높은 소금 다이어트와 루이스 쥐에서 만성 신장 질환을 유발하는 산화 질소 합성 효소 억제와 함께 5/6th의 절제

이 절차의 전반적인 목적은 루이스 쥐(Lewis rat)에서 만성 신장 질환을 유도하는 것입니다. 이는 먼저 산화질소 차단제인 NG Nitro, L arginine 또는 LNNA를 4주 동안 투여함으로써 수행됩니다. 그 다음, 오른쪽 신장 전체를 제거합니다.

그 후 일주일 뒤에 왼쪽 신장의 3분의 2를 제거합니다. 마지막으로, LNNA 투여와 고염식 식단을 유지하면서 쥐의 신부전 진행 과정을 시간에 따라 관찰합니다. 최종적으로 소변을 수집하여 단백질과 헤마토크릿을 측정하고, 혈액, 혈장 또는 소변 내의 UIA 및 수축기 혈압을 측정함으로써 만성 신장 질환이 유도되었음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

신장 기능은 궁극적으로 이눌린 및 파라-아미노히푸르산(PAH) 청소율에 의해 결정됩니다. 이 방법은 만성 신장질환(CKD)의 병리에 대한 이해를 높이는 등 신장학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 치료적 중재의 효과를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 첫 신장 절제술 시행 4주 전부터 쥐의 음용수에 20 mg/L의 산화질소 합성효소 억제제인 LNNA를 투여하기 시작하십시오.

이 타임라인에 따라 진행하십시오. 절차를 시작하기 전, 70% alcohol을 사용하여 테이블을 소독하십시오. 수술 준비를 위해 다음 기구들을 멸균하는 것부터 시작하십시오: 담요 1장, 1~2개의 치형(teeth)이 있는 12 centimeter student tissue forceps 1개, standard pattern student forceps 1개, simkin forceps 2개, mayo scissors 1개, student iris scissors 1개, 그리고 가위가 포함된 Olson heger needle holder 1개.

그런 다음 다음의 준비물을 갖춥니다. 가온 패드와 램프, 산소 및 이소플루레인(isoflurine)이 구비된 수술대, 쉐이버, 멸균 수술 기구, 5x5 및 10x10 멸균 거즈, 70% 알코올, 0.9% 염화나트륨 용액, 1 mL 주사기, 25 gauge 바늘, 겔폼(gel foam) 패드, 4.0 및 5.0 Vicryl 봉합사, 0.03 mg/kg의 buprenorphine, 그리고 수술 후 쥐를 수용할 깨끗한 케이지를 준비합니다.

유도 챔버에서 4% isoflurane으로 마취를 유도하고 전처치 진통제를 투여합니다. 필요한 경우, 쥐를 테이블 위 가열 패드 위에 왼쪽으로 눕혀 옮기고, 2% isoflurane과 1L의 산소 혼합물을 사용하는 노즈 콘으로 환기를 시킵니다. 쥐의 옆구리 털을 깎고 알코올을 사용하여 수술 부위를 소독합니다.

수술은 반멸균 환경에서 진행되므로, 더욱 멸균된 준비를 위해 붉은 피부 부위를 알코올로만 소독합니다. 베타딘(Betadine)을 이용한 스크럽법을 사용할 수 있으며, 헤드 캡과 마스크를 착용한 후 손을 씻고 소독한 다음 멸균 수술 장갑을 착용합니다. 다음으로, 해부학적 포셉과 둔단 가위를 사용하여 갈비뼈와 평행하게 1~1.5 cm 길이의 절개를 가합니다.

그 다음, 등 근육을 둔성 박리하여 오른쪽 신장을 노출시킵니다. 신장의 하극이 보이면 작은 둔성 포셉을 사용하여 신장 주변 지방 조직을 조심스럽게 잡습니다. 그런 다음 포셉으로 신장 주변 지방을 부드럽게 당기는데, 이때 부신이 손상되지 않도록 주의하면서 신장을 외부로 노출시켜 부신과 분리합니다.

포셉을 지방 조직의 내측 부위에 위치시키고, 부신과 신장 사이의 조직을 위쪽으로 부드럽게 이동시킵니다. 신장을 거즈 위에 부드럽게 놓고 주변의 지방과 결합 조직을 깨끗하게 제거합니다. 신동맥과 신정맥을 확인하고 느슨하게 잡습니다.

결찰사가 미끄러져 빠지는 것을 방지하기 위해 혈관 주위에 단일 매듭의 결찰사를 배치합니다. 절단 후, 신장과 매듭 사이에 공간을 만들기 위해 느슨한 매듭을 혈관을 따라 대동맥 방향으로 약 0.5 centimeters 조심스럽게 이동시킵니다. 다음으로, 결찰사의 끝을 자르지 않고 두 개의 이중 매듭을 묶습니다.

관류가 성공적으로 중단되면 신장의 색이 즉시 갈색으로 변합니다. 그런 다음 신장 근처에서 신혈관을 절단하고 신장을 제거하십시오. 결찰사의 긴 끝부분을 부드럽게 당겨 신혈관의 출혈 여부를 확인하십시오.

결찰사는 혈관에 그대로 유지되어야 합니다. 결찰사의 긴 끝부분을 절단하십시오. 남은 신혈관은 복강 내로 수축될 것입니다.

즉시 5.0 Vicryl 연속 봉합사를 사용하여 골격근을 뒷다리 쪽으로 폐쇄합니다. buprenorphine 0.03 mg/kg을 근육 내로 주사합니다. 그런 다음 4.0 Vicryl 피내 봉합사를 사용하여 피부를 폐쇄합니다.

다음으로, 적출한 신장의 물기를 닦아내고 무게를 측정합니다. 쥐를 깨끗한 단독 케이지에 넣고 회복시키되, 케이지의 절반이 가열 패드 위에 놓이게 하여 음식과 물을 제공하고 텍스트 프로토콜에 따라 모니터링합니다. 7일 후.

2차 수술을 준비하며, 오른쪽 신장 약 2/3 무게를 계산하고 젤 폼(gel foam) 조각들을 소량 준비합니다. 왼쪽 신장을 외부로 노출시키고 부신을 분리하는 앞서 보여준 과정을 반복합니다. 날카로운 가위를 왼쪽 신장의 상극(upper pole) 주변에 배치하고 한 번의 동작으로 상극을 절제한 뒤, 즉시 젤 폼 조각으로 덮고 멸균 거즈로 가볍게 압박합니다.

그런 다음 신장의 하극을 절제하고, 피부에 혈전이 생기는 것을 방지하기 위해 앞서와 같은 방식으로 덮어줍니다. 신장을 들어 올린 후, 출혈이 멈출 때까지 멸균 거즈를 사용하여 양쪽 젤 폼 패드에 가벼운 압박을 가합니다. 만약 다른 폼 패드에서 출혈이 지속되면, 젤 폼 패드가 부착된 잔존 신장을 복강 내에 배치하고 근육과 피부를 봉합합니다.

앞서 설명한 것과 동일한 절차에 따라 쥐의 회복 상태를 모니터링하고 사육하십시오. 부분 신절제술 후에는 전체 신장 질량의 약 6분의 1이 남게 됩니다. 이 그림은 오른쪽 신장의 제거된 신장 질량의 계산된 백분율을 평균 및 표준 편차와 함께 보여줍니다.

이전 실험에서, 일측 신절제술 후 일주일이 지나면 왼쪽 신장의 비대가 발생하여 오른쪽 신장의 계산된 무게를 기준으로 제거해야 할 신장 조직의 적정량을 약간 과소평가하게 됩니다. 하지만 왼쪽 신장의 무게를 직접 결정하는 것은 불가능하므로, 이 방법이 신장 질량의 약 5/6를 제거하는 가장 정확한 방법입니다. 신부전의 진행 상황은 단백질 및 크레아티닌 측정을 위한 소변 수집, 혈장 요소 및 크레아티닌 측정을 위한 혈액 수집, 그리고 수축기 혈압 측정을 통해 추적합니다.

크레아티닌 청소율을 계산할 수 있으나, 쥐의 경우 광범위한 세뇨관 크레아티닌 분비로 인해 GFR의 감소가 과소평가되는 경향이 있으며, 이는 이눌린 및 PAH 청소율을 통해 신기능을 결정하는 표준 방법의 중요성을 뒷받침합니다. Conners 등이 전체 절차를 설명하였습니다. 이눌린 및 PAH 청소율은 소변 샘플 내 농도, 소변 유량 및 혈장 농도를 통해 계산됩니다. 시간이 지남에 따라 만성 신장 질환(CKD)이 있는 쥐는 고혈압, 빈혈, 단백뇨, 사구체 여과율 및 유효 신혈장 유량의 유의미한 감소가 나타납니다.

6주 후에는 만성 신장 질환(CKD)이 확립되며, 이는 시간 경과에 따른 구제 중재법(rescue interventions)을 테스트하기에 적절한 시점입니다. 이때 고혈압의 강한 진행과 단백뇨가 관찰되는 반면, 헤마토크릿과 신장 기능은 경미한 악화를 보입니다. 본 실험에서 집중적으로 다루지 않은 다른 증상으로는 칼슘 인산염 및 지질 대사 장애 등이 있으며, 쥐의 계통에 따라 여러 다른 증상이 나타날 수 있습니다. CKD의 진행 정도는 여기서 사용된 Lewis 쥐에 따라 현저하게 다를 수 있습니다.

고염 식단과 산화질소 차단제를 추가하여 고혈압과 내피 기능 장애를 유도하였습니다. 이는 간단한 단계입니다. 이 기술은 적절하게 수행될 경우 약 20분에서 50분 정도 소요됩니다.

이 영상을 시청한 후, 단계적 부분 신절제술을 통해 루즈 레드(loose reds) 쥐에서 만성 신장 질환을 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.