Name: Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Lernen Sie die adoptive Übertragung diabetogener CD4+ T-Zellen zur schnellen Induktion von Typ-1-Diabetes in Mäusen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Studien zur Diabetes-Pathogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Drs.. Robert Bonneau und Neil Christensen für hilfreiche Kommentare. Diese Arbeit wurde von der Pennsylvania State University College of Medicine Fonds unterstützt.

1. Isolierung von T-Zellen aus Milz und Lymphknoten von Mäusen BDC2.5 <ol><li> Verwenden Sie 6 Wochen alten Pre-diabetischen weiblichen Mäuse BDC2.5 als Spender von diabetogene CD4 + T-Zellen. Mäuse sollten Diabetes-frei durch Uringlucose Messung (siehe unten) bestimmt. </li><li> Euthanize jede Maus mit CO 2-Erstickung und entfernen Sie die Milz, Achsel-und brachial Lymphknoten unter sterilen Bedingungen. Um die Milz zu entfernen, tränken Sie das Fell mit 70% Ethanol, dann geschnitten und einfahren Haut. Die Milz wird sichtbar als dunkelrotes Organ auf der linken Seite der Maus. Machen Sie eine 1-Zoll-Schnitt im Bauchfell mit den kleinen Schere und sanft greifen die Milz in der Mitte mit einem Paar kleine Pinzette. Sorgfältig schneiden das Bindegewebe und die angeschlossenen Fett so weit wie möglich zu entfernen und die Milz. </li><li> Sammeln Sie die Milz und die Lymphknoten in 10 ml Dulbecco&#39;s-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis. </li><li> Bereiten Sie eine einzelne Zelle Suspension mit the Ende einer sterilen 10 ml Spritze Kolben vorsichtig auf die lymphatischen Organen durch 70 um Zelle Siebe (eine pro Milz Sieb und 4-6 Lymphknoten pro Sieb) in den gleichen 50 ml konischen Röhrchen. </li></ol> Während des Prozesses, spülen jedes Sieb mit 1 ml DMEM mehrmals, um die Gewinnung von Zellen aus dem Sieb zu maximieren. <ol start="5"><li> Übertragen der gesammelten Zellen von dem 50 ml konischen Röhrchen in ein 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 300-400 xg für 7 min bei RT. </li><li> Um rote Blutzellen lysieren, den Überstand verwerfen, wieder die Zellen in 5 ml Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK)-Puffer (pH 7,2) und inkubieren Sie die ACK-Zell-Suspension bei RT für 5 min. </li><li> 10 ml DMEM dem ACK-Zell-Suspension und zentrifugieren wie oben. Waschen Sie das Zellpellet einmal in 10 ml DMEM. </li></ol> 2. Fluorescence-Activated Cell Sorting von diabetogene CD4 + T-Zellen von Mäusen BDC2.5 <ol><li> Re-suspend Zellen in 5 ml FACS sTaining Puffer und zählen die Anzahl der lebensfähigen Zellen (mit einem Phasenkontrast-Mikroskop und einer Zählkammer) durch Trypanblau Ausgrenzung. </li><li> Mit FACS-Puffer, passen die Zellsuspension Volumen bis 5 x 10 7 Zellen / ml. Entfernen ~ 1 x 10 6 Zellen pro Färbung Kontrolle (1 keine Flecken, 3 Einzelzimmer Flecken). Färben der Probe auf nicht-aktivierten transgenen CD4 + T-Zellen mit anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) und Anti-CD62L (PE) monoklonaler Antikörper (mAb) in einem 15 ml-Röhrchen. Führen Zellfärbung mit den mAb Konzentrationen vom Hersteller für 20-30 min schlug bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Probe und einzigen Fleck Kontrollen mit FACS-Puffer bei&gt; 3X der Färbereaktion Volumen. Zentrifugieren bei 300-400 xg, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in FACS-Puffer (1-2 x 10 7 Zellen / ml für die Sortierung von Probe und 300 ul für einzelne Fleck Kontrollen) und auf Eis lagern bis zum nächsten Schritt. </li><li> Übergeben Sie die Zelle Probe durch eine 35 um ZelleSieb Haubenrohr zu entfernen Zellklumpen. Ordnen Sie die Proben für CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + Zellen auf einem Cell Sorter mit einem geschulten Bediener. Sammeln Sie die sortierten Zellen in 3 ml DMEM in einer 15 ml Tube. Erlauben 2,5-3 Std., einschließlich Setup, bis 1,5 x 10 8 Zellen (die ungefähre Anzahl von Zellen aus 3 Donormäusen erhalten) an einer Art von 2 x 10 4 insgesamt events / sec sortieren. Erwarten ~ 2,5 x 10 6 nicht aktivierten transgenen CD4 + T-Zellen pro Maus nach cell sorting. </li><li> Notieren Sie sich die absolute Zahl der sortierten Zellen am Ende der Sortierung und zentrifugieren für 7 min bei 300-400 g x. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen (2 x 10 6 Zellen / ml) in steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 +-frei) für die T-Zell-Transfer Adoptiveltern. </li></ol> 3. Adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Zellen aus BDC2.5 Mäuse <ol><li> Mit einer 1-ml-Spritze und ein 18-1 ½-Gauge-Nadel, sanft resuspendieren die FACS-gereinigten CD4 +T-Zellen und laden Sie die 1 ml Spritze. In Vorbereitung zur Injektion, ersetzen Sie den 18-1 ½-Gauge-Nadel mit einer 27-Gauge-Nadel ½. </li><li> Expose 6-8 Wochen alte weibliche NOD.SCID Empfängermäuse einer Wärmelampe, bis sie Pflege Verhalten zeigen. </li><li> Zurückhalten Empfängermäuse in einem Verzögerer und wischen dem Schwanz mit 70% (v / v) Ethanol, um die Injektionsstelle zu desinfizieren. </li><li> Spritzen 1-2 x 10 6 FACS sortierten Zellen / Maus (in bis zu 500 ul PBS) entweder in der seitlichen Schwanzvenen. </li></ol> Nicht mit Gewalt den Kolben. Wenn die Nadel richtig in der Vene liegt, wird die Einspritzung fast ohne Widerstand zu nehmen. 4. Überwachung Empfänger Mäuse für Hyperglykämie und T1D <ol><li> Beginnend fünf Tage nach der T-Zell-Übertragung werden NOD.SCID Empfängermäuse täglich erhöhten Urin Glucose unter Verwendung von Teststreifen (Bayer Diastix) gemäß den Anweisungen des Herstellers überwacht. Mäuse, die mit zwei aufeinanderfolgenden urine Blutzuckerwerte&gt; 250 mg / dl gelten als Diabetiker. </li></ol>

<ol><li>Makino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+of+a+non-obese%2C+diabetic+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice.</a> Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).</li>
<li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+etiology%2C+immunology%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).</li>
<li>Delovitch, T. L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+mouse+as+a+model+of+autoimmune+diabetes%3A+immune+dysregulation+gets+the+NOD%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD.</a> Immunity. 7, 727-738 (1997).</li>
<li>Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+autoimmune+diabetes+mellitus+with+splenocytes+from+nonobese+diabetic+%28NOD%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice.</a> Diabetes. 35, 855-860 (1986).</li>
<li>Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syngeneic+transfer+of+autoimmune+diabetes+from+diabetic+NOD+mice+to+healthy+neonates.+Requirement+for+both+L3T4%2B+and+Lyt-2%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells.</a> J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).</li>
<li>Haskins, K., McDuffie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+diabetes+in+young+NOD+mice+with+a+CD4%2B+islet-specific+T+cell+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone.</a> Science. 249, 1433-1436 (1990).</li>
<li>Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+diabetes+into+immunodeficient+NOD-scid%2Fscid+mice.+Relative+contributions+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T-cells+from+diabetic+versus+prediabetic+NOD.NON-Thy-1a+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors.</a> Diabetes. 42, 44-55 (1993).</li>
<li>Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+autoimmune+diabetes+in+the+NOD+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse.</a> Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).</li>
<li>Serreze, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+I-mediated+antigen+presentation+and+induction+of+CD8%2B+cytotoxic+T-cell+responses+in+autoimmune+diabetes-prone+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice.</a> Diabetes. 45, 902-908 (1996).</li>
<li>Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+maintenance%2C+and+adoptive+transfer+of+diabetogenic+T-cell+lines%2Fclones+from+the+nonobese+diabetic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse.</a> Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).</li>
<li>Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+apoptosis+in+T+cell-mediated+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).</li>
<li>Amrani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-independent+beta-cell+destruction+by+diabetogenic+CD8%28%2B%29+T+lymphocytes+in+transgenic+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice.</a> J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).</li>
<li>Dobbs, C., Haskins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+T+cell+clone+and+of+T+cells+from+a+TCR+transgenic+mouse%3A+TCR+transgenic+T+cells+specific+for+self-antigen+are+atypical%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical.</a> J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).</li>
<li>Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-lymphocyte+clone+specific+for+pancreatic+islet+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen.</a> Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).</li>
<li>Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+a+diabetogenic+T+cell+from+genesis+through+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis.</a> Cell. 74, 1089-1100 (1993).</li>
<li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromogranin+A+is+an+autoantigen+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes.</a> Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).</li>
<li>Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinpointing+when+T+cell+costimulatory+receptor+CTLA-4+must+be+engaged+to+dampen+diabetogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-dependent+regulatory+circuits+in+immune+inflammation+highlighted+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes.</a> J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD%2FLtSz-scid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> J. Immunol. 154, 180-191 (1995).</li>
<li>Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autoimmune+diabetes+locus+Idd9+regulates+development+of+type+1+diabetes+by+affecting+the+homing+of+islet-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells.</a> J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).</li>
<li>Verdaguer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+autoimmune+diabetes+in+monoclonal+T+cell+nonobese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice.</a> J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).</li>
<li>Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+early+age-related+increase+in+the+frequency+of+CD4%2B+Foxp3%2B+cells+in+BDC2.5NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice.</a> Immunology. 121, 565-576 (2007).</li>
<li>Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic+scid+mouse%3A+model+for+spontaneous+thymomagenesis+associated+with+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).</li>
</ol>

Alle Mäuse wurden an der Penn State College of Medicine specific pathogen-freie (SPF)-Anlage in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Penn State Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss untergebracht. Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

T1D in Empfängermäuse bei unterschiedlichen Wirkungsgrade durch adoptiven Transfer von ganzen Milzzellen oder T-Zell-Untergruppen von diabetischen NOD-Mäusen oder Mäusen transgenen TCR von diabetogene T-Zell-Klone abgeleitet induziert werden. Wir berichten hier über ein reproduzierbares Verfahren zur Induktion in Empfängermäuse innerhalb von zwei Wochen T1D bei 100% Inzidenz durch Übertragung FACS-gereinigten CD62L + BDC2.5 transgenen CD4 + T-Zellen in Mäusen NOD.SCID. Besondere Vorteile der...

Die NOD-Maus entwickelt Autoimmundiabetes spontan und wurde vielfach als Tiermodell für die menschliche T1D 1,2 verwendet. Pathogenese der T1D in NOD-Mäusen durch Infiltration, beginnend bei 3-4 Wochen alt, der pankreatischen Langerhans-Inseln von dendritischen Zellen und Makrophagen durch T und B-Zellen folgte. Diese Phase der zerstörungsfreien peri-Insulitis führt zu einem langsamen, fortschreitenden Zerstörung der Insulin-produzierenden β-Zellen der Bauchspeicheldrüse, was zu manifester Diabetes von 4-6 Monaten 3 Jahren. Übertragen von Splenozyten 4,5, CD4 + oder CD8 + 6,7 8,9 T-Zellen von diabetischen NOD-Mäusen haben gezeigt, dass Diabetes bei immungeschwächten Mäusen NOD vermitteln, was anzeigt, dass Insel-reaktiven T-Zellen eine zentrale Rolle in T1D Pathogenese spielen. Abhängig von den experimentellen Bedingungen, entwickelt Diabetes in Empfängermäuse langsam, über mehrere Wochen in diesen Studien. Ebenso verschiedenen T-Zell-Klone, von Zeit-und kostenintensive abgeleitetKultivieren von diabetogenen T-Zellen wurde berichtet, Diabetes mehrere Wochen nach der Überführung in Empfängermäuse 7,10 vermitteln. Mit der Verfügbarkeit von transgenen Mäusen, die TCRs von CD4-oder CD8-restringierte T-Zell-Klone diabetogen, mehreren Laboratorien abgeleitet wurden später gezeigt, dass Milz-T-Zellen aus diesen Mäusen in der Lage, Diabetes Empfänger 11-13 übertragen wurden. Insbesondere sind BDC2.5 NOD-Mäuse transgen für das BDC2.5 TCR, die spezifisch für Chromogranin A, ein Protein in pankreatischen beta-Zellen 14-16 ist. Übertragen von in vitro-aktivierten oder un-aktivierte ganz oder fraktionierte Milzzellen offen Diabetiker oder prediabetic BDC2.5 Mäuse übertragen Diabetes bei Neugeborenen oder immungeschwächten NOD-Mäuse in unterschiedlichen Wirkungsgrade 11,17-19. Wir beschreiben eine einfache Methode, die gereinigt transgenen CD4 + T-Zellen nutzt von Pre-diabetischen Mäusen BDC2.5 in Empfängermäuse bei hohem Wirkungsgrad und consiste T1D induzierenncy. Eine große Anzahl von naiven Insel Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus diesen Mäusen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) für CD4 + CD62L + T Zellen, die das transgene TCR Vβ4 Kette isoliert. Gereinigtes transgenen T-Zellen werden dann ohne Aktivierung in NOD.SCID Mäusen, die Funktions-T-und B-Zellen fehlt und Insulitis-und Diabetes-freie 20 übertragen. Die Empfänger-Mäuse werden für erhöhte Konzentrationen von Urin Glucose T1D anzeigt, die sich schnell entwickelt sich innerhalb von zwei Wochen nach der T-Zell-Transfer überwacht. Im Gegensatz zu anderen Methoden, die übertragen diabetogene T-Zellen mit heterogenen Besonderheiten, unser Protokoll FACS-sortierten CD4 + T-Zellen, die fast ausschließlich Ausdruck der diabetogene BDC2.5 TCR verwendet. Aufgrund ihrer Homogenität, sind nur eine kleine Anzahl von T-Zellen übertragen (~ 1x10 6 Zellen / Maus) für die schnelle Entwicklung T1D innerhalb von 2 Wochen bei 100% Inzidenz erforderlich. Ein weiterer Vorteil ist, dass unser Protokoll irradiation des Empfängers Mäusen ist nicht notwendig, da es für einige andere Methoden. Ein möglicher Nachteil dieser Methode ist, dass es nicht zulassen, die Untersuchung der Beteiligung von CD4 und CD8 T-Zell-Untergruppen oder insbesondere CD8-T-Zellen bei Diabetes. Die beschriebene Protokoll wird nützlich für die Untersuchung schneller T1D Entwicklung von naiven monospezifischen CD4 + T-Zellen, sowie therapeutische Strategien vermittelt, um in Homing von Inselzellen-Antigen-spezifische Th-Zellen in das Zielorgan eingreifen.

<table><tbody><tr><td>BDC 2.5 TCR-transgene NOD-Mäuse (NOD. Cg-Tg(Tcr&alpha; BDC 2.5, Tcr&#946; BDC 2.5)</td><td>JAX</td><td>004460</td><td></td></tr><tr><td>NOD. SCID-Mäuse (NOD. CB17-Prkdcscid/J)</td><td>JAX</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Themo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Bayer Diastix</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM2803</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konische Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Sterile chirurgische Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile kleine Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile große Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m-Zell-Siebe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; m cell Sieb Kappe Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Puffer</td><td></td><td></td><td>0,15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2 in dH2O</td></tr><tr><td>BD FACSFlowTM Mantelflüssigkeit</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACSFärbepuffer</td><td></td><td></td><td>PBS, 0,2 mM EDTA, 0,5 % BSA/FCS, Filter sterilisiert</td></tr><tr><td>Phasenkontrastmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (APC) mAb</td><td>Biolegend</td><td>1005616</td><td>Klon RM4-5</td></tr><tr><td>Anti-TCR V&#946; 4 (FITC) mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>553365</td><td>Klon KT4</td></tr><tr><td>Anti-CD62L (PE)</td><td>mAb BD Biosciences</td><td>553151</td><td>Klon MEL-14</td></tr><tr><td>Zellsortierer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>z.B. BD FACSAria III</td></tr><tr><td>Wärmelampe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus-Rückhalteapparat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritzen</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>18-1&frac12; Messnadeln (steril)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; Messnadeln (steril)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

accelerated typ 1 diabetes induktion in mäusen durch adoptiven transfer von cd4 + t diabetogene cells

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Die nonobese diabetischen (NOD) Maus spontan entwickelt Autoimmun-Diabetes nach 12 Wochen alt und ist der am intensivsten untersuchten Tiermodell der menschlichen Typ-1-Diabetes (T1D). Zelltransfer Studien in bestrahlte Mäuse Empfänger haben festgestellt, dass T-Zellen sind entscheidende in T1D Pathogenese in diesem Modell. Wir beschreiben hier ein einfaches Verfahren, um schnell durch adoptiven Transfer von gereinigtem T1D induzieren primäre CD4 + T-Zellen von Pre-diabetischen NOD-Mäusen transgen für die Insel-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) BDC2.5 in NOD.SCID Empfängermäuse. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik sind, dass Isolation und adoptiven Transfer von T-Zellen diabetogene abgeschlossen werden kann innerhalb des gleichen Tages, Bestrahlung der Empfänger nicht erforderlich ist, und eine hohe Inzidenz von T1D ist innerhalb von 2 Wochen nach entlockte T-Zell-Transfer werden. So können Untersuchungen der Pathogenese und therapeutische Interventionen in T1D mit einer schnelleren Rate als bei Methoden, die auf heterogenen T-Zell-Populationen oder Klonen verlassen gehenabgeleitet von diabetischen NOD-Mäusen.

Unsere Ergebnisse zeigen, die Isolierung von transgenen BDC2.5 exprimieren CD62L, die kritisch für die T-Zellen, nach Hause zu sekundären lymphatischen Organe wie Lymphknoten an ist. Unsere Ergebnisse zeigen weiterhin die starke Fähigkeit dieses monospezifische T-Zell-Population, um schnell und effizient zu übertragen NOD.SCID Empfängermäuse T1D. Isolierung von diabetogenen CD4 + T-Zellen von Mäusen BDC2.5 ist in Abbildung 2 dargestellt. Ungefähr 5 x 10 7 Zellen a...

Wir bieten eine reproduzierbare Methode, um Typ-1-Diabetes (T1D) bei Mäusen innerhalb von zwei Wochen zu induzieren durch den adoptiven Transfer von Insel-Antigen-spezifischen, primären CD4 + T-Zellen.

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Typ-1-Diabetes bei Mäusen rasch durch die Übertragung diabetogener T-Zellen von transgenen Mäusen in Mäuse zu induzieren, denen endogene T- und B-Zellen fehlen. Beginnen Sie damit, die Milzen und Lymphknoten von den Spendermäusen zu entnehmen und die CD4-positiven T-Zellen zu reinigen. Danach übertragen Sie die gereinigten Spender-T-Zellen adoptiv in immundefiziente Empfängermäuse.Überwachen Sie dann die Empfänger-Mäuse auf die Entwicklung einer Typ-1-Diabetes. Letztendlich kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Pathogenese des Diabetes zu untersuchen und therapeutische Interventionen im Vergleich zu anderen Methoden zu erforschen. Der Hauptvorteil dieser Technik, BDC 2.5, CD4-positive T-Zellen in nicht immundefiziente Empfänger zu übertragen, liegt in der schnellen und reproduzierbaren Entwicklung einer Typ-1-Diabetes.Für Spender der diabetogenen CD4-positiven T-Zellen verwenden Sie sechs Wochen alte prädiabetische weibliche BDC 2.5-Mäuse, bei denen durch Messung des Harnzuckers bestätigt wurde, dass sie diabetesfrei sind. Um Milz und Lymphknoten zu entnehmen, benetzen Sie das Fell mit 70 %igem Ethanol, schneiden die Haut auf und ziehen sie zurück, bis die Muskulatur der Vordergliedmaßen freigelegt ist. In der Nähe der Basis der Vordergliedmaßen sollten auf jeder Seite zwei Lymphknoten sichtbar sein. Greifen Sie jeden Lymphknoten vorsichtig mit einer kleinen Pinzette und entfernen Sie ihn, indem Sie das umgebende Bindegewebe abschneiden.Als Nächstes einen etwa einen Zoll langen Einschnitt im Peritoneum mit der kleinen Schere anlegen. Nun die Milz in der Mitte vorsichtig fassen. Vorsichtig das Bindegewebe und das anhängende Fett abschneiden.Entfernen Sie dann die Milz, die Bauchdecke sowie die Milzen und Lymphknoten in 10 Milliliter DMEM auf Eis. Drücken Sie mit dem Ende eines sterilen 10-Milliliter-Spritzenstempels die lymphatischen Organe vorsichtig durch einen 70-Mikrometer-Zellfilter, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.Spülen Sie jeden Sieb mit einem Milliliter DMEM mehrmals, um die maximale Wiedergewinnung der Zellen zu erreichen. Überführen Sie anschließend die gesammelten Zellen in ein 15-Milliliter-Konischglas und zentrifugieren Sie sie sieben Minuten lang bei 400 Gs. Suspenderen Sie das Zellpellet bei Raumtemperatur in drei Milliliter eines CK-Puffers. Jetzt jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Um die roten Blutkörperchen aufzulösen, 12 Milliliter DMEM zugeben und die Zellen durch Zentrifugation pelletieren. Den Zellpellet einmal mit 10 Milliliter DMEM waschen.Als Nächstes suspendieren wir die Zellen in fünf Milliliter FACS-Puffer und zählen die Anzahl vitaler Zellen mit einem Phasenkontrastmikroskop und einem Hämozytometer. Entnehmen Sie nun etwa 1 × 10⁶ Zellen pro Färbekontrolle. Färben Sie die Zellen außerdem mit maus-spezifischen monoklonalen Antikörpern, um nichtaktivierte transgene CD4-positive T-Zellen zu sortieren.Inkubieren Sie alle Proben 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen anschließend dreimal mit dem dreifachen Volumen des Färbepuffers (Fax-Puffer) und resuspendieren Sie die Zellen in Fax-Puffer bei einer Konzentration von ein bis zwei mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter für die Sortierprobe und 300 Mikroliter für die Einzelfärbekontrollen. Danach leiten Sie die Zellprobe durch ein Zellfilterröhrchen mit 35-Mikrometer-Filter.Um Zellklumpen zu entfernen, bearbeiten Sie die Proben mit einem geschulten Bediener für einen Zellsorter. Planen Sie etwa drei Stunden einschließlich der Einrichtungszeit ein, um etwa 1,5 × 10⁸ transgene naive CD4-positive T-Zellen zu sortieren. Pro Maus können Sie etwa 2,5 × 10⁶ Zellen erwarten, und die Sortiergeschwindigkeit wird auf einem Gerät wie dem BD FACS Aria etwa 2 × 10⁴ Ereignisse pro Sekunde betragen. Sammeln Sie die sortierten Zellen in drei Milliliter DMEM.Notieren Sie die absolute Anzahl der sortierten Zellen und zentrifugieren Sie diese sieben Minuten lang. Bei 400 G suspendieren wir die Zellpellets zur adoptiven T-Zell-Übertragung in sterilem, phosphatgepuffertem Kochsalzlösung. Lösen Sie die faxgereinigten CD-vier-positiven T-Zellen vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel auf.Befüllen Sie die Ein-Milliliter-Spritze und setzen Sie zur Vorbereitung auf die Injektion eine Nadel mit 27 Gauge und einer halben Zoll Länge auf die Spritze auf. Fixieren Sie die empfangenden Knoten-Skid-Mäuse und desinfizieren Sie deren Schwanz durch Abwischen mit 70 %igem Ethanol. Injizieren Sie anschließend je Maus 1 × 10⁶ aufgereinigte CD4-positive T-Zellen in eine der seitlichen Schwanzvenen.Bei der Injektion in die Schwanzvene sollten Sie den Kolben nicht gewaltsam betätigen. Wenn die Nadel tatsächlich in der Vene sitzt, sollte die Injektion nahezu widerstandsfrei erfolgen. Beginnen Sie fünf Tage nach der T-Zell-Übertragung, die empfänglichen Nacktmäuse täglich auf die Entwicklung eines Typ-1-Diabetes zu überwachen.Messen Sie die Glukosekonzentration im Urin mithilfe von Reagenzstreifen gemäß den Herstelleranweisungen. Beachten Sie, dass Mäuse mit zwei aufeinanderfolgenden Urin-Glukosewerten von mehr als 250 Milligramm pro Deziliter als diabetisch gelten. In einem typischen Experiment liefert jeder BDC 2.5-Donormaus nach der Zellsortierung etwa zweieinhalbmal 10⁶ naive transgene CD4-positive T-Zellen. Nach der adoptiven Übertragung diabetogener CD4-positiver T-Zellen wurden die Mäuse auf die Glukosekonzentration im Urin überwacht.Die adoptive Übertragung geringer Zellzahlen von BDC 2.5-Donormäusen verursachte bei allen nicht-skiddeten Empfängern bis zum 11. Tag Typ-1-Diabetes. Bei korrekter Durchführung kann diese Technik innerhalb von etwa acht Stunden von der Organentnahme bis zur T-Zell-Übertragung durchgeführt werden.

accelerated-type-1-diabetes-induction-mice-adoptive-transfer

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Unser Protokoll wurde entwickelt, um sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel von Mäusen. Die Zellen werden zu Pellets in den letzten Schlauch für die Transplantation der Zellen unter die Nierenkapsel verwendet konzentriert. Die Leichtigkeit dieser Technik reduziert den Stress auf die Zellen und der Maus.

Transplantation von Pankreas-Inseln in die Niere Capsule von diabetischen Mäusen

Wir beschreiben hepatische neo-Inselzellen Formation in STZ (Streptozotocin)-induzierte diabetische Mäuse durch Gentransfer von Neurogenin3 (Ngn3) und Betacellulin (BTC) Verwendung von Helfer-abhängigen Adenovirus-Vektor (HDAd) und der Umkehrung von Hyperglykämie. Unsere Methode nutzt die Vorteile von Helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren mit ihren hocheffizienten in vivo Transduktion und der lang anhaltende Genexpression.

Neo-Islet Formation in Leber der diabetischen Mäuse von Helper-abhängigen Adenovirus-Vektor-vermittelten Gentransfer

Dieses Video demonstriert eine bildgebende Methode zur Visualisierung transplantierter Luciferase-exprimierender Betazellen in einer nicht adipösen diabetischen immundefizienten Maus. Die Einführung von Splenozyten aus einer diabetischen Maus führt zu einer fortschreitenden Zerstörung der Betazelle, die visuell durch eine abnehmende Lumineszenz nach Substrateinführung bestätigt wird.

Bildgebung transgener Betazellen in einer immundefizienten Maus, die mit diabetischen Splenozyten konfrontiert war

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion von Dickdarmentzündungen bei Mäusen durch adoptiven Transfer von syngenen CD4+CD45RBhohen T-Zellen in T- und B-Zell-defiziente Empfänger. Klinische und histopathologische Merkmale ahmen entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen nach. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Beginns von Dickdarmentzündungen und des Fortschreitens der Krankheit.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Wir beschreiben ein in vivo Immunisierungs-, translationales Hepatitis-Modell bei BALB / c-Mäusen, das verwendet werden kann, um die Pathogenese der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis einschließlich der bei dieser Krankheit beobachteten Geschlechtsunterschiede zu untersuchen. Wir werden beschreiben, wie dieses Modell reproduzierbare Analysen mit experimentellen In-vivo- und In-vitro-Techniken demonstriert.

Induktion der medikamenteninduzierten Autoimmunhepatitis bei BALB/c-Mäusen zur Untersuchung ihrer pathogenen Mechanismen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von antigenspezifischen CD8-T-Zellen und deren Ausdehnung in vitro mit dem Ziel, eine hohe Anzahl funktioneller T-Zellen für den Einsatz in vitro und in vivo zu liefern.

Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell

In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.

Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse

Dieses Protokoll beschreibt eine unkomplizierte und minimalinvasive Methode zur Transplantation und Bildgebung von NIT-1-Zellen in nicht-adipösen diabetischen (NOD)-schweren kombinierten immundefizienten Mäusen, die mit Splenozyten konfrontiert wurden, die von spontan diabetischen NOD-Mäusen gereinigt wurden.

Biolumineszentes Monitoring des Transplantatüberlebens in einem adoptiven Transfermodell des Autoimmundiabetes bei Mäusen

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Lernen Sie die adoptive Übertragung diabetogener CD4+ T-Zellen zur schnellen Induktion von Typ-1-Diabetes in Mäusen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Studien zur Diabetes-Pathogenese.

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

Weitere Videos entdecken