Name: 세포 단일 층의 기계적 자극에 의한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 학습하세요 소 각막 내피 세포에서 기계적 자극에 의한 칼슘 웨이브 전파를 측정하는 방법을 통해 세포 간 통신을 연구하는 기법입니다. 이 방법은 갭 정션 채널과 헤미채널의 특성을 비침습적으로 분석할 수 있습니다.

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실험실에서 수행 된 연구 활동은 연구 재단의 보조금에 의해 지원되었다 - 플랑드르 (FWO, 부여 번호 G.0545.08 및 G.0298.11) Interuniversity 장르 폴란드 프로그램 (벨기에 과학 정책, 허가 번호 P6/28 및 P7/13) 그리고 FWO 지원 연구 커뮤니티에 포함됩니다. 플랑드르 (FWO) - CDH는 연구 재단의 박사후 사람입니다. 저자는 매우 분자 및 세포 신호 (KU 루벤), 박사 SP 스 리니 (시력 측정법의 인디애나 대학 학교, USA) 박사 Leybaert의 연구실 (겐트 대학교)의 연구소의 모든 현재 및 이전 회원들에게 감사와 있습니다 도움이 토론을 제공하는 박사 Vinken은 (VUB), 절차를 최적화하거나 넥신 hemichannels의 연구 도구의 개발에 참여했다.

1. 각막 내피 세포의 분리 시작하기 전에 : 눈 enucleating 후 현지 도축장, 가능한 한 빨리 얻은 신선한 눈에서 세포를 분리. 눈이 최대 18 개월 5 분 사후과 얼의 균형 소금 용액에 보존의 소에서 적출되었는지 확인 - 4의 1 % 요오드 용액 실험실 운송 ° C. <ol><li> 얼의 균형 소금 솔루션의 밖으로 눈을 가지고 - 1 % 요오드 용액을 페트리 접시 (100 X 20mm)에 넣습니다. </li><li> 70 % 에탄올을 포함하는 용액으로 눈을 소독하고 1 % 요오드를 포함 얼의 균형 소금 용액으로 씻어. </li><li> 에서이 단계에서, 멸균 후드에서 작동합니다. 조심스럽게 눈에서 각막을 해부하고 위로 향하게 상피 세포 층과 얼의 균형 소금 솔루션을 포함하는 페트리 접시 (35 × 10 ㎜)에 배치합니다. 주의 깊게 남아있는 홍채 조직 STI를 제거필요한 경우 각막에 부착 것이다. </li><li> 위로 내피 세포의 레이어와 페트리 접시를 포함하는 다른 얼의 균형 소금 솔루션에 각막을 전송하고 얼의 균형 소금 용액으로 두 번 헹구십시오. </li><li> 컵 모양의 접시입니다 모래에 위로 향하게 내피 층 각막을 전송하고, 성장 매체로 커버. 성장 매체는 25 mM의 포도당, 10 % 소 태아 혈청, 6.6 % L-글루타민, 2.5 ㎍ / ㎖ 암포 테리 신-B, 1 % 항생제 항진균 혼합물을 10,000 단위를 포함하는 / 페니실린의 ML, 10,000 μg을 함유 Dulbecco의 수정 이글의 중간으로 구성 스트렙토 마이신 / ㎖, 25 ㎍ / ㎖ 암포 테리 신 B. </li><li> 흡입 피펫 매체를 제거합니다. </li><li> 각막의 내피 층 (트립신을 포함하는 모든 단계가 같은 농도를 사용하여 수행 할 수 있습니다)에 트립신 용액 (0.5 g / L)의 300 μl를 적용합니다. </li><li> 적용 페트리 접시에 각막을 포함하는 모래 시계를 놓고 INC에 넣어37 30 분 동안 ubator ° C와 5 % CO 2. </li><li> 부드럽게 멸균 후드에 불 세련된 후크 모양의 유리 파스퇴르 피펫으로 각막에서 멀리 내피 세포를 긁어. </li><li> 내피 세포를 포함하는 솔루션을 빨아 문화 매체의 4 ML을 포함하는 문화 플라스크 (25cm 2)에 추가합니다. </li><li> 각막에 성장 매체 300 μl를 적용하고 긁기를 반복하고 문화 플라스크에 내피 세포가 포함 된 솔루션을 추가합니다. </li><li> 한 번 더 마지막 단계 (1.11)를 반복합니다. </li><li> 문화를 놓고 37 배양기에서 배양 배지 ° C와 5 % CO 2에서 각막 내피 세포를 포함 플라스 크입니다. </li><li> 이틀, 문화 매체의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 격일로 성장 매체를 새로 고칩니다. </li></ol> 2. 세포 배양 <ol><li> 배지를 제거하고 도달 자랄 얼의 균형 소금 솔루션 (이란게 내에서 두 번 세포를 씻으분리 후 T는 10 일). </li><li> 를 분리하고 인큐베이터에 플라스크를 배치 할 셀에 1.5 ML 트립신 솔루션을 추가 (37 ° C, 5 % CO 2) 3-4 분. </li><li> 성장 매체 12 ML을 추가합니다. 세포를 분산하고 세포를 계산하기 위해 밖으로 중간 세 번 피펫. </li><li> 세포 밀도와 인큐베이터에 넣어 따라 변수 부분에 씨앗 세포를. 165,000 세포의 세포 수 (cm 2 당 세포 밀도 39,286) 두 잘 챔버 슬라이드 (4.2 cm 2의 면적)를 준비. cm 2 당 6,250의 밀도에 새로운 통과를 위해 80cm 2 문화 플라스크를 준비하고 25 ML의 총 볼륨에 신선한 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 이틀 매체를 새로 고칩니다. </li><li> 세포 층 자랄는 3-4일에 도달 한 후에. 실험 세포를 사용합니다. </li><li> 플라스크의 세포 층의 confluency에 도달하면, 2.6 단계 2.1를 반복합니다. 통행 최대 2 세포 배양 F를 사용할 수 있습니다또는 실험. </li></ol> 3. 유도 칼슘 웨이브 기계적 자극 <ol><li> 10 μM 플루오-4와 챔버 슬라이드에 세포를로드하기에 오전 37시 30 분 생리 인산염 버퍼 ° C 가볍게 흔들어. </li><li> 플루오-4 솔루션 AM 제거, 생리 인산염 버퍼와 세포 다섯 번 씻어 염분 인산 버퍼로 세포를 배양 및 측정 전에 실온에서 적어도 5 분 동안 세포를 둡니다. </li><li> 아르곤 레이저를 사용 빔 스플리터 HFT 488와 488 nm에서 흥분은 longpass 방출 필터 LP 505를 사용하여 530 nm에서 형광 방출을 수집 최소한 핀홀을 설정합니다. 기름 침지 40X 목표 (공기, 1.2 NA)를 사용합니다. ARL-67156를 가진 실험에서 10X 목표를 사용 (공기, 0.3 NA). </li><li> 세포가 공 촛점 현미경에 합류되는 필드를 검색합니다. </li><li> 위치는 45 챔버 슬라이드에 대하여 10 °와 세포막을 터치에서되도록 피펫을.하나의 셀에 짧은 (≈ 1 초) 기계적 자극을 자극. 기계적 자극 잠깐입니다 앰프를 통해 운영 압전 크리스탈 나노 위치에 결합 된 유리 마이크로 피펫 (팁 직경 &lt;1 ㎛)로 세포막의 1 % 미만을 만져 세포의 급성, 짧은 지속 변형으로 구성 마이크로 매니퓰레이터에 장착. 유리 마이크로 피펫을 미세 전극 풀러와 함께 만들어집니다. 나노 위치가 기계적 자극하는 동안 0.2에서 1.5 V 사이의 전압으로 작동되어 있는지 확인합니다. 1.5 V보다 높은 전압 세포가 손상 될 수 있습니다. 각 세포 유형 및 조건, 세포 손상없이 기계적 자극에 대한 최적의 전압은 신중하게 높은 (1.5 V) 전압 (0.2 V)에서부터 시작 전압의 시리즈를 적용하여 결정해야합니다. 이 전압이 세포막에 적용되는 기계적 응력과 변형을 결정 때문에 전압은 자극의 힘에 대한 척도이다.기계적 자극의 힘은 지역에 기계적 스트레스를 곱하여 계산할 수 있습니다. 면적 (&lt;3.14 μm의 2) 및 기계적 스트레스가 모두 매우 낮은이기 때문에, 기계적 자극의 힘은 낮다. (세포가 손상되었을 때, 세포와 세포 밖으로 형광 누출이 어두워합니다.) </li><li> 공간적 변화를 측정 [칼슘 2 +] 공 촛점 현미경으로 기계적 자극에 따라 전. </li><li> 이미지를 수집하고 저장합니다. </li><li> 공 초점 현미경의 소프트웨어를 사용하여 반응 세포 (활성 영역, AA)의 총 면적을 정의하는 관심 다각형 영역을 그립니다. </li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

이 논문에서, 우리는 마이크로 피펫을 사용하여 지역화 및 제어 기계 자극을 제공함으로써 주 소 각막 내피 세포의 단일 층에 간 칼슘 2 + 파 전파를 측정하는 간단한 방법을 설명합니다. 기계적 자극 세포는 +, 둘은 간 칼슘 2 + 파 전파 11,67 운전 필수적인 세포 내 신호 전달 분자 세포 내 IP 3 칼슘 2 지역의 증가와 함께 응답합니다. 칼슘 2 + hemichannels의 개방과 G-단백질 결합 P2의 활성화를 통해 이웃 세포에서 칼슘 2 + 신호를 트리거 ATP 68,69의 방출을 유발하면서 IP 3 직접 갭 접합 채널 5를 통해 이웃 세포에 전달된다 수용체 37-40. 갭 접합 채널이 과정에서 hemichannels의 상대적 기여도는 CX-모방의 사용에 의해 특징...

간 통신 및 신호는 조직과 전체 - 장기 레벨 1,2에서 세포 촉진제 님의 질문에 생리적 인 과정의 조정을 위해 필수적입니다. 간 의사 소통의 가장 직접적인 방법은 간격 접속점의 발생에 의해 만들어집니다. 갭 접합 3,4 인접 셀의 두 넥신 (CX는) hemichannels (그림 1)의 헤드 투 헤드 도킹에 의해 형성 단백질 성 채널입니다 간격 접합 채널의 패이다. 갭 접합 발생 및 변조 칼슘 이웃 세포 ​​6 (그림 2)의 세포 내 상점에서 + 릴리스., 칼슘 2 + 또는 IP 5 등 이하 1.5 kDa의 분자량은 작은 신호 분자의 통과를 허용 갭 접합 채널은 밀접하게 산화 환원 수정 및 같은 내 및 분자간 단백질 상호 작용에 의해 및 세포 신호 전달 과정에 의해 조절된다인산화 7. GJS 그로 인하여 화학 및 전기 syncytium 역할, 연결된 세포의 조정 반응을 촉진한다. 예를 들어, 심방 및 심실 근육 세포를 통해 심장 활동 전위의 확산은 CX-기반 GJ 채널 85에 의해 중재된다. CXS는 갭 접합 채널로서 역할을 할뿐만 아니라 짝 hemichannels을 형성하여 정기적으로 이온 채널 8-10 (그림 1)과 유사 세포막 채널로 작동하지 않습니다. Hemichannels는 내부와 세포 외 환경 사이 이온 및 신호 분자의 교환을 제어하여 이웃 세포 사이 paracrine 신호에 참여할 수 있습니다. 많은 종류의 세포 (상피 세포, 조골 세포, 성상 세포, 내피 세포 등과 같은) 및 장기 (뇌, 간, 망막, 달팽이관과 혈관 등)에 간 칼슘 2 + - 파도 다세포 반응의 조정을위한 기본적인 <suP&gt; 11. 특정 셀에 내 Ca 2 + 농도의 증가는이 셀로 제한하지만, 그로 인하여 간 칼슘 2 + 파 12,13 구축, 주변 이웃 세포에 전달되지 않습니다. 이러한 세포 간 칼슘 2 + - 파도 syncytium과 조절 장애는 병태 생리 학적 과정 11과 관련되어 같은 셀 계층의 정상적인 생리 조절을 위해 중요하다. 각막 내피 세포와 상피 세포에서, 우리 자신의 25-33 등 다른 그룹 14-24은 간 통신 메커니즘과 역할을 공부했다. 비 흥분 세포, 각막 내피 세포와 같은 세포 간 의사 소통의 두 가지 모드는 28,29, 즉 갭 접합 간 통신 및 paracrine 간 통신을 발생합니다. 갭 접합 간 통신 간격 분기점 7을 통해 신호 분자의 직접 교환을 포함한다. 갭 접합부tional 간 통신, 조직의 항상성을 유지하는 세포 증식을 조절하고, 세포 스트레스 10,34,35에 동기화 응답을 설정하기위한 중요합니다. 병리 번호, 갭 접합 커플 링으로 인해 결함이 CXS로 감소하고, 이에 갭 접합 간 통신이 36에 영향을 미치고있다. 이 다세포 생물의 격차 접합부 간 의사 소통의 중요성과 영향력을 강조한다. 그것이 확산 성 세포 메신저 (그림 2)의 방출을 포함 이후 격차 접합부 간 통신 대조적으로, paracrine 간 통신, 세포 - 세포 동격에 종속되지 않습니다. 신호 분자의 종류는 세포 신호에 의해 세포 공간에 해제됩니다. 분자 다음은 특정 수용체​​ 단백질에 의해 감지 된 대상 셀에 전송됩니다. 이후 수용체 신호 단지 어떤 세포 반응을 유도신호를 비활성화 또는 탈감작의 제거에 의해 종료됩니다. 출시 친 화성 세포 신호 메신저 멤브레인을 통과하고 세포 내 수용체에 작용합니다. 반면, 친수성 ​​메신저는 응답 세포의 세포막을 통과하지 않는다, 그러나 세포 내 환경에 신호를 중계 표면 발현 수용체 단백질에 결합하는 리간드 역할을합니다. 이온 채널 연결, 효소 결합, 및 G 단백질 - 연결 : 세포 표면 수용체 단백질의 세 가지 주요 가정은이 과정에 참여한다. 발표 메신저 분자가 가까이 (paracrine)에서 표적 세포에 동일한 셀 (autocrine)의 수용체에 작용하거나 순환 시스템 (내분비)가 필요 먼 표적 세포에. 각막 내피 세포 28,29 등 많은 종류의 세포에서, ATP는 세포 간 칼슘 2 + - 파도 37-40의 번식을 구동 주요 친수성, paracrine 요인 중 하나입니다. 지속여러 에이전트가 ING 기계적 변형, 저산소증, 염증이나 자극, ATP는 전단 응력, 스트레칭, 또는 삼투는 44,45 붓기에 대한 응답으로 41-44 건강한 세포에서 해제 할 수 있습니다. 다른 ATP 방출 메커니즘은 기공을 갖는 exocytosis를 44과 같은 ATP 결합 카세트 (ABC) 전송기, plasmalemmal 전압에 의존하는 음이온 채널 46, P2X7 수용체의 채널 47,48뿐만 아니라, 같은 전송 메커니즘의 과다 등 가정되었다 넥신의 hemichannels 49-52과 pannexin의 hemichannels 43,49,53. 세포 ATP는 ADP, AMP에 빠르게 가수 분해와 세포 외 환경에 존재하는 ectonucleotidases로 54,55를 아데노신 수 있습니다. extracellularly 발표 ATP와 그 대사 산물 ADP 56 확산을 통해 확산됩니다. 이웃 세포에서 퓨린 수용체 이러한 뉴클레오티드의 연속적인 상호 작용은 P에 연루되어있다간 칼슘 2 + - 파도 28,37,51의 ropagation. 퓨린 수용체의 두 가지 클래스가 존재한다 : 두 퓨린 (ATP, ADP)과 피리 미딘 (UTP, UDP) 뉴클레오티드 가장 P2-purinoceptors 57에 따라 행동하면서 아데노신은 P1-purinoceptors의 주요 천연 리간드이다. 간 통신 등의 부스러기 로딩, 염료 전송, IP 3 칼슘 2 +, 기계적 자극, 등과 같은 작용제 지역의 uncaging 등 다양한 방법으로 조사 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 + 웨이브 전파는 단일 세포의 기계적 자극으로 이끌어 칼슘의 연구를 설명합니다. 기계적 자극에 의해 칼슘 2 + 파 전파 연구의 장점은 + 파 시간에 칼슘의 확산을 정량화하기 쉬운 도구를 제공하고 정량적으로 세포의 다른 전처리를 비교 할 수 있다는 것입니다. 각막 내피 세포에서 이러한 세포 간 칼슘 2 + - 파도 공동 수단층에서 조정 된 응답, 이에 안구 수술하는 동안 세포 스트레스를 견딜 수있는 내피를 돕는 비 재생 각막 내피 세포의 가능한 방어 메커니즘으로 작용 또는 면역 거부 또는 포도막염 58,59 동안 염증 매개체에 노출에.

<table><tbody><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>Iodine</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>38060-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (Glutamax)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin-B</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic mixture</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 PBS</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (독일 카를스루에)</td><td>14190-091</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (독일 카를스루에)</td><td>F14217</td><td></td></tr><tr><td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-B,G-Dibromomethylene-D-ATP) </td><td>Sigma-Aldrich (독일 Deisenhofen)</td><td>A265</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VI</td><td>Sigma-Aldrich (독일 Deisenhofen)</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VII</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td><td>맞춤형 펩타이드 합성</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td><td>맞춤형 펩타이드 합성</td><td></td><td></td></tr><tr><td>제어 펩타이드 (SRGGEKNVFIV)</td><td>맞춤형 펩타이드 합성</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTt) </td><td>어닐링된 siRNA는 다음에서 구입했습니다. Eurogentec (Luik, Belgium)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td><td>Annealed siRNA는 Eurogentec (Luik, Belgium)에서 구입했습니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAdTdT) </td><td>Annealed siRNA는 Eurogentec (Luik, Belgium)에서 구입했습니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2 (TAT-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td><td>Thermo Electron (Ulm, 독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td><td>Thermo Electron (Ulm, 독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two chambered glass slides</td><td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope </td><td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>피에즈&#8211; lectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td><td>P-280</td><td></td></tr><tr><td>HVPZT-amplifier</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td><td>E463 HVPZT-amplifier</td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td><td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Micr&#8211; lectrode puller </td><td>Zeitz Instrumente (뮌헨, 독일)</td><td>WZ DMZ-Universal Puller</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 단일 층의 기계적 자극에 의​​한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

간 통신은 뇌, 간, 망막, 달팽이관 및 혈관 등의 장기와 조직의 다양한 세포 사이의 생리적 인 과정의 조정을 위해 필수적이다. 실험 설정에서, 세포 간 칼슘 2 + - 파도 하나의 세포에 기계적 자극을 적용하여 이끌어 할 수 있습니다. 이 세포 내 신호 IP 분자 3 칼슘의 출시에 이르게 + 이웃 세포에 기계적 자극 셀에서 + 파 동심 칼슘의 번식을 시작합니다. 간 칼슘 2 + 파 전파를 제어하는 주요 분자 경로는 IP 3의 직접 전송을 통해와 ATP의 방출을 통해 hemichannels으로 갭 접합 채널에 의해 제공됩니다. 속성과 다른 넥신 갭 접합 채널 hemichannels로 pannexin 이소 규제의 식별 및 특성화 quantificatio에서 허용하는N 간 칼슘 2 + 파, siRNA를, 그리고 갭 접합 채널 hemichannels 억제제의 사용의 확산. 여기, 우리는 그 결과로 간 칼슘이 세포의 급성, 짧은 지속 변형에 의해 자극 통제 및 지역화 기계적 자극에 대한 응답으로 Fluo4 암으로로드 차 각막 내피 세포의 단일 층에있는 + 파를 측정하는 방법을 설명 이하 1 ㎛의 팁 직경 micromanipulator에 제어 유리 micropipette를 가진 세포막을 감동. 우리는 또한 주 소 각막 내피 세포와 + - 파도 ATP의 방출을 통한 세포 간 칼슘의 중심 세력으로 Cx43-hemichannel 활동을 평가하기위한 모델 시스템으로 사용의 분리를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 사용, 장점, 한계와 갭 접합 채널 hemichannel 연구의 맥락에서이 방법의 대안을 논의한다.

모든 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행되고 설명되는 프로토콜은 KU 루벤의 동물 관리 및 사용위원회의지도 및 승인하에 수행됩니다. 소 각막 내피 세포 (BCEC)에서 기능성 간격 접속점은 표현 격차 접합부 간 통신 및 paracrine 간 통신을 모두 상호 작용하는 방식 간 통신에 크게 기여하지만 주요 통로에 의해 중재 paracrine 간 통신 경로로 표시되었습니다 있습니다 Cx43 기반 hemichannels 28,29을 통해 ATP 자료. ATP와 ADP는 ectonucleotidase E-NTPD1 (ectonucleoside 인산 diphosphohydrolase 1, CD39 ATP diphosphohydrolase)에 의해 인산염 (AMP)을 아데노신을 가수 분해하고, 이후 5&#39;-ectonucleotidase CD73 28,29으로 아데노신 할 수 있습니다. ATP와 ADP는에 기여P2Y1와 P...

간 카<sup&gt; 2 +</sup&gt; - 파도 갭 접합 채널 hemichannels에 의해 구동됩니다. 여기, 우리는 세포 간 칼슘을 측정하는 방법을 설명<sup&gt; 2 +</sup&gt; - 파 지역의 단일 셀 기계적 자극과 속성과 간격 접합 채널 hemichannels의 규정을 조사하기 위해 해당 응용 프로그램의 질문에 답변 세포 단층합니다.

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

다음 실험의 전체적인 목표는 일차 각막 내피세포 단층에서 기계적 자극으로 유도된 세포 간 칼슘 파동의 확산을 정량화함으로써, 갭 결합 채널(gap junction channels)과 헤미 채널(HEMI channels)을 통한 세포 간 통신을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 신선한 소의 눈에서 일차 각막 내피세포를 분리합니다. 두 번째 단계로, 챔버 슬라이드에 세포를 파종하고 2~3일 후, 합류된 세포 단층에 형광 칼슘 민감성 염료인 flu O 4:00 AM을 로딩합니다. 그다음, 단층 내의 단일 세포에 제어된 국소적 기계적 자극을 가하여 세포 간 칼슘 파동을 유도하며, 이를 공초점 현미경으로 시각화합니다.결과는 세포 간 칼슘 파동 전파의 확산 양상을 보여줍니다. 최종적으로 갭 결합 채널과 HEMI 채널의 억제를 통해, 갭 결합 채널과 HEMI 채널을 형성하는 다양한 Conex 및 panex 동형 단백질의 특성과 조절 기전을 밝혀냅니다. 기계적 자극으로 유도된 세포 간 칼슘 파동 전파의 주요 장점은 비침습적인 방식으로 연결 채널 및 axing 채널의 기여도와 특성을 조사할 수 있는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다는 점입니다.또한, 이 방법은 연구 대상이 되는 세포 시스템 내에 존재하는 생리적 신호 전달 분자 및 캐스케이드에 의존합니다. 마지막으로, 일차 세포 및 특정 connexin 또는 PanIN 동형 단백질을 외인성으로 발현하는 세포 모델을 포함하여 다양한 세포 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 방법은 내인성 connexin 또는 PanIN 동형 단백질의 siRNA 매개 넉다운 및 gap junction 채널과 HEMI 채널의 선택적 억제제를 사용하여, connexin 및 PanIN 기반의 gap junction 채널과 HEMI 채널의 기능과 동적 조절에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.이 시스템은 결코 각막 내피세포에만 국한되지 않습니다. 사실상 거의 모든 세포 유형과 더 복잡한 조직에도 적용 가능합니다. 본 절차에서는 사후 5분 이내의 18개월 이하 소의 신선한 각막 적출안을 사용합니다.이를 Earl's balance salt solution 및 1% iodine 용액에 담아 4°C에서 실험실로 운반하였습니다. 먼저, 안구를 100 mm x 20 mm 페트리 접시에 옮깁니다. 그다음, 1% iodine가 포함된 EBSS로 안구를 세척합니다.이후부터는 70% ethanol 용액으로 멸균하십시오. 무균 후드 내에서 작업하십시오. 안구에서 각막을 조심스럽게 절제하여 상피 세포층이 위를 향하도록 EBSS가 들어 있는 35 mm x 10 mm 페트리 접시에 놓으십시오.각막에 여전히 붙어 있는 나머지 홍채 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 필요한 경우, 각막의 내피세포층이 위를 향하게 하여 다른 EBSS 접시에 옮긴 후 EBSS로 두 번 헹굽니다. 다음으로, 내피층이 위를 향하도록 하여 각막을 아워글라스(hourglass)에 넣고 성장 배지로 덮습니다.세척하려면 흡입 피펫으로 배지를 제거합니다. 각막의 내피층에 0.5 g/L 트립신 용액 300 µL를 도포합니다. 각막이 담긴 모래시계 형태의 용기를 덮개가 있는 페트리 접시에 넣고, 37 °C, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.모래시계 모양의 기구를 회수한 후, 화염 연마된 갈고리 모양의 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각막에서 내피세포를 부드럽게 긁어냅니다. 내피세포가 포함된 용액을 흡입하여 4 mL의 배지가 들어 있는 25 cm² 배양 플라스크에 넣습니다. 다음으로, 각막에 300 µL의 성장 배지를 도포합니다.긁어내기 과정을 반복하고, 내피세포가 포함된 용액을 배양 플라스크에 추가합니다. 이 단계를 한 번 더 반복한 다음, 각막 내피세포가 들어 있는 배양 플라스크를 성장 배지가 담긴 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에 넣습니다. 이틀 후, 6 mL의 배양 배지를 추가하고 이틀마다 성장 배지를 교체합니다.세포는 분리 후 계대 배양까지 7~10일 이내에 합류(confluence)되어야 합니다. 먼저, 배양액을 흡입하여 제거한 다음 EBSS로 두 번 세척합니다. 그 후 세포에 2 mL의 trypsin 용액을 첨가하고 플라스크를 인큐베이터에 3~4분 동안 둡니다.그 다음, 성장 배지 12 milliliters를 첨가하고 피펫으로 배지를 세 번 흡입 및 배출하여 세포를 분산시킵니다. 그런 다음 헤모사이토미터 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 두 개의 웰 배양 슬라이드에 각각 165, 000 cells를 분주합니다.다음으로, 75 cm² 사각형 배양 플라스크를 cm²당 6,250 cells의 밀도로 새로운 계대 배양을 위해 준비하고, 신선한 배양액을 총 부피 25 mL가 되도록 첨가한 후 플라스크와 챔버 슬라이드를 인큐베이터에 넣습니다. 배양액은 2일마다 교체하며, 세포층의 합류(confluency)는 3~4일 이내에 도달해야 합니다. 먼저, 챔버 슬라이드 내의 세포를 37 °C에서 완만한 진탕과 함께 phosphate buffered saline에 희석된 10 µM Fluo-4 AM으로 30분 동안 처리합니다. 세포가 Fluo-4 AM으로 인큐베이팅되는 동안, 팁 직경이 1 µm 미만인 유리 마이크로 피펫을 piezo electro crystals 나노 포지셔너에 결합하고, 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 증폭기에 연결합니다.나노 포지셔너의 전압을 0.2에서 1.5 V 사이로 설정하십시오. 4:00 AM 용액의 플루를 제거합니다. 그다음 인산염 완충 식염수로 세포를 5회 세척하고, 측정 전 실온에서 PBS로 최소 5분 동안 세포를 배양하십시오.아르곤 레이저로 488 nanometers 파장을 여기시키고 빔 스플리터 HFT 48을 사용합니다. 핀홀을 최소로 설정하고 오일 침수 40 x 대물렌즈를 사용하여 530 nanometers에서 형광 방출을 수집하며, 이때 롱패스 방출 필터 LP 5 0 5를 사용합니다. 챔버 슬라이드를 공초점 현미경의 스테이지 위에 놓고 세포가 융합된 영역을 찾습니다.다음으로, 마이크로 조작기를 움직여 유리 마이크로 피펫이 세포막에 45도 각도로 닿도록 배치합니다. 마이크로 조작기를 조작하여 유리 마이크로 피펫으로 단일 세포막의 1% 미만 영역을 짧게 접촉시켜 세포에 1초 동안 기계적 자극을 줍니다. 그런 다음 공초점 현미경을 사용하여 기계적 자극 이후의 칼슘 이온 농도의 공간적 변화를 측정하고 이미지를 수집하여 저장합니다.마지막으로, 공초점 현미경 소프트웨어를 사용하여 반응 세포의 전체 표면적을 정의하는 다각형 관심 영역을 그립니다. 소 각막 내피 세포의 대조군 조건에서 기계적 자극으로 유도된 칼슘 과도 현상이 대표적인 의사 색상 형광 이미지의 서로 다른 시점에 나타나 있으며, 첫 번째 이미지에는 자극 전의 형광 강도가 표시됩니다. 두 번째 이미지의 흰색 화살표는 기계적 자극을 받은 세포를 나타냅니다.칼슘 파동은 인접한 6개의 세포층으로 전파되며, 파동이 도달한 전체 세포 면적은 62, 870 µm²의 활성 면적을 나타냅니다. 선 그래프는 기계적 자극을 받은 세포(ms로 표시)의 정규화된 형광 값(NF)의 시간 경과와, 그래프에 MB 1에서 MB 5로 표시된 인접한 1~5번째 세포층의 NF 평균값을 보여줍니다. 이 이미지들은 외인성 뉴클레오타이드 처리 후(왼쪽 그래프)와 ecto nucleotide aase 억제제 처리 후(오른쪽 그래프) 세포 간 칼슘 파동의 확산에 나타나는 유의미한 변화를 더 자세히 보여줍니다. 구체적으로, 왼쪽 그래프는 소 각막 내피 세포에 외인성 Aras Aase 6 및 Aase 7을 처리했을 때 ATP와 ADP가 가수분해되어 주변세포 간 통신 경로가 억제됨으로써 활성 면적이 유의미하게 감소함을 보여줍니다.별표는 ace 존재 여부에 따른 P 값이 0.001 미만임을 나타냅니다. 오른쪽 그래프는 선택적 ecto 뉴클레오타이드 억제제인 A RL 6 7 1 56로 BCEC를 처리한 후 활성 영역이 유의하게 증가하여 pericrine 세포 간 통신 경로가 강화되었음을 보여줍니다. 별표는 a RL 존재 여부에 따른 P 값이 0.001 미만임을 나타냅니다. 숙달되면.이 기술을 적절하게 수행할 경우, 한 가지 조건의 실험 하나당 5분에서 10분 정도 소요됩니다. 서로 다른 조건들을 비교할 수 있는 전체 실험 시리즈를 수행하여 통계적 결론을 도출하는 데는 하루가 소요됩니다. 서로 다른 날에 수행하고 서로 다른 배치의 분리된 세포를 사용한 독립적인 실험들이 활용되어야 합니다.세포 내 칼슘 파동 전파를 측정하고 정량화함으로써 갭 결합 채널(gap junction channels) 및 헤미채널(HEMI channels)과 같은 다양한 결합 및 이소형의 세포 생물학적 조절을 식별하고 특성화할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 단독으로 사용되기보다 다이(dye) 전달부터 TP 방출 및 전기생리학에 이르는 다른 분자적 및 기능적 접근 방식과 상호 보완적으로 사용되어야 함을 강조하고자 합니다.

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 기사에서는 배양된 HL-1 심방 세포 단층에서 이중 채널 광학 매핑을 수행하는 데 사용되는 기술에 대해 설명합니다. 이 고유한 프로토콜을 사용하면 배양 단층의 전기생리학적 특성을 자세히 감지하고 분석하기 위해 동일한 영역에서 칼슘(Ca) 및 전압(Vm) 활성을 동시에 시각화할 수 있습니다.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

고해상도 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여, 마우스 뇌 심실 내에 위치 운동성 뇌실막 섬모의 고동의 생체 관찰은 실시간 이미징에 의해 입증된다. 이 기술은 고유의 섬모 박동 주파수의 기록 및 구타 각도뿐만 아니라 세포 내 칼슘 진동 페이싱 등록 할 수 있습니다.

마우스 뇌의 좌우 심실의 뇌실막 섬모의 라이브 영상

세균 mechanosensitive 채널은 생체 분자 장치에서 mechanoelectrical 트랜스 듀서로 사용할 수 있습니다. 물방울 인터페이스 이중층 (DIB의), 이러한 장치에 휴대 영감 빌딩 블록, 통합 및 mechanosensitive 채널을 자극하는 새로운 플랫폼을 나타냅니다. 여기서 우리는, DIB의 형성 기계적인 자극에서 mechanosensitive 채널의 연구를 허용하는 새로운 마이크로 피펫 기반 방법을 보여줍니다.

다기능, 물방울 인터페이스 이중층에서 세균 Mechanosensitive 이온 채널의 설립과 자극에 대한 방법을 마이크로 피펫 기반

소 각막 내피 세포의 일차 배양 각막 내피 간엽 전이의 메커니즘을 조사 하였다. 또한, 래트 각막 내피 cryoinjury 모델 생체 내 각막 내피 간엽 전환을 증명 하였다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

여기에서, 우리는 네오디뮴을 사용하여 Descemet의 막 (DM)에서 각막 내피 세포 (CEC)를 분리하는 프로토콜을 제시합니다:YAG (Nd:YAG) 레이저는 bullous 각화증 (BK)를 위한 전 생체 내병 모형으로.

각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발

이 프로토콜은 인간 또는 양 조직의 이식에서 각막 내피 세포 배양을 확립하고 성장하는 데 필요한 중요한 단계를 설명합니다. 각막 내피 세포를 membranous 생체 재료에 소양성하는 방법도 제시된다.

생체 재료 멤브레인에 인간과 양 각막 내피 세포 층의 성장

이 프로토콜은 간단하고 수행하기 쉬운 방법으로 세포의 세포 내 광학 바이오 변조를위한 실리콘 나노 와이어의 사용을 설명합니다. 이 기술은 다양한 세포 유형에 매우 적응력이 뛰어나며 생체 내뿐만 아니라 생체 내 응용 분야에도 사용할 수 있습니다.

실리콘 나노 와이어 및 세포 간 전기 커플링의 조사를위한 광학 자극

망막 보철물은 시각적 지각을 생성하는 능력이 있습니다. 새로운 보철물의 개발을 앞당기기 위해서는 이식 전에 장치를 테스트하기 위한 생체 외 방법이 필요합니다. 이 논문은 전기 자극을 받았을 때 망막 신경절 세포층의 칼슘 활성을 연구하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

전기적으로 자극된 평판 장착 망막의 칼슘 이미징

이 논문에서는 Fura-2/AM 염료를 사용한 단일 세포 Ca2+ 이미징을 사용하여 세포 내 칼슘 이온(Ca2+) 농도를 실시간으로 정량적으로 모니터링하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 효율적인 염료 로딩과 형광 강도 비율을 통한 Ca2+ 수준의 정확한 계산을 가능하게 하여 연구 응용 분야를 위한 간단하고 빠른 접근 방식을 제공합니다.

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

빛을 사용하여 심장 세포와 조직을 제어하면 비접촉 자극이 가능하여 세포의 자연 상태와 기능을 보존할 수 있으므로 기본 연구와 치료 응용 분야 모두에 유용한 접근 방식이 됩니다.

비유전적 광학 자극을 통한 Ca2+ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

학습하세요 소 각막 내피 세포에서 기계적 자극에 의한 칼슘 웨이브 전파를 측정하는 방법을 통해 세포 간 통신을 연구하는 기법입니다. 이 방법은 갭 정션 채널과 헤미채널의 특성을 비침습적으로 분석할 수 있습니다.

세포 단일 층의 기계적 자극에 의​​한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예

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