접 시각화합니다.본 연구는 HIV-1 감염 사건만을 직접 시각화할 수 있는 상관관계 분석법 개발을 목표로 합니다. 이러한 방식으로 살아있는 세포의 형광 현미경 관찰, 저온 형광 현미경 관찰 및 저온 전자 단층 촬영을 결합함으로써, 살아있는 세포와 저온 형광 신호를 저온 전자 단층 촬영의 샘플링을 정밀하게 안내하는 데 활용할 수 있습니다. 또한, 저온 전자 단층 촬영으로 얻은 구조적 정보는 형광 표지된 표적의 라이브 셀 이미징을 통해 얻을 수 있는 동적 기능 데이터로 보완될 수 있습니다. 본 기술 또는 기존 방법의 주요 장점은 고해상도 3D 저온 전자 단층 촬영 방식과 결합된 고속 3D 라이브 셀 이미징 기반의 고급 상관관계 분석법을 적용하여, 감염 초기 단계의 HIV-1과 숙주 세포 간의 상호작용과 같이 본질적으로 포착하기 어려운 동적 사건들을 연구할 수 있다는 점입니다.세포 배양을 위해 그리드를 준비하려면, 200 mesh R 2/2 quanti-foil 금 EM finder 그리드의 탄소 면을 25 mA의 전류로 25초 동안 글로우 방전 처리합니다. 50 µg/mL fibronectin 용액 40 µL 방울 위에 탄소 면이 아래로 향하게 띄워 EM 그리드를 fibronectin으로 코팅합니다. 소독을 위해 UV 램프가 있는 조직 배양 후드 내에서 2시간 동안 둡니다. 유리 바닥 배양 접시에서 HeLa 세포를 2 × 10⁴ cells/mL의 밀도로 그리드 위에 플레이팅합니다.적절한 보충제가 포함된 DMEM에서 세포를 37°C, 5% CO₂ 조건으로 약 18시간 동안 배양하십시오. HIV-1 감염 전, 유리 바닥 배양 접시의 HeLa 세포에 형광 세포 추적제를 첨가하고, 형광 염료가 흡수될 수 있도록 접시를 37°C에서 10분 동안 배양하십시오. PBS로 세포를 세척한 후, 미리 데워둔 신선한 배지 50 µL를 첨가하십시오. 접시를 광시야 공초점 스캐너 현미경의 37°C 라이브 셀 챔버에 배치하십시오. Cryo-EM은 샘플의 비교적 얇은 영역이 필요하기 때문에.정사각형당 1~3개의 세포가 포함되어 있으며, 세포들이 가장 넓게 퍼지고 평평해진 두 가지 유사분열 단계 사이에 있는 여러 시야를 선택하십시오. 향후 이미징을 위해 NIS element 소프트웨어를 사용하여 이 위치들을 저장하십시오. 다음으로, G-F-P-V-P-R을 포함하는 VSVG 슈도타이핑 HIV 1 입자를 EM 그리드가 흐트러지지 않도록 주의하며 디시의 바닥 웰에 감염시키십시오. 이미징할 위치가 이미 선택되어 저장되었으므로, 바이러스를 첨가한 직후 이전에 선택한 위치에서 20~40분 동안 타임랩스 고속 3D 공초점 이미지를 수집하십시오.공초점 생세포 이미징 직후, 배양 접시를 얼음으로 냉각된 구리 블록 위에 놓고 cryo EM 시료 준비실로 옮깁니다. EM 그리드를 전용 핀셋에 올리고, 거름종이로 잔여 배양액을 빠르게 닦아낸 후, 15 nanometer 금 나노입자 용액과 0.2 micron 형광 마이크로구체가 혼합된 용액 수 µL를 그리드 위에 즉시 도포합니다. 형광 마이크로구체는 형광 이미지와 cryo-EM 이미지 간의 상관관계 분석을 돕기 위해 사용됩니다.최상의 결과를 얻도록 최적화된 블로팅 파라미터를 사용하여, 플런지 동결을 위한 유리화 장치에 핀셋을 장착합니다. 저온 형광 광학 현미경 절차를 시작하려면, 대물렌즈를 따뜻하게 유지하고 성에가 생기지 않도록 대물렌즈 위에 설치된 슬리브에 건조 질소 가스 라인을 연결하고, 자체 제작한 저온 형광 시료 스테이지를 도립 형광 광학 현미경에 장착합니다. 저온 시료 스테이지의 액체 질소 입구를 가압 용기에 연결하고, 액체 질소 오버플로 방지 배출구를 적절한 용기에 배치합니다.동결 수화된 샘플 그리드를 구리 블록 위의 EM 시편 카트리지에 넣고, 그리드를 고정하기 위해 사전 냉각된 C 클립 링을 위에 배치합니다. 카트리지를 cryo 스테이지의 내부 챔버에 넣고 라이브 셀 이미징 데이터에서 확인한 것과 동일한 바이러스 입자를 검색하여 찾습니다. EM 그리드에는 인덱스가 있으므로, 라이브 셀 이미지와 cryo 형광 이미지 모두에서 그리드 상의 동일한 입자를 국소화하는 것이 수월합니다.작동 거리가 긴 대물렌즈가 장착된 광학 현미경을 사용하여, 저온 상태에서 식별된 위치의 cryo DIC 및 형광 이미지를 획득합니다. cryo 형광 이미징을 수행하는 동안 cryo 스테이지의 액체 질소 잔량을 주기적으로 확인하고, cryo-전자 토모그래피를 위해 시료 스테이지의 온도를 -170 °C 이하로 유지할 수 있도록 자가 가압 장치로 필요시 보충합니다. 전계 방출 총(field emission gun)이 장착된 전자 현미경의 cryo 전송 스테이션에 시료 그리드를 로드하고, 140 x 배율의 저선량 탐색 모드에서 관찰합니다.cryo 형광 이미지가 획득된 영역 또는 그리드 사각형을 식별합니다. 상관관계가 있는 영역의 저배율 cryo EM 이미지를 기록하고, 3,500 x 배율의 저선량 검색 모드에서 해당 위치를 스테이지 파일에 저장합니다. 100 micron 대물렌즈 조리개 검색을 삽입하고, GFP 신호와 상관관계가 있는 모든 위치를 두 번째 스테이지 파일에 저장합니다.경사 각도 범위, 전자 선량, 디포커스 값 및 경사 스킴을 포함하여 틸트 시리즈 획득을 위한 토모그래피 파라미터를 설정하십시오. 본 절차를 시작하기 위해 저장된 모든 위치에 대한 틸트 시리즈를 획득하십시오. Tomo Graham 계산의 여러 단계를 동시에 조정하거나 추적할 수 있도록 메인 창을 구성하고, 필요한 파라미터를 수정하며 각 처리 단계에 요구되는 특정 프로그램을 실행하십시오.마지막 단계에서, 주 잔차 오차가 0.6 미만인 전체 정렬 스택을 생성하고 가중 역투영 알고리즘을 사용하여 토모그램을 재구성합니다. 바이러스 입자의 동적 거동을 특성화하기 위해 Im mod를 사용합니다. HIV 1에 감염된 HeLa 세포를 고속 공초점 살아있는 세포 현미경으로 이미지화하고, 자동화된 3D 입자 추적으로 입자 이동을 분석했습니다.이 대표 이미지에서는 노란색 화살표로 표시된 단일 녹색 형광 바이러스 입자가 3D 공초점 스택 내에서 추적되었습니다. 프레임 간 간격은 3분으로 설정되었는데, 이는 마지막 공초점 살아있는 세포 이미지 수집과 급속 냉동(plunge freezing) 사이에 발생할 수 있는 수 분의 시간 차이를 방지하기 위함입니다. cryo EM 카트리지 내의 냉동 수화 시료를 이미징하기 위해 저온 형광 광학 현미경 스테이지가 설계 및 제작되었습니다.광학 현미경 사진에서 패널 A는 구리 cryos 시료 스테이지를 냉각하는 데 사용되는 액체 질소가 채워진 자기 가압 듀어(dewar)를 보여줍니다. 패널 B는 cryos 시료 스테이지의 상단 내부 뷰이며, 흰색 화살표로 내부 챔버가 표시되어 있습니다. 시료 그리드는 E EM 시료 카트리지 위에 놓이며, 이 카트리지는 검은색 화살표로 표시된 구리 블록 플랫폼의 중앙에 위치합니다.이 플랫폼은 비극성 전자 현미경과 함께 사용하기 위해 추가되었습니다. 시료 그리드를 로드한 후, 카트리지는 저온 형광광원을 위해 내부 챔버로 이동되었습니다. 현미경 패널 C와 D는 각각 비극성 저온 전자 현미경 사용 시 그리드를 고정하기 위해 구리 링을 배치하기 전과 후의 시료 카트리지를 보여줍니다.고등 상관 생세포 현미경 검사 및 저온 전자 토모그래피를 위한 이 절차의 유용성은 숙주 HeLa 세포와 상호작용하는 형광 표지된 HIV-1 입자의 직접적인 시각화를 통해 입증됩니다. 패널 A에 표시된 저온 광학 현미경 스테이지로 기록한 DIC 영상과 패널 B에 표시된 GFP 태그 입자의 저온 형광 영상을 중첩하였습니다. 태그된 입자는 빨간색으로 표시되었습니다. 패널 C, D, E는 각각 140x, 3,500x, 27,500x 배율에서 패널 B와 C에 원으로 표시된 형광 입자가 포함된 영역을 촬영한 저선량 저온 전자현미경(cryo-EM) 영상입니다.패널 E의 삽입도는 토모그래피 틸트 시리즈 획득 후 기록된 확대 뷰이며, 패널 F, G 및 H는 Z 방향으로 21 nm 간격으로 떨어져 있는 세 개의 4 nm 두께 토모그래피 슬라이스를 보여줍니다. 입자와 헬로 세포막 사이의 연결부는 삽입도의 투영 이미지, 패널 E 및 토모그래피 슬라이스의 화살표로 표시되어 있습니다. 패널 F와 G에서.우리는 타임랩스 공초점 리포셀 형광 이미징과 크라이오 전자 토모그래피를 순차적으로 적용하여, 바이러스와 무균 상태의 상호작용을 분석하는 진보된 상관관계 분석법을 위한 간단한 프로토콜 세트를 제시하였습니다. 이 절차를 수행할 때, 형광 이미지와 전자 현미경 이미지 간의 정확하고 신뢰할 수 있는 상관관계 설정이 크라이오 전자 토모그래피의 성공적인 획득에 매우 중요하다는 점을 유념해야 합니다. 본 절차에서 설명한 데이터는 세포 신호 전달 표면 수용체 내면화와 같은 세포 생물학의 역동적인 세포 과정과 관련된 수많은 응용 분야에 유용하게 활용될 것입니다.

correlative-microscopy-for-3d-structural-analysis-dynamic

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

여기에서는 공초점 및 직렬 블록면 주사 전자 현미경을 연결하여 고유 조직에서 특정 세포의 미세 구조를 밝히는 cocem3D 방법을 소개합니다.

특정 감각 세포의 상호 공 초점 및 3D 전자 현미경

T 세포 면역학적 시냅스에서 필라멘트 액틴의 유속과 방향성을 조사하기 위해 라이브 셀 초해상도 이미징을 내부 전반사 형광과 결합하고 시공간 이미지 상관 분광법으로 정량화합니다.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

여기, 우리는 프로토콜 3 색 smFRET 데이터 및 3D 앙상블 숨겨진 마르코프 모델의 분석을 제시. 이 방법을 과학자 들은 복잡 한 단백질 시스템, cooperativity 또는 서로 상호 작용을 포함 하 여에서 운동 정보를 추출할 수 있습니다.

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

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본 프로토콜은 배양된 래트 해마 뉴런 및 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축색 초기 분절의 막주기적 골격의 액틴 고리 및 기타 성분을 시각화하고 측정하는 방법을 기술한다.

3D 구조화 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축삭 초기 세그먼트의 멤브레인 주기적 골격의 특성 측정

여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

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우리는 동적 미세 소관 및 형광 표지 된 미세 소관 관련 단백질의 동시 이미징을 위해 간섭 반사 현미경 검사 및 전체-내부-반사-형광 현미경을 구현하기위한 프로토콜을 제시합니다.

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차동 동적 현미경 (DDM)은 동적 광산란과 현미경의 기능을 결합합니다. 여기서, DDM을 사용하여 비멘틴 네트워크에서 입자의 서브확산 및 케이징된 역학을 정량화함으로써 재구성된 세포골격 네트워크를 특성화하는 과정과 활성 미오신 구동 액틴-미세소관 복합체의 탄도 운동이 제시된다.

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액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

이 프로토콜은 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경을 구축하는 방법과 세포골격 네트워크 시각화를 위한 사용법에 대해 자세히 설명합니다.

세포골격 네트워크의 시각화를 위한 맞춤형 단일 대물렌즈 광시트 형광 현미경의 설계 및 구축

학습하세요 상호 현미경법을 이용하여 HIV-1 바이러스 입자와 HeLa 세포 간 동적 상호 작용을 3차원 구조로 분석하는 방법을. 이 기술은 고속 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 크라이오 전자 단층 촬영을 결합하여 실시간 바이러스 행동을 시각화합니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

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