마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

다음 실험의 전반적인 목적은 망막 신경절 세포를 모델 뉴런으로 사용하여, 흥분성 및 억제성 시냅스 입력의 비율과 상대적 타이밍 변화가 뉴런의 스파이킹 활성에 미치는 영향을 조사하는 것입니다. 이는 전체 마운트 망막의 신경절 세포 세포체에 생리적 이온 조성과 유사한 세포 내 용액 및 세포 유형의 형태학적 식별을 위한 Lucifer yellow가 채워진 유리 피펫을 사용하여 패칭함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로 다이내믹 클램프를 사용하여 일련의 흥분성 및 억제성 전도 파형을 세포체에 주입하며, 이에 대한 반응으로 막 전위의 변화가 생성됩니다. 다음으로, 대조군 조건 또는 약물 존재 하의 생리학적 실험에서 얻은 다양한 전도 파형을 세포체에 주입하여 그에 해당하는 뉴런 반응을 얻습니다.

결과는 다이나믹 클램프 기록을 통해 흥분성 및 억제성 컨덕턴스로 구성된 전류를 주입함으로써, 흥분과 억제의 비율 변화가 망막 신경절 세포의 스파이킹 활동에 미치는 영향을 보여줍니다. 전류 클램프 또는 전압 클램프와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 흥분성 및 억제성 시냅스 컨덕턴스의 비율과 상대적 타이밍을 뉴런에 주입하여 세포 반응에 미치는 영향을 조사할 수 있는 상호작용 도구를 제공한다는 점입니다. 이 방법론은 망막 회로뿐만 아니라 중추신경계의 다른 모든 뉴런 네트워크의 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

전기생리학적 설정 내의 재관류 시스템에 250 milliliters의 carboxy oxygenated aims medium을 채워 이 절차를 시작합니다. 다음으로, 관류 챔버 바닥에 진공 그리스를 얇고 균일하게 도포합니다. 커버슬립으로 챔버를 밀봉하고 공기가 새지 않도록 확인합니다.

그 다음 챔버의 상단과 하단 끝부분에 그리스를 소량 도포합니다. 그리스는 그리드를 제자리에 고정하고 그리드가 망막을 너무 강하게 압박하는 것을 방지합니다. 이제 플랫폼에 챔버를 고정하고, 그 후 두 개구부를 정렬합니다.

isof fluorine로 마취시킨 후 경추 탈골법으로 동물을 희생시킵니다. 작은 곡선 가위로 눈을 빠르게 적출합니다. 작은 비커에 담긴 산소가 포화된 extracellular fluid로 눈을 충분히 세척한 후, 산소가 포화된 extracellular fluid가 채워진 페트리 접시에 넣습니다.

해부 현미경 하에서, 양쪽 눈의 각막 가장자리에서 약 2mm 떨어진 지점에 19 gauge 바늘을 사용하여 삽입 구멍을 만듭니다. 양쪽의 산소 공급을 원활하게 하기 위해 이 중요한 단계는 신속하게 수행해야 합니다. 그 후, 작은 홍채 가위로 각막 가장자리와 평행하게 절개하여 각막 하나를 제거합니다.

다음으로, 미세 핀셋을 사용하여 홍채와 수정체를 제거하고 반대쪽 눈에도 동일한 절차를 반복합니다. 안구컵 하나를 carbox 산소 공급 세포외 용액이 담긴 비커로 옮깁니다. 메스 날을 이용하여 안구컵 하나를 반으로 자른 후, 둔한 해부용 프로브를 사용하거나 조심스럽게 잡아당겨 망막을 색소 상피로부터 부드럽게 분리합니다.

그 다음, 미세 핀셋을 사용하여 분리된 망막 조직의 가장자리를 ora serrata 가까이 잡고, 또 다른 미세 핀셋으로 ora serrata를 잡습니다. 이를 망막 중심 방향으로 잡아당깁니다. 이 과정은 매우 섬세한 작업이므로 몇 번의 시도가 필요할 수 있습니다.

성공적으로 수행되었다면 모양체와 유리체가 제거되고 망막의 곡률이 감소할 것입니다. 다음으로, 가장자리를 다듬은 후 신경절 세포가 위를 향하도록 하여 망막을 관류 챔버로 옮깁니다. 그리드를 그리스 볼 위에 배치하여 조직을 고정하십시오.

나머지 조직을 다른 아이컵(eye cup)과 함께 산소 공급된 carbox 세포외 용액에 보관하여 나중에 사용하고, 직립 현미경 아래에 기록 챔버를 설치합니다. 즉시 35.5 °C에서 분당 3~5 mL의 속도로 산소 공급된 carbox 세포외 용액이 망막에 지속적으로 관류되도록 조정하며, 접지 전극이 제대로 배치되었는지 확인합니다. 이제 현미경의 광원을 켜고 40배 대물렌즈를 통해 신경절 세포의 세포체에 초점을 맞춥니다.

기록을 위해 홀 마운트의 중심을 찾습니다. 이 단계에서는 5~8 mega ohms의 유리 피펫을 홀더에 고정하고, 40 x 대물렌즈 하에서 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 현미경 아래로 이동시킵니다. 피펫을 천천히 내려 내경계막 표면에 작은 홈이 생길 때까지 내립니다.

피펫을 조심스럽게 앞으로 전진시켜 소량의 조직이 걸리게 한 다음, 위쪽 또는 옆쪽으로 움직여 작은 구멍을 내어 신경절 세포의 세포체가 노출되도록 합니다. 이제 깨끗한 피펫에 Lucifer yellow가 포함된 8~10 µL의 칼륨 기반 세포 내 용액을 채웁니다. 이를 증폭기의 헤드 스테이지에 연결된 홀더에 삽입하고, 염화은 전극이 잠겼는지 확인합니다.

세포체가 큰 세포를 선택합니다. 양압을 가하며 피펫 팁을 천천히 내려 세포막 표면에 작은 홈을 만듭니다. 그 다음 압력을 멈추고 해제하여 기가실(giga seal)을 형성합니다.

기가실(giga seal)이 형성되면, 세포 전체 패치 클램프(whole cell patch clamp) 구성을 만들기 위해 음압을 살며시 가하여 막을 파열시킵니다. 이 과정은 매우 섬세한 단계입니다. 음압을 너무 강하게 가하면 연결 부위에 누출이 발생할 수 있습니다.

양이 너무 적으면 막이 그대로 유지됩니다. 시간이 지남에 따라 Lucifer yellow가 세포 내부를 채우게 되며, 세포가 안정적이라면 세포의 형태를 시각화할 수 있습니다. 이 설정은 30분 이상 유지되어야 합니다.

이제 Patch Master를 사용하여 -75 mV에서 +35 mV까지 10 mV 간격으로 전류-전압 테스트를 수행하고 이후 테스트를 진행하십시오. 이는 1 nA보다 큰 나트륨 전류가 존재하는 경우에만 해당됩니다. 다음으로 LabVIEW를 열고 맞춤 제작된 Neuro Acuma 프로그램을 실행하십시오.

반복 횟수를 8회로 설정하십시오. 그런 다음 흥분성 및 억제성 컨덕턴스의 역전 전위를 각각 0 및 -75 millivolts로 설정하십시오. 테스트를 위해 흥분성 및 억제성 컨덕턴스의 일치하는 쌍을 하나 선택하면 하단 패널에 녹색의 흥분성 컨덕턴스 트레이스와 적색의 억제성 컨덕턴스 트레이스가 나타납니다.

그 후, 패치 마스터로 돌아가 current clamp 모드를 선택하십시오. 즉시 neuro acuma에서 증폭기를 current clamp 모드로 전환하십시오. 기록 버튼을 누르십시오.

활동 전위의 무정형 버스트(aphasic burst)를 동반한 세포 반응이 상단 패널에 나타날 것입니다. 그런 다음 전도도가 낮은 세포에 전류를 주입하십시오. 먼저 반응이 거의 또는 전혀 관찰되지 않는 경우, 강한 반응이 나타날 때까지 전류를 조금씩 증가시키십시오.

과도한 전류 주입은 세포를 사멸시킬 수 있습니다. 테스트가 완료되면, 새로운 전도도 파형 쌍을 선택하고 모든 생리학적 및 인공 전도도 쌍에 대해 동일한 절차를 반복하십시오.

기록 후, 세포체가 손상되지 않도록 피펫을 조심스럽게 회수합니다. 그 직후, 조직을 4% para formaldehyde로 30분 동안 고정하고, 이어서 0.1 molar 인산염 완충액으로 10분씩 세 번 세척한 후 냉장 보관하며, 다음 날 또는 준비가 되었을 때 일주일 이내에 항체 염색을 수행합니다. Lucifer yellow가 충전된 신경절 세포에 대해 실온에서 1:10,000으로 희석한 1차 anti Lucifer yellow rabbit IgG를 사용하여 5일 동안 염색합니다.

그 후 6일째에, 2차 염색제인 goat anti rabbit IgG와 함께 하룻밤 동안 반응시킨 다음, 1:500으로 희석하여 첨가합니다. 마지막으로 형광 보존 용액을 사용하여 망막을 습식 마운트(wet mount) 합니다. 커버슬립을 덮고 매니큐어로 밀봉합니다. Leica SPECT two 공초점 현미경을 사용하여 세포 형태의 공초점 이미지를 촬영합니다.

여기 각각 녹색과 적색으로 표시된 대조 실험에서 얻은 흥분성 및 억제성 전도 파형 주입에 대한 신경절 세포의 반응이 있습니다. 그리고 여기 테트로도톡신을 배양액에 처리한 후 기록된 전도 파형 주입에 대한 반응이 있습니다. 여기 다양한 전도 파형 쌍에 대한 다른 신경절 세포의 반응이 있습니다.

흥분성 전도도와 억제성 전도도 사이의 비율을 1:0에서 1:2까지 변화시켰습니다. 억제 정도가 증가함에 따라 세포의 반응이 감소하였으며, 여기서는 억제의 시작 시점을 달리했을 때 동일한 수준의 흥분에 대한 신경절 세포의 반응을 보여줍니다. Delta T는 억제성 전도도와 흥분성 전도도가 시작되는 시점 사이의 시간 차이를 나타냅니다.

억제 지연 시간이 감소함에 따라 세포의 반응은 약해졌습니다. 이 절차는 신경 세포 출력을 생성하는 흥분성 및 억제성 시냅스 입력 사이의 상호작용을 밝히는 데 도움이 되는 강력한 기술입니다.