Name: RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas ( Apis mellifera) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T08:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprende a realizar el doble derribo génico en abejas melíferas y medir la percepción gustativa mediante el ensayo PER. Este método permite estudiar la función génica en redes regulatorias del comportamiento.

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Los autores desean agradecer a Erin Fennern para ayudar experimento. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de Noruega (180.504, 185.306 y 191.699), PEW Charitable Trust y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA P01 AG22500).

Parte 1: RNAi mediada desmontables de dos genes 1. dsRNA síntesis <ol><li> Diseño de cebadores dsRNAs dirigidos vg, USP y una proteína de control del gen que codifica la fluorescencia verde (GFP), que no está en la miel de abeja genoma: primers fueron diseñados utilizando software libre en línea Primer3 ( <a href="http://frodo.wi.mit.edu/" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/</a> ) . </li><li> síntesis de dsRNA para VG, USP y GFP: uso RiboMax T7 sistema de producción de ARN de Promega para la transcripción in vitro. </li><li> dsRNA purificación: <ol><li> Desnaturalización y renaturalización: el calor del dsRNA a 85 ° C durante 5 minutos y dejar enfriar a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Tratamiento con DNasa I: añadir 1 l de DNasa I en cada reacción de dsRNA y mezclarlas con un movimiento rápido de los tubos. Incubar durante 15 min a 37 ° C. </li><li> Añadir 150 l de agua libre de nucleasa y 750 l TRizol - LS en cada reacción y mezclar suavemente les invErting el tubo. Se incuban las muestras durante 5 min a 30 ° C. </li><li> Añadir 200 l de cloroformo a cada muestra. Mezclar enérgicamente durante 20 segundos. Centrifugar las muestras durante 15 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Transferir la fase sobrenadante de cada tubo nuevo y añadir 500 l de alcohol isopropílico en cada tubo. Mezclar invirtiendo el tubo. Incubar la mezcla durante 20 min a -20 ° C. Centrifugar durante 10 minutos a 12.000 xga 4 º C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y el uso de 1,000 l de etanol 75% para lavar el sedimento. Después de centrifugar el tubo durante 5 min a 7500 xg a 4 ° C, el aire seco del dsRNA de pellets, y el uso de agua libre de nucleasa para disolver el precipitado. Con el fin de garantizar la eficacia del gen de la regulación a la baja, la concentración de ARN de doble cadena debe estar alrededor de 9 -10 g / l. </li></ol></li></ol> 2. dsRNA inyección abdominal Por gen desmontables doble, hay dos estrategias: 1) una sola inyección: dsRNA mezcla de dos genes y Inject la mezcla; 2) de dos días de inyección: inyectar la primera orientación dsRNA un gen en el primer día, e inyectar el segundo ARN de doble cadena en las mismas abejas en el segundo día. <ol><li> Chill recientemente surgió abejas en un refrigerador 4 ° C durante 1-2 min. Cuando se inmovilizan las abejas, las abejas 3-4 montar en paralelo en placas de Petri llenas de cera sólida con alfileres de insectos cruzadas entre el abdomen y thoraces. </li><li> Enfríe las abejas de nuevo en un ° C refrigerador 4. Asegúrese de que las abejas son completamente inmóvil. Se tarda unos 1-2 min. Las abejas deben buscar suelto. Si las abejas se vuelven arrugadas o retorcida, significa que se enfrían demasiado tiempo que deben evitarse. Tiempo libre demasiado provoca una alta mortalidad, pero inmovilización completa es importante ya que cualquier movimiento aumenta el tamaño de la herida y la mortalidad. </li><li> Coloque una aguja desechable 30G (BD) en un micro jeringa Hamilton. Tome 3 l dsRNA y asegúrese de que no hay burbujas de aire en la jeringa. La aguja se introduce a un lado del abdomen para evitar la damaging órganos internos. Presione el émbolo de la jeringa lentamente para permitir que el ARN de doble cadena para ser absorbido. Desde dsRNA es muy viscoso, que se necesita 2-3 seg para ser completamente expulsado de la jeringa. Tras completamente empujando hacia abajo el émbolo, deje la aguja en la herida durante 4-5 segundos. Observar las abejas para 3-5 segundos después de las inyecciones. Si un hemolinfa fugas gotita de la herida, desechar la abeja. </li><li> Usar diferentes colores para marcar sus Thoraces correspondientes a diferentes tratamientos. En este punto, si se utiliza la estrategia de inyección única, las abejas pueden colocarse de nuevo en una colonia después de 1 hora de observación. Sin embargo, si se utiliza la estrategia de inyección de dos días, después de haber sido inyectados con la primera dsRNA, las abejas deben ser colocados en una jaula de malla de cilindro con miel suministrado en el lado y se mantuvieron en una incubadora a 34 ° C y 80% de humedad . </li><li> En el segundo día, siga los pasos 2.2 y 2.3 para relajarse de las abejas en las jaulas de malla y montarlos en placas de cera. Realizar inyecciones con la segunda dsRNA como es descricama en el paso 2.4. </li><li> Que las abejas se recuperan a temperatura ambiente durante 1 hora y los introducen en una colonia. </li></ol> Nota: efectos Desmontables pueden ser detectados por RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) y el Western Blot. En general, la eficacia de abatimiento varía y depende de muchos factores. En nuestro estudio, la caída de dos genes puede ser detectada 7 días después de las inyecciones individuales y las inyecciones de dos días. Parte 2: Ensayo de respuesta de extensión probóscide (PER) 1. Recopilación de las abejas de la colmena El día 6 después de las inyecciones, recoger las abejas tratadas de la colonia sin el uso de un fumador. Recoge las abejas en las jaulas de los cilindros de malla metálica. 3 Mantenga las abejas en cada jaula. 2. Abejas de montaje para PER Enfríe las abejas a 4 ° C hasta que estén completamente inmovilizados. Monte cada abeja verticalmente en un tubo de plástico especialmente diseñada para PER. Mantenga el abdomen dentro del tubo por using dos pequeños trozos de cinta, y mantener la cabeza que sobresale del tubo. Colocar los tubos en un bastidor con dos filas de pequeñas columnas de plástico, y asignar a cada tubo (abeja) con un número de identificación. Luego ponga las abejas tratadas en los bastidores en una incubadora (34 ° C y 80% de humedad) y mantenerlos en la incubadora durante 2 horas. 3. Preparar una serie de sacarosa Water Solutions Preparar 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% y 30% de sacarosa soluciones de agua y la carga de las soluciones en jeringas con agujas G 15-20. 4. Por ensayo Toque antena de la abeja con una gotita de solución de 0% (agua), seguido de 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% y 30% de agua soluciones de sacarosa. Pruebe todas las abejas con agua primero y deje por lo menos dos minutos, ya que el intervalo entre cada solución se utiliza. Por lo tanto, solemos tener al menos 20 abejas de cada ensayo. Si una abeja se extiende plenamente sus probóscide, se cuenta una respuesta positiva. 5.Gestión de datos Sume el total de respuestas positivas para cada individuo de la puntuación respuesta gustativa (GRS). Realizar un análisis estadístico adecuado de los datos. Parte 3. Validación derribo Gene Cuerpos gordos son disecados de otro conjunto de 7-días abejas tratados antiguos. Un procedimiento TRizol estándar se utiliza para la extracción de ARN, que es seguido por tratamiento con DNasa I 24. Vg y la expresión génica USP es analizada por un paso de dos QRT-PCR. Actina se usa como un gen de referencia, ya que tiene expresiones estables en diferentes tejidos de las abejas melíferas. Publicado cebadores de PCR en tiempo real para VG y usp gen se utilizan en el experimento 24. Los datos se analizaron mediante el uso de Delta-Delta método CT 25.

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No tenemos nada que revelar.

Nuestro estudio es el primer intento de tumbar al mismo tiempo dos genes en los insectos adultos. Nuestros resultados muestran que las dos estrategias de dsRNA inyecciones (inyección única y de inyección de dos días) son eficaces para la supresión génica doble, simultánea y silenciamiento de los genes de VG y la USP pueden ser probados 6 días después de las inyecciones de dsRNA en abejas 8,9. Sin embargo, el gen de la eficacia caída varía en las diferentes especies de insectos según el nivel...

Interferencia de ARN (ARNi) es basado en post-transcripcional silenciamiento génico de ARN, que se produce en una amplia variedad de organismos eucariotas. El proceso de ARNi se desencadena por precursores de ARN de doble cadena endógenos o exógenos (dsRNA). El ARN de doble cadena activa la proteína Dicer ribonucleasa que se une y corta el dsRNA a pequeños fragmentos (20-25 pb). A continuación, los pequeños fragmentos de la guía de dsRNA un reconocimiento y la escisión de los ARNm complementarios por las proteínas Argonaute, un componente de catalizador de complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) 1. En los mamíferos, ARN de doble cadena de más de 30 nt, activan una respuesta antiviral (respuesta de interferón, IFN) que conduce a la degradación no específica de transcripciones de ARN 2. Sin embargo, ARN de doble cadena larga han demostrado ser eficaces y específicos en los insectos ya que existe una falta de este IFN 3. DsRNAs han sido utilizados para la regulación a la baja de los genes diana de diferentes especies de insectos. Las abejas son uno de los pionorganismos de insectos eer en el que las funciones de muchos genes importantes en el desarrollo y el comportamiento se han puesto de manifiesto mediante el uso de ARN de doble cadena 4,5. Varios métodos de entrega dsRNA se han realizado en las abejas melíferas: dsRNA alimentación regula a la baja de manera eficiente expresión del gen diana en la miel larvas de abeja 6, mientras que la inyección de dsRNA es un método eficaz para la caída de genes en embriones de abejas 4 y abejas adultas 7,8. Efectos de derribo Gene exhibidos por la aplicación de dsRNA a los insectos son transitorios y localizados. Los estudios han demostrado que ambas inyecciones dsRNA abdominales y torácicos inyecciones dsRNA suprimen eficazmente la expresión de genes diana en las células abdominales de grasa corporal de los insectos 9,10. DsRNA se inyecta en las cavidades abdominales y torácicas y las células de grasa corporal son capaces de asumir el dsRNA de la hemolinfa donde las células están bañadas 10. Sin embargo, los genes en otros órganos, como los ovarios y el cerebro, no pueden ser dirigidos por cualquierainyecciones abdominales o torácicas. Con el fin de orientar los genes en la miel de abeja cerebro, también se ha realizado la inyección de dsRNA cerebro, lo que influye efectivamente expresión del gen diana en las zonas locales del cerebro 11. Aquí, sólo documentamos dsRNA inyección abdominal que es más comúnmente utilizado en las abejas adultas. ARNi ha sido utilizado principalmente para llegar a un solo gen y ha sido una herramienta poderosa para revelar la función del gen. Sin embargo, cualquier gen no está aislado de los demás, es en redes reguladoras complejas. Una clave para entender un proceso biológico es diseccionar cómo los genes interactúan entre sí, lo que requiere manipulaciones simultáneas de múltiples genes en lugar de un único gen desmontables. En líneas celulares de mamíferos, los científicos han logrado inhibir simultáneamente dos o tres genes mediante el uso de sistemas de suministro de 12 o multi-microRNA (miRNA) diseños horquilla 13. Pero en los insectos, múltiples caídas de genes todavía no probado. En este sentido, Presenestrategias de inyección diferentes t que puede alcanzar una caída de dos genes. Nos dirigimos a dos genes: vitelogenina (VG) que codifica un precursor de proteína de yema de huevo, y ultraspiracle (USP) que codifica un receptor putativo de la hormona juvenil (JH) y puede servir como un factor de transcripción mediación de las respuestas a JH 14 en las abejas de miel. Vg y JH regulan entre sí en un circuito de retroalimentación 15 y están involucrados en la miel de abeja comportamiento regla 9. Con el derribo de dos genes, nos perturban tanto Vg y las vías de JH, y descubrir cómo afectan conjuntamente comportamiento de las abejas de miel y la fisiología y cómo vg, USP y JH interactúan 9. Percepción gustativa es un predictor del comportamiento de la miel de abeja comportamiento social 16. En términos de desarrollo de comportamiento, las abejas nido con alta percepción gustativa conducta madura rápido, y por lo general forraje temprano en la vida y prefieren recoger el polen 16,17. Aunque m reglamentarioechanisms subyacen a la percepción gustativa aún no están claros, los estudios han demostrado que la percepción gustativa está relacionada con metabolismos energéticos internos 9, la secreción hormonal 18,19 y biogenética amina dirigen a las vías 20. Tanto Vg y JH son importantes reguladores hormonales modulación de la percepción gustativa 7,21. En el laboratorio, una variación de la percepción gustativa en las abejas de miel puede ser evaluada probando la respuesta de extensión proboscis (PER) a diferentes soluciones de sacarosa. Cada abeja se prueba tocando tanto sus antenas con una gotita de agua, seguido por una serie ascendente concentración de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% de sacarosa. Una respuesta positiva se observó si una abeja se extiende completamente sus trompa cuando una gota de agua o sacarosa se toca para cada antena. Basado en el número de respuestas positivas a las soluciones, el nivel de la percepción gustativa de cada individuo se puede determinar 16. Sin embargo, la aplicación del POR no está limitada a la medición de gpercepción ustatory. El PER es también un método eficaz para poner a prueba el estado metabólico de las abejas, tales como el hambre saciedad vs. Las abejas con una mayor respuesta a la sacarosa tienen más hambre en general (Wang y Amdam, datos no publicados). Por otra parte, el paradigma POR también se puede utilizar en el aprendizaje y la memoria asociativa en las abejas de miel. En este caso las abejas serán entrenados para asociar la presencia de agua de sacarosa con un olor. Cuando las abejas aprenden la asociación, sólo la presencia del olor puede evocar una respuesta positiva trompa sin recompensar con la sacarosa 22,23. En este vídeo, se muestra cómo realizar PER para evaluar la percepción gustativa que se ha conectado con vg y usp doble caída en un estudio anterior 9.

<table><tbody><tr><td>Bolas de PCR de GE Healthcare en placa de 96 pocillos</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9557-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>RiboMax T7 Sistema de producción de ARN</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo:Alcohol isoamílico 24:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>alcohol isopropílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Micro jeringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>80301</td><td></td></tr><tr><td>30G BD agujas desechables</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Jeringa</td><td>BD Biosciences</td><td>30960</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección estereoscópica</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6D</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres de insectos</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td><td></td> de cera</tr></tbody></table>

rnai mediada doble derribo gene y medición percepción gustativa de las abejas (<em&gt; apis mellifera</em&gt;)

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

Este vídeo muestra novedosas técnicas de interferencia de ARN (RNAi), que regulan negativamente dos genes simultáneamente en las abejas que utilizan inyecciones de ARN de doble cadena (dsRNA). También se presenta un protocolo de respuesta de extensión proboscis (POR) de ensayo para la medición de la percepción gustativa. RNAi mediada desmontables gen es una técnica eficaz disminuyendo la expresión del gen diana. Esta técnica se utiliza generalmente para la sola manipulación genética, pero tiene limitaciones para detectar las interacciones y los efectos conjuntos entre genes. En la primera parte de este video, se presentan dos estrategias para tumbar al mismo tiempo dos genes (llamados genes desmontables dobles). Mostramos ambas estrategias son capaces de suprimir de forma eficaz dos genes, vitelogenina (VG) y ultraspiracle (USP), que están en un bucle de retroalimentación reguladora. Este enfoque caída doble gen se puede utilizar para diseccionar interrelaciones entre los genes y se puede aplicar fácilmente endiferentes especies de insectos. La segunda parte de este video es una muestra de ensayo de respuesta de extensión probóscide (PER) en las abejas de miel después de que el tratamiento de la caída de dos genes. El ensayo PER es una prueba estándar para medir la percepción gustativa de las abejas, que es un indicador clave de la rapidez con la maduración del comportamiento de una abeja es. Mayor percepción gustativa de las abejas nido indica el creciente desarrollo de la conducta que a menudo se asocia con una edad más temprana de inicio de la búsqueda de alimento y forraje especialización en el polen. Además, por ensayo se puede aplicar para identificar estados metabólicos de saciedad o hambre en las abejas de miel. Por último, por ensayo en combinación con el emparejamiento diferentes estímulos de olor para el acondicionamiento de las abejas también es ampliamente utilizado para el aprendizaje y la memoria en los estudios de las abejas de miel.

Tanto los dos días de la inyección estrategias de inyección única y redujeron significativamente vg (One-way ANOVA, p &lt;0.001) (Figura 2A) y USP (One-way ANOVA, p &lt;0.001) (Figura 2B), los niveles de transcripción en las abejas de miel seis días después de la dsRNA se inyectó. La supresión de la USP transcripción mediante el uso de la inyección única con la mezcla de ARN de doble cadena y la inyección de dos días con VG primera y segunda USP (...

En este protocolo, se describen dos estrategias que simultáneamente suprimen dos genes (genes desmontables doble) en las abejas de miel. A continuación te presentamos cómo utilizar la respuesta de extensión probóscide (PER) de ensayo para estudiar el efecto de la caída de dos genes de la miel de abeja percepción gustativa.

RNAi mediada Doble derribo Gene y medición percepción gustativa de las abejas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Este protocolo en video demuestra técnicas novedosas para silenciar simultáneamente dos genes en abejas melíferas adultas y luego realizar un ensayo de respuesta de extensión del probóscide o PER para medir el efecto del silenciamiento doble de genes sobre la percepción gustativa de las abejas. Esto se logra primero mediante la síntesis de ARN bicatenarios, dirigidos contra los genes que codifican tres proteínas: vitelina, genina, ultras, esférica y la proteína verde fluorescente.Dado que el gen que codifica la GFP no se encuentra en el genoma de la abeja melífera, el ARN bicatenario de GFP sirve como control negativo. El segundo paso consiste en inyectar ARN bicatenario en abejas melíferas utilizando cuatro estrategias de tratamiento. Inyección con ARN bicatenario de GFP, solo ARN, una inyección única con una mezcla de ARN bicatenario de VG y USP, inyección con ARN bicatenario de vg el primer día, seguida de inyección con ARN bicatenario de USP el segundo día, e inyección con ARN bicatenario de USP el primer día, seguida de inyección con ARN bicatenario doble de VG el segundo día. Después de las inyecciones, se marcaron las abejas con puntos de pintura codificados por colores correspondientes a los tratamientos y se devolvieron a una colmena.Seis días después, la inhibición génica de VG y USP en las abejas tratadas se valida mediante PCR en tiempo real y el efecto de la doble inhibición de VG y USP sobre la percepción gustativa se determina mediante el ensayo de PER. En última instancia, se demuestra que las abejas con doble inhibición presentan reducciones significativas en la expresión de los genes VG y USP, así como aumentos significativos en la percepción gustativa frente a la sacarosa. Nuestra interferencia constituye una herramienta potente que podemos utilizar para revelar funciones génicas.Por lo general, se utiliza para dirigirse a un solo gen. Sin embargo, los genes forman parte de una red reguladora compleja. Una forma de comprender mejor cualquier proceso biológico es aprender cómo los genes interactúan con la red génica.Para hacer esto, debemos manipular múltiples genes al mismo tiempo. Hasta ahora, solo habíamos podido silenciar un gen a la vez en insectos; aquí, por primera vez, queremos mostrarles cómo silenciar dos genes en abejas melíferas en lugar de uno. El reflejo de extensión del cogullo (REC) es una técnica muy útil para medir la percepción gustativa, que es un indicador conductual del comportamiento social de las abejas melíferas.Por ejemplo, las abejas nido con alta percepción gustativa maduran rápidamente desde el punto de vista conductual, comienzan a forrajear temprano en la vida y prefieren recolectar polen. Para iniciar este procedimiento, diseñe cebadores de ARN bicatenarios que dirijan los genes para su silenciamiento utilizando el software gratuito primer.Three. En este experimento, los dos genes objetivo para el silenciamiento son vitelli, genin o VG y ultras esférico o USP.Además del diseño de cebadores para VG y USP, se utilizan cebadores de ARN bicatenario que dirigen un gen control que codifica la proteína verde fluorescente, o GFP, la cual no se encuentra en el genoma de la abeja melífera. Posteriormente, la síntesis de ARN bicatenario para VG, USP y GFP se lleva a cabo mediante transcripción in vitro utilizando el sistema de producción de ARN T siete rib max de Promega.Después de purificar los ARN bicatenarios utilizando procedimientos estándar, disuelva cada precipitado de ARN bicatenario en agua libre de nucleasas para asegurar la eficacia de la inhibición génica; la concentración de ARN bicatenario debe estar alrededor de nueve a 10 microgramos por microlitro. Para preparar las abejas para la inyección, enfríe las abejas recién emergidas en un refrigerador a cuatro grados Celsius durante uno o dos minutos. Una vez que las abejas estén inmovilizadas, sujete tres o cuatro abejas en paralelo sobre placas de Petri llenas de cera sólida con alfileres entomológicos cruzados entre sus abdomens y tórax.Enfríe las abejas nuevamente en un refrigerador de cuatro grados Celsius durante aproximadamente uno a dos minutos. Asegúrese de que las abejas estén completamente inmóviles. Las abejas deben verse relajadas, sin estar encogidas ni retorcidas.La inmovilización completa es importante, ya que cualquier movimiento podría aumentar el tamaño de la herida y la mortalidad. Las abejas que están encogidas o contorsionadas han sido enfriadas durante demasiado tiempo y no deben usarse debido a la alta mortalidad. Coloque una aguja desechable de calibre 30 en una jeringa microsiringa Hamilton.Llene la jeringa con tres microlitros de ARN bicatenario y asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa. Si se utiliza una estrategia de inyección única, la jeringa se llena con una mezcla de los ARN bicatenarios de los dos genes. Si se utiliza una estrategia de inyección en dos días, la jeringa se llena con uno de los dos ARN bicatenarios.Introduzca la aguja en un lateral del abdomen. Para evitar dañar órganos internos, presione lentamente el émbolo de la jeringa para permitir que el ARN bicatenario sea absorbido. Dado que el ARN bicatenario es muy viscoso, se necesitan de dos a tres segundos para expulsarlo completamente de la jeringa.Después de presionar completamente el émbolo, deje la aguja en la herida durante cuatro a cinco segundos. Observe las abejas durante tres a cinco segundos después de las inyecciones. Si una gota de hemolinfa sale por la herida, deseche la abeja y marque el tórax de las abejas con diferentes colores que correspondan a los distintos tratamientos.En este momento, si se utiliza la estrategia de inyección única, observe las abejas durante una hora en un recipiente con miel suministrada, luego devuélvalas a una colonia. Sin embargo, si se emplea la estrategia de inyección de dos días y solo se ha inyectado el primer ARN de doble cadena, coloque las abejas en una jaula de malla cilíndrica con miel suministrada en el lateral. Mantenga las abejas en un incubador a 34 grados Celsius y 80 % de humedad durante la noche y el día siguiente.Inyecte las mismas abejas con el segundo ARN bicatenario, utilizando el mismo procedimiento que para el primer ARN bicatenario. Deje que las abejas se recuperen a temperatura ambiente durante una hora en un recipiente con miel disponible, y luego introdúzcalas en una colonia. Seis días después de las inyecciones, recolecte las abejas tratadas de la colonia sin usar ahumador para abrir la colmena.No se utiliza humo porque podría afectar la percepción gustativa de las abejas, que será evaluada en este procedimiento. Recolecte abejas en jaulas cilíndricas de malla metálica utilizando pinzas suaves, con no más de tres abejas por jaula para montarlas. Para el ensayo de PER.Enfríe las abejas a cuatro grados Celsius hasta que estén completamente inmovilizadas. Coloque cada abeja verticalmente dentro de un tubo de plástico, diseñado especialmente para PER. Utilice cinta adhesiva para mantener el abdomen dentro del tubo y dejar la cabeza sobresaliendo del tubo.Coloque los tubos en un soporte con dos filas de columnas de plástico pequeñas. Una fila está numerada para que las abejas montadas puedan asignarse un número de identificación. Coloque los soportes con las abejas tratadas en un incubador a 34 grados Celsius y 80% de humedad durante dos horas mientras las abejas están incubando.Prepare una serie de soluciones acuosas de sacarosa. Cargue las soluciones en jeringas con agujas de calibre 15 a 20 para el ensayo PER.Las abejas se prueban en grupos. Primero, toque la antena de cada abeja con una gota de solución al 0%, que es agua, y después pruebe con sacarosa al 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% y 30%. Use soluciones acuosas, dejando al menos dos minutos de intervalo entre cada solución.Por lo general, se tardan aproximadamente dos minutos en probar 20 abejas utilizando una concentración de sacarosa. Por lo tanto, siempre debe haber más de 20 abejas en cada grupo. Si una abeja extiende completamente su probóscide, se cuenta una respuesta positiva en tiempo real.El análisis de PCR confirmó que tanto la estrategia de inyección única como la de inyección durante dos días redujeron significativamente los niveles de transcritos de Fiji y USP en abejas melíferas. Seis días después de la inyección de ARN bicatenario, en estos gráficos, el RQ indica el nivel de cuantificación relativa de los transcritos del gen diana y las diferentes letras sobre las barras denotan diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. El análisis posterior reveló que la supresión del transcrito de USP mediante la inyección única con una mezcla de ARN bicatenario y la inyección durante dos días con VG primero y USP segundo fue significativamente menor que la inyección durante dos días con USP primero y VG segundo.Esto indica que VG podría ser un regulador primario en el bucle regulador de VG y la hormona juvenil. Los puntajes de respuesta a GUA o GRS para las abejas tratadas se calcularon a partir de los resultados del ensayo de respuesta de extensión del probóscide o PER, como se muestra aquí. El GRS en las abejas que fueron inyectadas con una mezcla de ARN bicatenario de VG y USP fue significativamente mayor que el GRS en las abejas control GFP, lo que indica que las abejas con doble silenciamiento fueron más sensibles a la sacarosa.Las diferentes letras sobre las barras indican diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. Aquí se muestra una posible red reguladora entre vi genin ultras, esférico y la hormona juvenil revelada mediante la supresión simultánea de los genes VG y USP. Mientras que una inhibición individual de USP no induce ningún cambio en la hormona juvenil, una doble inhibición de VG y USP provoca un mayor aumento en la hormona juvenil que una inhibición individual de VG.Esto sugiere que vitelli no solo inhibe la producción de la hormona juvenil, sino que también inhibe una respuesta de retroalimentación de la hormona juvenil al silenciamiento de USP. En los dobles silenciamientos, el aumento dramático de la producción de la hormona juvenil resulta de una inhibición reducida por parte de VI genin causada por el silenciamiento de VG y de una respuesta compensatoria ante una transducción reducida de la hormona juvenil provocada por el silenciamiento de USP. En el texto del protocolo adjunto se encuentra una discusión más detallada de esta red reguladora.Mediante el uso de un enfoque de doble silenciamiento génico, hemos revelado una relación detallada entre los genes vitales genic, ultras, spherical y la hormona juvenil, que no habríamos descubierto mediante la supresión de solo un gen. Ahora, utilizando esta técnica, los investigadores pueden explorar la interrelación entre genes dentro de redes reguladoras. La PR es un método estándar empleado para medir la percepción gustativa en abejas melíferas; sin embargo, es muy sensible al manejo, por lo que se debe tener mucho cuidado para mantener la consistencia entre el entorno y el manejo de los animales.Además, si el ensayo se va a realizar durante varios días, es recomendable mantener una línea de tiempo breve y estar atento para asegurarse de que el clima y el entorno no cambien.

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