Name: 표적으로 바이러스 성 단백질의 분석은 HER2 + 종양에 전달 나노 입자 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 학습하세요 종양 표적 나노입자 HerDox의 다중 광학 영상 분석 방법을 통해 생체 내 전달 및 종양 침투를 정량화하는 기술입니다. 이 방법은 표적 암 치료제 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 건강 / 국립 암 연구소 (R01CA129822 및 R01CA140995)의 국립 연구소에서 LKM-K에 교부금에 의해 투자되었다. 박사 메디나 Kauwe 지속적인 지원을 위해 C. 레이, M. M-Kauwe 및 D. Revetto을 감사드립니다.

1. 생체 조직 배달 <ol><li> 6-8 주 이전 NU / NU 마우스 베어링 피하 양측 측면 이종 이식 종양에 대한 주입 당 HerDox의 0.004 ㎎ / ㎏ 용량의 0.2 ML를 동일시하는 멸균 식염수로 충분히 HerDox 섞는다. </li><li> 부드럽게 거품을 피하고, 29G 바늘로 장착 3 / 10 cc의 인슐린 주사기에 HerDox 혼합물을 그립니다. </li><li> 0.5 L / 분, isoflurane을 농도 : 3~4% (또는 이하) 마취 가스 청소 시스템 (산소 유량을 갖춘 유도 챔버에 짧은 isoflurane을 노출에 의해 유도된다. </li><li> 마취 마우스 (주입 당 0.2 ML)의 꼬리 정맥에 전체 혼합물을 주입한다. IV 주입은 또한 제지, unanesthetized 마우스를 수행 할 수 있습니다. </li><li> 하루에 한 번, 여섯 개의 연속 일 같은 마우스 주사를 반복합니다. </li></ol> 2. 생체 내 형광 이미징 종양 HerDox 형광의 축적 할 수멀티 영상을 사용하여 주입의 마지막 날 (7 일)에 의해 탐지 가능한 수. 아래 절차에서는 사용자 정의 매크로 조명 및 탐지 시스템 (그림 1) 8의 사용을 수반. <ol><li> 생체 광학 영상에서 다중 모드를 켭니다. </li><li> doxorubicin의 형광 검출에 적합 방출 대역 통과 필터 (590 nm의 ± 30 nm의)를 선택합니다. </li><li> 아르곤 - 크립톤 레이저를 켜고 레이저 광 경로에 여기 대역 통과 필터 (488 nm의 ± 10 nm의)를 배치합니다. </li><li> 마취 시스템을 켠 후 마취 챔버 (산소 유량에 마우스를 올려 : 0.5 L / 분, isoflurane을 농도 : 3-4% (또는 이하) 가스 청소 시스템을 갖추고 있습니다. </li><li> 마취 챔버에서 마우스를 마취입니다 생체 광학 영상에서 다중의 이미징 챔버에 마우스를 전송합니다. </li><li> 마우스의 코를 통해 노즈콘를 배치하고 지속적인 마취를 관리하는 흐름을 엽니 다영상 획득시 SIA (산소 유량 : 0.5 L / 분, isoflurane을 농도 : 2~3% (또는 이하). </li><li> 15 초 노출 시간을 사용하여 형광 이미지를 획득. </li><li> 배경 정정 또는 대비 조정 등의 이미지 분석 및 처리를 수행합니다. </li></ol> 3. 형광 이미징 생체 HerDox 형광 종양 특정 기관에 군데 할 수 있습니다 (간을 포함, 신장, 비장, 심장과 골격 근육) HerDox의 마지막 (7 일) 주사 후 24 시간에서 안락사 생쥐에서 수확. <ol><li> 생체 광학 영상에서 다중 모드를 켭니다. </li><li> 독소루비신 형광 검출을위한 방출 대역 통과 필터 (580 nm의 ± 20 nm의)를 선택합니다. </li><li> 아르곤 - 크립톤 레이저를 켜고 레이저 광 경로에 여기 대역 통과 필터 (488 nm의 ± 10 nm의)를 배치합니다. </li><li> 장소 종양과 특정 장기 이미징 챔버 오에 페트리 접시에 배치F 생체 광학 영상에서 다중. </li><li> 15 초 노출 시간을 사용하여 조직의 형광 이미지를 획득. 초기 형광 이미지 획득의 예는 그림 2a에 표시됩니다. 배경 (그림 2B)로 제공되는, 페트리 접시 빈을 사용하여 동일한 작업을 반복합니다. </li><li> 배경 정정 또는 대비 조정 등의 이미지 분석 및 처리를 수행합니다. 수정 된 이미지의 예는 그림 2a에서 그림 2B의 뺄셈의 결과, 그림 2C에 표시됩니다. </li></ol> 4. 종양의 현장 공 촛점 이미징 현장 공 촛점 이미징 세포 수준에서 탐지 및 HerDox 종양 축적 분석 할 수 있습니다. <ol><li> 라이카 SPE 공 촛점 현미경을 켭니다. </li><li> 독소루비신에 대한 독소루비신 및 배출 파장 (560-620 nm의)에 여기에 대한 488 nm의 레이저 광을 선택형광 검출. </li><li> 대물 렌즈 40X 또는 63X 목적 및 드롭 침수 오일을 선택합니다. </li><li> 절차 2에서 설명한대로 이전 HerDox 및 모의 치료를받은 안락사 생쥐에서 신선한 종양을 추출합니다. </li><li> 얼음에 페트리 접시에 장소 종양 조직의 저하를 방지하고 공 촛점 이미징을위한 델타 T 챔버에 종양을 전송합니다. </li><li> 연속 초점 깊이 (: 1 ㎛, 두께 : 20 μm의 스텝 크기)에서 종양의 공 촛점 이미지를 획득. Z-축을 따라 순차적으로 획득 한 이미지의 예는 그림 3의 왼쪽 패널에 표시됩니다. </li><li> 최대 강도 이미지의 Z - 프로젝션을 수행합니다. Z-스택 이미지의 최대 강도 투사는 그림 3, 오른쪽 패널에 표시됩니다. </li><li> . 최대 강도의 형광 강도 Z 의미 계산 -보기의 전체 필드에 이미지의 형광 강도를 평균 투사 이미지는 계산 하였다D ImageJ에 사용. </li></ol> 5. 비례 스펙트럼 이미징 및 분석 비례 스펙트럼 이미징 및 분석 독스 형광자가 형광 사이의 차별을 할 수 있습니다. <ol><li> 형광 공 촛점 현미경 스캐닝 레이저의 전원을 켭니다. </li><li> 단계 10 나노 미터의 크기, 라이카 SPE 공 촛점 현미경을 사용하여 488 nm의 빛을 여기에, 510-650 ㎚의 스펙트럼 범위 내에서 지정된 깊이에서 HerDox 처리 및 치료 종양의 15 이미지를 획득. </li><li> 독소루비신의 100 μM 솔루션을 준비합니다. </li><li> 독스 형광 (: 510-650 nm의 스텝 크기 : 10 nm의 스펙트럼 범위)의 순수한 스펙트럼 서명을 얻기 위해 100 μM의 독소루비신 솔루션의 스펙트럼 이미징을 수행합니다. 그래프가 그림 4에 표시된대로 분광 이미징 및 형광 스펙트럼 결과에서 이미지 수집의 전형적인 결과를 꾸몄다. </li><li> 이미지 C에서자가 형광 스펙트럼 서명을 취득우베 (스펙트럼 범위 : 510-650 nm의 스텝 크기 : 10 nm의) 치료 종양의 스펙트럼 영상으로 얻었다. 그래프가 그림 5에 표시된대로 분광 이미징 및 형광 스펙트럼 결과에서 이미지 수집의 전형적인 결과를 꾸몄다. </li><li> 우리는 9 개발 프로그램을 사용하여 4 개의 기준 스펙트럼 서명 (순수자가 형광, 0.1.doxorubin +0.9.자가 형광, 0.2. 독소루비신 +0.8.자가 형광, 0.3.doxorubin +0.7.자가 형광) 생성합니다. 4 개의 기준 스펙트럼 특성을 보여주는 전형적인 곡선은 그림 6에 나와 있습니다. </li><li> 우리가 이전 9 개발 한 프로그램을 사용하여 유클리드 거리 측정을 통해 참조 스펙트럼 서명에 의해 정의 된 이미지의 스펙트럼 분류를 수행합니다. </li><li> 비례 스펙트럼 이미징 및 분석 비교를 위해 우리가 7을 개발 스펙트럼 unmixing 프로그램 (ImageJ에 플러그 - 인), 10를 사용하여 해당 이미지의 선형 스펙트럼 unmixing을 수행합니다. 전자선형 스펙트럼 unmixing하여자가 형광에서 HerDox 형광을 분리 xample는 그림 7에 나와 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Agadjanian, H., Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Targeting+by+DNA+Capture+in+Viral+Protein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles.</a> Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).</li>
<li>Agadjanian, H., Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+detection+and+elimination+by+a+targeted+gallium+corrole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).</li>
<li>Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+delivery+of+corroles+to+cells+via+noncovalent+conjugates+with+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins.</a> Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).</li>
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<li>Hwang, J. Y., Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+Imaging+In+vivo+for+Preclinical+Assessment+of+Tumor-Targeted+Doxorubicin+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles.</a> PLoS ONE. 7 (4), e34463(2012).</li>
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<li>Ducros, M., Moreaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+unmixing%3A+analysis+of+performance+in+the+olfactory+bulb+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), e4418(2009).</li>
<li>Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+unmixing+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).</li>
</ol>

저자 다니엘 Farkas의는 스펙트럼 분자 영상의 회장이다. 나머지 저자는 더 경쟁 이익이 없습니다.

DOX 형광 종양이 피하 때 멀티 영상을 이용하여 생체 내에서 탐지 가능한 할 수 있습니다. 그러나 HerDox의 치료 적 용량 (0.004 ㎎ / ㎏)의 단일 복용 후 아래의 감지 임계 값입니다. 반면, 7 매일 주사 (7 일 1x/day) 후, 입자의 종양의 축적과 보존 Dox가 형광의 시각화를 가능하게하기에 충분합니다. 독스 또는 클린 기술이 사용되는 생체 내 이미징을위한 다른 형광 물질로 작업 할 때 매우 중요합니다. 영상은 Dox가 외부 또는 내부 있는지 여부를 차별하지 않고 피부의 바깥에 형광을 감지하므로 마우스의 외부에 드립은 피해야한다. 마찬가지로, 장갑 독스 오염함으로써 잘못된 형광 검출의 원인, 동물 처리하는 동안 마우스의 외부에 형광 자국을 남길 수 있습니다. 멀티 모드 광 시스템,레이저 빔은 HerDox의 자극을 위해 사용됩니다. 레이저 빔은 일반적으로 가우시안 프로파일을...

종양 표적 항암 화학 요법의 것이 전달되는 치료보다 오히려 비 종양 조직에 배포하는 것보다 의도 한 대상에 축적 할 수 있기 때문에 타겟이 불분명 한 약물에 비해 낮은 복용량에서 암 세포를 제거하는 잠재력을 가지고있다. 후자의 상황이 약물의 효능을 희석하기 때문에 과다 복용 효과가 필요 하듯이, 종양 타겟팅 표준 비 표적 치료를 통해 모두 치료 및 안전 이점이있다. 자기 조립 나노 입자에 캡슐화 화학 요법을 표적으로하는 약물이 화학적으로 공유 결합 대상 분자에 연결되어있는 약물과는 대조적으로 변경되지 않은 상태를 유지할 수 있습니다. 이러한 결합은 약물과 표적 분자 모두의 활동을 변경할 가능성이 있기 때문에, 비공유 어셈블리 약물 효능을 유지 할 수 있습니다. 우리는 이전에 소설은 세 가지 구성 요소, 자기 조립 복잡한 HerDox는 HER2 + 종양을 대상으로하는 것으로 나타났습니다 <em&gt; 생체 및 심장 1 등, 정상 조직을 살려주는 동안 종양의 성장 절제를 이끌어. HerDox이 수용체 결합 세포 침투 단백질, HerPBK10 및 화학 요법 에이전트 사이의 비공유 상호 작용을 통해 형성되고, 작은 핵산 링커를 통해 독소루비신 (독스). endosomal 막 침투가 아데노 바이러스 파생 penton 기본 캡시드 단백질 4-6의 결합을 통해 수행되는 동안 HerPBK10는, 인간 표피 성장 인자 수용체 (HER) 바인딩 2-4 수용체 매개 세포 내 이입을 트리거합니다. 단백질의 양전하 도메인 핵산에게 DNA-협재 독스가 타겟 배달을 위해 운송 할 수있는을 통해 바인딩 4, 5를 할 수 있습니다. 전자 성, 윤달, 그리고 아마도 단백질 올리고머의 상호 작용은 서로 다른 온도 1에 혈액 및 확장 보관하는 안정 라운드 10-20 nm의 입자로 자기 조립을 용이하게합니다. 우선 그녀에게 대상HER2가 상승 할 때 2 + 종양 세포는 강화 된 리간드 친화력에 의해 촉진된다. 우리의 이전 연구는 비 종양 조직에 종양과 비교 HerDox 금리 우대 체계적 축적 배달 생체 내 7에있는 종양 세포에 독스 1 및 침투 불분명하는 것으로 나타났습니다. 우리가 관찰 한 종양 세포 기입 한 후 HerDox 릴리스는 독스, 핵 1에 독스 축적을 허용. 종양의 축적은 상대적으로 낮은 HER2 발현 종양이 비교적 높은 HER2 레벨 1에 비해 적은 HerDox 축적으로, 수용체 수준과 상관 관계가 나타납니다. 또한, 효과적인 세포 사멸 농도는 다른 세포 표면에게 HER2 레벨 1을 표현하는 종양 세포 라인에서 HER2 디스플레이와 역 상관 관계를 나타낸다. 종양 살해 10 배 낮은 복용량 이상에서 발생으로 HerDox의 압축을 풉니에 비해 불분명 독스를 통해 치료 및 안전 이점을 전시geted 약물과 타겟이 불분명 독스 1 대조적으로, 심장 (심장 초음파 검사 및 조직 학적 염색에서 감지) 또는 간 (얼룩 TUNEL에 의해 감지) 조직에는 감지 악영향을 얻을 수 없습니다. 바이러스 캡시드 단백질로부터 유도에도 불구하고, HerPBK10는 치료 수준이 전혀 검출 면역 원성을 전시하지 않습니다. 전체 아데노 바이러스에 기존의 항체가 HerPBK10을 인식 할 수있는 반면, 그들은 2 바인딩 셀을 방지 할 수 없습니다. 시간이 지남에 따라 측정 된 종양의 부피는 표적 치료제의 치료 효과를 평가하는 표준 방법이며, HerDox의 치료 효능을 평가하기 위해 고용되었다. 생체 내 및 생체 형광 강도 이미징에이 방법을 보완하면 더 나은 효율성 7을 대상으로 평가하기 위해 우리를 허용했다. 우리는 특히 그 HerDox 전혀 확인하지 않도록 Dox가 형광 스펙트럼 분석을 절제 종양의 현장 공 촛점 이미징 통합했습니다T는 생체 내 종양에 축적하지만, 세포질 및 핵 7에 종양 세포와 전달 독스에 침투. 스펙트럼 분석은 또한 우리가자가 형광 7에서 독스 형광을 구별 할 수있었습니다. 여기에서 우리는 조직 배달 후 생체 내에서 HerDox을 평가 자세하게 우리의 접근 방식을 보여, 그리고 가장 중요한, 평가하기위한 멀티 이미징 방법과 분석을 통해 대상.

<table><tbody><tr><td>형광 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>SPE</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo 광학 이미저</td><td>스펙트럼 분자 이미징</td><td>멀티모드 In Vivo 광학 이미저</td><td></td></tr><tr><td>독소루비신-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4035</td><td></td></tr><tr><td>누드(NU/NU) 마우스, 암컷, 6-8주</td><td>Charles River</td><td>스트레인 코드 088</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-435 인간 HER2+ 종양 세포</td><td>NCI-Frederick Cancer DCTD 종양/세포주 저장소</td><td>0507292</td><td></td></tr><tr><td>3/10cc 인슐린 주사기 U-100(29G x 1/2" Ultra-FineIV 영구 부착 바늘</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Delta T 챔버 </td><td>포함) Bioptechs</td><td>04200417B</td><td></td></tr></tbody></table>

표적으로 바이러스 성 단백질의 분석은 her2 + 종양에 전달 나노 입자

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

HER2 + 종양 표적 나노 입자, HerDox는 HER2 + 암 동물 모델에서 종양 특혜 축적과 종양 성장 절제를 전시하고 있습니다. HerDox가 작은 핵산 링커를 통해, 화학 요법 제, 독소루비신과 종양 표적 세포 침투 단백질의 비공유 자기 조립에 의해 형성된다. 전자 성, 층간 및 올리고머 상호 작용의 조합은 라운드 10-20 nm의 입자로 자기 조립을 용이하게합니다. HerDox 서로 다른 온도에서 혈액뿐만 아니라, 확장 된 스토리지 안정성을 전시한다. 심장과 간 (타겟이 불분명 한 독소루비신에 의한 표시 손상을 받아야 함) 등의 비 종양 조직에 탐지되지 않는 부작용을 가진 종양 세포 죽음 종양 베어링 마우스 결과에 HerDox의 전신 배달. HER2 고도 세포 발현에 비해 따라서 높은 HER2 수준을 표시하는 종양이 HerDox의 큰 축적을 전시, 인간 표피 성장 인자 수용체를 발현하는 세포를 표적으로 용이in vitro와 in vivo에서 모두 낮은 수준을 노래. 현장 공 초점 및 스펙트럼 분석과 결합 된 형광 강도 영상은 우리가 대상으로 생체 내 종양 조직 출산 후 HerDox의 종양 세포의 침투에 확인 할 수있다. 조직 배달 후 멀티 영상을 통해 표적 종양을 평가하는 여기에 우리가 세부 사항 우리의 방법을.

그림 1은 형광 강도, 스펙트럼, 수명 2 - 광자, 내 생명 공 초점 및 생물 발광 영상 등 여러 양식에 따라 이미지 수집의 목적을 위해 만들어진 생체 광학 영상 프로토 타입에서 보여줍니다. 또한,이 시스템에 통합 냉각 고감도 카메라와 고성능 레이저 라인은 특히 독소루비신 형광의 생체 검출을위한 상용 광학 이미징 시스템 11에 비해 높은 반면 형광 이미지를 얻을 수 있습니다. 따라서,이 시스템은 생체 내에서 HerDox의 평가에서 여러 보완적인 데이터 포인트를 얻기 위해 본 연구에 사용 중요했습니다. 그림 2에서와 같이 높은 종양 형광 HerDox의 전신 배달 후 일반적으로, 그것의 종양 우선적으로 타겟팅 나타내는 것입니다. 골격 근육에서 발견 형광 비정형하고 이리저리 발생할 수 있습니다주입 절차 미터 이상 (즉, ...

이 문서 상세 종양 표적 나노 입자, HerDox의 광학 영상 분석을위한 절차에 대해 설명합니다. 특히, 표적 종양 침투를 평가 종양 검출을위한 멀티 이미징 장치에 대한 자세한 사용은 여기에 설명되어 있습니다.

표적으로 바이러스 성 단백질의 분석은 HER2 + 종양에 전달 나노 입자

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

본 실험 절차의 전체적인 목적은 멀티모드 광학 이미징을 통해 종양 표적 나노입자인 HeroX의 체내 시스템 전달을 검출하고 분석하는 것입니다. 먼저, 종양이 형성된 마우스의 꼬리 정맥에 나노입자를 주입하고 멀티모드 광학 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미지를 획득합니다. 안락사 후, 종양과 장기를 적출하여 다시 이미징함으로써 종양 세포 내의 형광 입자를 검출합니다.이후 인시튜(in situ) 공초점 이미징을 수행합니다. 결과 이미지 분석을 통해 전신 투여 후 종양 내로의 표적화 및 침투가 정량화 가능함을 확인할 수 있습니다. 단일 이미징 모드와 같은 기존 기술 대비 다중 모드 이미징 기술이 갖는 주요 장점은 종양 전달의 분석과 정량화를 향상시킬 수 있는 다양하고 상호 보완적인 정보를 제공한다는 점입니다.이 방법은 표적 약물이 종양으로 전달될 뿐만 아니라 실제로 종양 세포 내로 침투하는지 여부와 같이 약물 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 제 실험실의 전 박사후 연구원인 Dr.J Yun Wang과 현재 대학원생인 Janet Markman이 절차를 시연하겠습니다. 6~8주령.양측 옆구리에 피하 이식 Xenograft 종양을 가진 새로운 마우스들을 사용합니다. 주사 1회당 HeroX 0.004 mg/kg 용량에 해당하는 0.2 mL가 되도록 충분한 양의 HeroX를 멸균 식염수에 혼합하여 전신 투여를 준비합니다. 29G 바늘이 장착된 0.3 cc 인슐린 주사기로 HeroX 혼합액 0.2 mL를 조심스럽게 흡입합니다.마취 후 기포가 없는지 주의 깊게 확인하십시오. 주사 후 혼합액 전체를 꼬리 정맥에 주입합니다. 주사 부위에서 혈액이 손실되지 않도록 꼬리를 집어 고정하십시오.출혈이 멈춘 후, 멸균 면봉으로 주사 부위를 닦아내고 쥐를 케이지로 돌려보냅니다. 동일한 쥐에게 6일 동안 연속적으로 주사를 반복합니다. 하루에 한 번씩, 마지막 주사일까지 종양 내 HeroX 형광의 축적을 검출할 수 있습니다.7일 차에는 멀티모드 이미저(multi-mode imager)를 사용합니다. 여기에서의 절차는 형광 강도, 스펙트럼 형광, 수명 및 생체 내 공초점 이미징 능력을 갖춘 광학 이미징 시스템을 활용합니다. 여기에 표시된 것은 생체 내 광학 이미저 프로토타입입니다.이 시스템에 통합된 냉각식 고감도 카메라와 고출력 레이저 라인은 상용 광학 이미징 시스템과 비교하여 더 높은 대조도의 형광 이미지를 제공하며, 특히 doxorubicin 형광의 생체 내(in vivo) 검출에 탁월합니다. 소프트웨어에서 멀티모드 생체 내 광학 이미저(multimode in vivo optical imager) 기능을 켭니다. doxorubicin 형광 검출에 적합한 방출 밴드패스 필터를 선택하십시오.레이저를 켜고 레이저 광 경로에 흥분 밴드 패스 필터를 배치합니다. 마취 챔버에서 이소플루란으로 마우스를 마취시킨 후, 멀티모드 인비보 광학 이미저의 이미징 챔버로 옮깁니다. 마우스의 코에 노즈콘을 씌우고 유량을 조절하여 지속적으로 마취제를 투여합니다.이미지 획득 단계에서 5~15초의 노출 시간을 사용하여 형광 이미지를 획득하십시오. 최종 주사일 24시간 후 안락사시킨 마우스에서 적출한 종양 및 간, 신장, 비장, 심장, 골격근을 포함한 특정 장기에서 형광 이미지를 촬영할 수 있습니다. 다모드 생체 내 광학 이미징 장치를 켜십시오.이전과 같이, 종양과 특정 장기들을 페트리 접시에 배치합니다. 멀티모드 생체 내(in vivo) 광학 이미저의 이미징 챔버 내에서 5~15초의 노출 시간을 사용하여 조직의 형광 이미지를 획득합니다. 그런 다음, 빈 페트리 접시를 사용하여 동일한 이미지 획득 과정을 반복하며, 이는 획득 후 배경(background)으로 사용됩니다.배경 보정 또는 대비 조정을 포함한 이미지 분석 및 처리를 수행합니다. 인시튜(In situ) 공초점 이미징을 통해 세포 수준에서 herd herd의 종양 축적을 검출하고 분석할 수 있습니다. 공초점 현미경을 사용하십시오.doxorubicin의 여기를 위해 488 nanometer 레이저 광을 선택하고, 방출 파장은 560 nanometer에서 620 nanometer 사이로 설정하십시오. doxorubicin 형광 검출을 위해 40 x 또는 63 x 대물렌즈를 선택하고 그 위에 이머전 오일을 한 방울 떨어뜨립니다. 조직 분해를 방지하기 위해 안락사시킨 마우스에서 적출한 종양을 페트리 접시에 놓으십시오.그다음 종양을 공초점 이미지 촬영을 위해 delta T 챔버로 옮깁니다. 1 µm의 단계 크기와 20 µm의 두께로 연속적인 초점 깊이에서 종양의 공초점 이미지를 획득합니다. Z축을 따라 순차적으로 획득한 이미지의 예가 여기에 표시되어 있습니다.이미지의 최대 강도 Z 투영(maximum intensity Z projections)을 생성합니다. 그다음 ImageJ 또는 유사한 프로그램을 사용하여, 전체 시야 비율에 대한 최대 강도 Z 투영 이미지의 평균 형광 강도를 계산합니다. 메트릭 스펙트럼 이미징 및 분석을 통해 독소루비신(doxorubicin), 형광 및 자가형광을 구분할 수 있습니다.Leica SPE 공초점 현미경을 사용하여, 488 nm 광원으로 여기시키고 510~650 nm의 스펙트럼 범위 내에서 10 nm 단계 크기로 HeroX 처리 및 미처리 종양의 특정 깊이에서 15장의 이미지를 획득합니다. 다음으로, 생리식염수로 100 µM doxorubicin 용액을 준비합니다. 준비된 100 µM doxorubicin 용액의 스펙트럼 이미징을 수행합니다.독소루비신 형광의 순수 스펙트럼 시그니처를 얻기 위해, 처리되지 않은 종양을 촬영하여 이미지 큐브로부터 자가형광 스펙트럼 시그니처를 획득합니다. 모든 데이터 수집이 완료되면, 참조 스펙트럼 시그니처를 생성하고 이미지의 스펙트럼 분류를 수행하며, 해당 이미지들의 선형 스펙트럼 언믹싱을 수행하여 종양 내 독소루비신 축적량에 대한 정량적 평가를 얻습니다.다양한 초점 깊이에서 in situ 공초점 형광 이미지를 얻은 후, 이미지의 최대 강도 Z 투영(maximum intensity Z projection)을 수행하고 투영된 이미지의 평균 형광 강도를 획득하였습니다. 이 이미지에서 나타나는 높은 종양 형광은 her docs의 전신 투여 후 전형적으로 관찰되며, 이는 종양 선택적 표적 능력을 나타냅니다. 골격근에서 검출된 형광은 비전형적인 결과이며, 이는 주입 과정의 이상으로 인해 발생했을 수 있습니다.정성적으로 볼 때, 이 이미지는 배경 신호가 낮습니다. 정량 분석을 위해 여기에서 보여주는 것과 같이 빈 디쉬를 사용하여 배경 보정을 수행합니다. 배경 이미지의 가장자리 강도가 더 낮기 때문에, 결과적으로 배경 보정된 이미지는 원본에 비해 이미지 가장자리의 배경 신호가 더 높게 나타납니다.왼쪽에 표시된 적층 이미지들은 1 µm 간격의 순차적 깊이에서 얻은 종양 조직의 공초점 스캔을 대표합니다. 오른쪽 이미지는 왼쪽의 적층 이미지들을 종합한 결과입니다. 종합 이미지의 모든 픽셀에는 지정된 Z 깊이에 따른 HeroX 축적 정보가 포함되어 있으며, 따라서 형광 강도의 평균값은 서로 다른 깊이에 있는 종양 내 전체적인 herd doc 축적량을 정량적으로 반영합니다.종양 내 herd doc의 형광을 자가형광과 구별하고, 높은 특이도 비율 지표로 두 가지를 정량적으로 판별하기 위해 분광 이미징 및 분석을 수행합니다. 이 이미지는 독소루비신(doxorubicin)의 순수 분광 서명(spectral signatures)을 보여줍니다.표시된 방출 파장에서 구획된 점선 영역의 형광 강도는 510에서 650 nanometer 파장 스펙트럼에 걸친 doxorubicin의 프로파일을 보여주는 히스토그램을 생성합니다. 여기에서는 자가형광의 순수 스펙트럼 시그니처가 표시되어 있습니다. 표시된 방출 파장에서 처리되지 않은 종양으로부터 방출된 형광은 자가형광 방출 프로파일을 나타내는 기울기를 생성합니다.참고문헌.순수 스펙트럼 시그니처를 다양한 비율로 혼합하여 스펙트럼 시그니처를 생성했습니다. 해당 프로그램을 사용하여 각 참조 표준을 개발했습니다. 여기서 스펙트럼 시그니처는 자가형광 대비 종양에 축적된 her docks의 상대적 형광을 나타냅니다.독(dock)과 자가 형광의 스펙트럼 시그니처를 얻은 후, 선형 스펙트럼 언믹싱(linear spectral unmixing)을 사용하여 독 신호를 분리합니다. 그림은 스펙트럼 언믹싱 전의 자가 형광과 독이 혼합된 이미지와, 스펙트럼 언믹싱 후 분리된 독 이미지를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 형광 강도, 공초점 현미경, 스펙트럼 이미징 양상을 결합하여 종양 전달의 분석 및 정량화를 향상시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.doxorubicin을 사용하는 작업은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 이중 장갑 착용 및 빈번한 장갑 교체와 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 조류 배아 모델 동적, 실시간 intravital 이미지를 사용하여 인간의 xenografted 종양의 vasculature에 nanoparticle의 국제화를 수치 소설 접근법을 제시한다.

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

polymalic 산계 나노 약물의 예는 암에 적용 가능하다 맞춤 의학의 합리적인 디자인으로 제시된다. 그것은 누드 마우스에 HER2가 긍정적 인간 유방암을 치료하는 나노 약물의 합성을 설명한다.

여러 종양 마커의 대상으로하기위한 Polymalic 산 기반의 나노 생물 고분자 물질 : 개인화 된 약을위한 기회?

여기에, 우리는 강한 자기 모멘트 강한 근적외선 (NIR) 흡수와 자기 플라즈몬 나노 입자의 합성 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 특정 분자 표적을 필요로 다양한 생물 의학 응용 프로그램의 Fc 부분을 통해 나노 입자에 항체 접합을 포함한다.

Immunotargeted의 합성 자기 - 플라즈 모닉 나노 클러스터

바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말 (ACs)에 결합 된 증가 된 종양 세포 축적과 분자 페이로드를 제공의 가능성으로 인해 기세를 얻고입니다. 펩 티 드 활용, AC 및 페이로드 세포내 축적, 및 종양을 대상으로 평가 하는 일반적인 방법을 활용 하 고,이 프로토콜 연구원 주요 초기 개발 단계에서 도움이 됩니다.

세포 축적을 증가 하 고 종양을 대상으로 개선에 대 한 바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말의 초기 평가 수정

여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

여기서 우리는 마우스 종양 제노이식 모델에서 항체의 생체 내 국소화를 연구하는 프로토콜을 제시한다.

표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석

이 논문은 삼중 음성 유방암의 합성 뮤린 모델과 종양 미세 환경을 대상으로 설계된 새로운 나노 입자의 전임상 연구를위한 응용 프로그램에서 1 차 암 관련 섬유 아세포의 격리 및 배양에 대한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로합니다.

표적 나노 입자의 연구를 위한 유방암의 합성 Murine 모형에서 1 차적인 암 관련섬유세포의 격리

여기에서는 동물 모델에서 RNA 올리고머를 운반하는 자성 산화철 나노입자를 전이성 유방암으로 생체 내 전달하기 위한 프로토콜을 설명하여 발암성 핵산의 치료적 침묵을 위한 임상적으로 실행 가능한 접근 방식을 제공합니다.

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

혈액-뇌 장벽은 치료법이 없는 질병인 교모세포종에 대한 치료법을 전달하는 데 중요한 장애물입니다. 여기에서, 우리는 크기 덕분에 이러한 생리적 장벽을 우회하고 종양에 축적될 수 있는 in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform을 보고합니다.

Glioblastoma multiforme animal model에서 oligonucleotide payload의 나노입자 전달

학습하세요 종양 표적 나노입자 HerDox의 다중 광학 영상 분석 방법을 통해 생체 내 전달 및 종양 침투를 정량화하는 기술입니다. 이 방법은 표적 암 치료제 개발에 활용됩니다.

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