세포 단일 층의 기계적 자극에 의​​한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예

다음 실험의 전체적인 목표는 일차 각막 내피세포 단층에서 기계적 자극으로 유도된 세포 간 칼슘 파동의 확산을 정량화함으로써, 갭 결합 채널(gap junction channels)과 헤미 채널(HEMI channels)을 통한 세포 간 통신을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 신선한 소의 눈에서 일차 각막 내피세포를 분리합니다. 두 번째 단계로, 챔버 슬라이드에 세포를 파종하고 2~3일 후, 합류된 세포 단층에 형광 칼슘 민감성 염료인 flu O 4:00 AM을 로딩합니다. 그다음, 단층 내의 단일 세포에 제어된 국소적 기계적 자극을 가하여 세포 간 칼슘 파동을 유도하며, 이를 공초점 현미경으로 시각화합니다.

결과는 세포 간 칼슘 파동 전파의 확산 양상을 보여줍니다. 최종적으로 갭 결합 채널과 HEMI 채널의 억제를 통해, 갭 결합 채널과 HEMI 채널을 형성하는 다양한 Conex 및 panex 동형 단백질의 특성과 조절 기전을 밝혀냅니다. 기계적 자극으로 유도된 세포 간 칼슘 파동 전파의 주요 장점은 비침습적인 방식으로 연결 채널 및 axing 채널의 기여도와 특성을 조사할 수 있는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다는 점입니다.

또한, 이 방법은 연구 대상이 되는 세포 시스템 내에 존재하는 생리적 신호 전달 분자 및 캐스케이드에 의존합니다. 마지막으로, 일차 세포 및 특정 connexin 또는 PanIN 동형 단백질을 외인성으로 발현하는 세포 모델을 포함하여 다양한 세포 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 방법은 내인성 connexin 또는 PanIN 동형 단백질의 siRNA 매개 넉다운 및 gap junction 채널과 HEMI 채널의 선택적 억제제를 사용하여, connexin 및 PanIN 기반의 gap junction 채널과 HEMI 채널의 기능과 동적 조절에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

이 시스템은 결코 각막 내피세포에만 국한되지 않습니다. 사실상 거의 모든 세포 유형과 더 복잡한 조직에도 적용 가능합니다. 본 절차에서는 사후 5분 이내의 18개월 이하 소의 신선한 각막 적출안을 사용합니다.

이를 Earl's balance salt solution 및 1% iodine 용액에 담아 4°C에서 실험실로 운반하였습니다. 먼저, 안구를 100 mm x 20 mm 페트리 접시에 옮깁니다. 그다음, 1% iodine가 포함된 EBSS로 안구를 세척합니다.

이후부터는 70% ethanol 용액으로 멸균하십시오. 무균 후드 내에서 작업하십시오. 안구에서 각막을 조심스럽게 절제하여 상피 세포층이 위를 향하도록 EBSS가 들어 있는 35 mm x 10 mm 페트리 접시에 놓으십시오.

각막에 여전히 붙어 있는 나머지 홍채 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 필요한 경우, 각막의 내피세포층이 위를 향하게 하여 다른 EBSS 접시에 옮긴 후 EBSS로 두 번 헹굽니다. 다음으로, 내피층이 위를 향하도록 하여 각막을 아워글라스(hourglass)에 넣고 성장 배지로 덮습니다.

세척하려면 흡입 피펫으로 배지를 제거합니다. 각막의 내피층에 0.5 g/L 트립신 용액 300 µL를 도포합니다. 각막이 담긴 모래시계 형태의 용기를 덮개가 있는 페트리 접시에 넣고, 37 °C, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.

모래시계 모양의 기구를 회수한 후, 화염 연마된 갈고리 모양의 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각막에서 내피세포를 부드럽게 긁어냅니다. 내피세포가 포함된 용액을 흡입하여 4 mL의 배지가 들어 있는 25 cm² 배양 플라스크에 넣습니다. 다음으로, 각막에 300 µL의 성장 배지를 도포합니다.

긁어내기 과정을 반복하고, 내피세포가 포함된 용액을 배양 플라스크에 추가합니다. 이 단계를 한 번 더 반복한 다음, 각막 내피세포가 들어 있는 배양 플라스크를 성장 배지가 담긴 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에 넣습니다. 이틀 후, 6 mL의 배양 배지를 추가하고 이틀마다 성장 배지를 교체합니다.

세포는 분리 후 계대 배양까지 7~10일 이내에 합류(confluence)되어야 합니다. 먼저, 배양액을 흡입하여 제거한 다음 EBSS로 두 번 세척합니다. 그 후 세포에 2 mL의 trypsin 용액을 첨가하고 플라스크를 인큐베이터에 3~4분 동안 둡니다.

그 다음, 성장 배지 12 milliliters를 첨가하고 피펫으로 배지를 세 번 흡입 및 배출하여 세포를 분산시킵니다. 그런 다음 헤모사이토미터 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 두 개의 웰 배양 슬라이드에 각각 165, 000 cells를 분주합니다.

다음으로, 75 cm² 사각형 배양 플라스크를 cm²당 6,250 cells의 밀도로 새로운 계대 배양을 위해 준비하고, 신선한 배양액을 총 부피 25 mL가 되도록 첨가한 후 플라스크와 챔버 슬라이드를 인큐베이터에 넣습니다. 배양액은 2일마다 교체하며, 세포층의 합류(confluency)는 3~4일 이내에 도달해야 합니다. 먼저, 챔버 슬라이드 내의 세포를 37 °C에서 완만한 진탕과 함께 phosphate buffered saline에 희석된 10 µM Fluo-4 AM으로 30분 동안 처리합니다. 세포가 Fluo-4 AM으로 인큐베이팅되는 동안, 팁 직경이 1 µm 미만인 유리 마이크로 피펫을 piezo electro crystals 나노 포지셔너에 결합하고, 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 증폭기에 연결합니다.

나노 포지셔너의 전압을 0.2에서 1.5 V 사이로 설정하십시오. 4:00 AM 용액의 플루를 제거합니다. 그다음 인산염 완충 식염수로 세포를 5회 세척하고, 측정 전 실온에서 PBS로 최소 5분 동안 세포를 배양하십시오.

아르곤 레이저로 488 nanometers 파장을 여기시키고 빔 스플리터 HFT 48을 사용합니다. 핀홀을 최소로 설정하고 오일 침수 40 x 대물렌즈를 사용하여 530 nanometers에서 형광 방출을 수집하며, 이때 롱패스 방출 필터 LP 5 0 5를 사용합니다. 챔버 슬라이드를 공초점 현미경의 스테이지 위에 놓고 세포가 융합된 영역을 찾습니다.

다음으로, 마이크로 조작기를 움직여 유리 마이크로 피펫이 세포막에 45도 각도로 닿도록 배치합니다. 마이크로 조작기를 조작하여 유리 마이크로 피펫으로 단일 세포막의 1% 미만 영역을 짧게 접촉시켜 세포에 1초 동안 기계적 자극을 줍니다. 그런 다음 공초점 현미경을 사용하여 기계적 자극 이후의 칼슘 이온 농도의 공간적 변화를 측정하고 이미지를 수집하여 저장합니다.

마지막으로, 공초점 현미경 소프트웨어를 사용하여 반응 세포의 전체 표면적을 정의하는 다각형 관심 영역을 그립니다. 소 각막 내피 세포의 대조군 조건에서 기계적 자극으로 유도된 칼슘 과도 현상이 대표적인 의사 색상 형광 이미지의 서로 다른 시점에 나타나 있으며, 첫 번째 이미지에는 자극 전의 형광 강도가 표시됩니다. 두 번째 이미지의 흰색 화살표는 기계적 자극을 받은 세포를 나타냅니다.

칼슘 파동은 인접한 6개의 세포층으로 전파되며, 파동이 도달한 전체 세포 면적은 62, 870 µm²의 활성 면적을 나타냅니다. 선 그래프는 기계적 자극을 받은 세포(ms로 표시)의 정규화된 형광 값(NF)의 시간 경과와, 그래프에 MB 1에서 MB 5로 표시된 인접한 1~5번째 세포층의 NF 평균값을 보여줍니다. 이 이미지들은 외인성 뉴클레오타이드 처리 후(왼쪽 그래프)와 ecto nucleotide aase 억제제 처리 후(오른쪽 그래프) 세포 간 칼슘 파동의 확산에 나타나는 유의미한 변화를 더 자세히 보여줍니다. 구체적으로, 왼쪽 그래프는 소 각막 내피 세포에 외인성 Aras Aase 6 및 Aase 7을 처리했을 때 ATP와 ADP가 가수분해되어 주변세포 간 통신 경로가 억제됨으로써 활성 면적이 유의미하게 감소함을 보여줍니다.

별표는 ace 존재 여부에 따른 P 값이 0.001 미만임을 나타냅니다. 오른쪽 그래프는 선택적 ecto 뉴클레오타이드 억제제인 A RL 6 7 1 56로 BCEC를 처리한 후 활성 영역이 유의하게 증가하여 pericrine 세포 간 통신 경로가 강화되었음을 보여줍니다. 별표는 a RL 존재 여부에 따른 P 값이 0.001 미만임을 나타냅니다. 숙달되면.

이 기술을 적절하게 수행할 경우, 한 가지 조건의 실험 하나당 5분에서 10분 정도 소요됩니다. 서로 다른 조건들을 비교할 수 있는 전체 실험 시리즈를 수행하여 통계적 결론을 도출하는 데는 하루가 소요됩니다. 서로 다른 날에 수행하고 서로 다른 배치의 분리된 세포를 사용한 독립적인 실험들이 활용되어야 합니다.

세포 내 칼슘 파동 전파를 측정하고 정량화함으로써 갭 결합 채널(gap junction channels) 및 헤미채널(HEMI channels)과 같은 다양한 결합 및 이소형의 세포 생물학적 조절을 식별하고 특성화할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 단독으로 사용되기보다 다이(dye) 전달부터 TP 방출 및 전기생리학에 이르는 다른 분자적 및 기능적 접근 방식과 상호 보완적으로 사용되어야 함을 강조하고자 합니다.