Name: 신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: 배우세요 형광 현미경을 이용한 효모 단일 세포 시간 경과 영상 촬영 및 계보 추적 방법입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동안 전사율 변화를 분석하여 유전자 발현 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 소프트웨어에 대한 의견을 에밀리 잭슨, 여호수아 Zeidman, 그리고 니콜라스 렌 감사합니다. 이 작품은 GM95733 (NM)로, BBBE 103316와 MIT 시작 기금 (NM까지)에 의해 재정 지원되었다.

<ol><li>Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li>
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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

위의 프로토콜은 마이크로 유체 또는 소프트웨어 개발에 대한 경험과 형광 시계열 데이터를 확보하고 분석하는 간단한 방법을 설명합니다. 그것은 하나의 단일 효모 세포의 시간 경과 형광 영화를 얻을 수 있습니다, 부목사 추적 및 계보 할당; 해당 셀 크기와 표현 측정을 추출하고 상업적으로 이용 가능한 미세 배양 장치를 사용하여 시간과 다양한 그래픽 사용자를 통해 전체 세포의 동작을 분석 인터페이스 (GUI). 실험, 분할 및 추적 단계는 다양한 방법으로 이전 11,13,14으로 접근하고 있지만, 위의 절차는 생물학 사회의 광범위한 집합에 이러한 기술에 더 쉽게 액세스 할 수 있도록 설계되었습니다. 위의 절차가 특정 미세 배양 장치에 최적화되어 있지만, 전반적인 분석은 저렴하고 더 정의가 기성 미세 배양 기술로 유사한 장치에 적용 할 수 있습니다. fundam을entally, 우리는 고용 분할 및 지역 측정 알고리즘은 기존의 방법 13,14 비슷하지만 이식 소프트웨어는 시각적 영역 추적 및 계보...

유전자 발현의 단일 세포 분석은 유전자 조절의 여러 측면에 대한 우리의 이해를 발전한있다. 유동 세포 계측법 또는 현미경을 사용하여 형광 기자 표현식의 정적 스냅 샷은 단일 셀 표현의 분포에 대한 유용한 정보를 제공하지만, 역사와 직접적으로 유전자 발현 역학을 통보하는 데 필요한 시간 시리즈 데이터의 진화를 부족합니다. 형광 시간 경과 현미경 단일 세포 측정 및 그들의 역사를 모두 얻을 수있는 수단을 제공합니다. 다양한 실험 및 분석 기술은 따라서 이러한 휴대 전화의 변화 2,3, 세균 persister 형성 4, 전사 등의 유전자 조절 기능에 대한 통찰력을 (검토를 위해 1 참조) 부여, 형광 기자 식의 영화를 획득하고 정량화하기 위해 개발되었습니다 시작과 신장 5, 6,7 파열 전사, 세포주기 의존 8,9, 및 유전 10. 그러나 OBTaining 품질의 단일 세포 형광 시계열 배양에서 상당한 기술적 도전 제어 환경에서 획득 한 형광 영화의 높은 처리량 정량에있는 세포의 단일 층을 포함한다. 여기에, 우리는 S의 형광 영화를 획득하고 분석하는 절차를 설명 세포 배양 장치 제조 또는 소프트웨어 개발없이 필요한 경험 (그림 1) cerevisiae의. 첫째, 우리는 당신에게 세부 사항을 예를 들어 프로토콜을 하나 이상 형광 기자를 표현 신진 효모에 대한 형광 시계열 영화를 생성합니다. 사용자 정의 미세 배양 챔버를 구축하고 성공적으로 이전 11-13 사용되어 왔지만, 우리는 CellAsic (헤이워드, CA)에서 상업적으로 이용 가능한 미세 유체 장치를 사용하십시오. 시스템 경계 단층 성장 세포의 관류 환경을 지속적으로 제어 할 수 있습니다. 우리가 제시 현미경 프로토콜은 fluoresc를 얻을 수있는 간단한 방법입니다레퍼런스 신진 효모의 영화,하지만 수정 된 실험 프로토콜 (사용자 정의 문화 장치, 대안 미디어의 조건 등.) 단일 효모 세포의 유사 형광 동영상 데이터를 산출로 대체 할 수 있습니다. 다음으로, 우리는 시계열 데이터를 추출하는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 기반 MATLAB에서 소프트웨어 패키지 (매스 웍스, 틱, MA), 형광 시계열의 신속한 분석 (이식)에 대한 GUI 별명을 사용하여 영화의 분석을 설명 단일 세포. 이식 세포를 분할 및 추적과 형광 강도 및 형상 정보를 추출에서 다양한 오픈 소스 소프트웨어 패키지 셀 ID (14)와 유사한 기능을 가지고 있습니다. 그러나 이식은 중요한 추가 기능을 제공합니다. 첫째, 세분화 및 데이터의 정확성보다는 분석 후 국외자 지역 트레이스 단지 통계 게이트를 확인하기 위해 추적 결과를 쉽게 대화 형 편집을 제공합니다. 또한, 그것은 automaticall에 분석을 확장Y 지명 한 계보와 신진 효모의 관심의 세포주기를 가리 킵니다. 어머니와 딸은 두 개의 독립적 인 셀 영역을 형성하기 위하여 분할하는 경우 결정하는 전체 세포 (연결된 새싹을 포함한 어머니) 세포주기 8에 걸쳐 측정을 결정하는 매우 중요합니다. 제품군은 이러한 작업을 수행하기 위해 3 개의 모듈로 구성되어 있습니다. 집중과 산만 시야 이미지 사이의 대비를 기반으로하며 첫 번째 세그먼트 셀 영역은 사용자가 분할 매개 변수를 정의하고 시각적으로 테스트 할 수 있습니다. 초 (.에서 제공 블레어 크로커 등 IDL 루틴 듀프 레인의 MATLAB 구현을 사용하여 : 트랙 <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> )과 시간을 통해 셀 영역을 측정, 자동 계보를 할당하고, 육안 검사를 수 및 오류 수정. 간단한 플로팅 GUI는 쿼리를 단일 셀 속성에 포함되어 있습니다. 세 번째 모듈은 꽃 봉오리 출현과 분열 티타늄을 돌린다MES, 및 전체 세포의 시계열 데이터뿐만 아니라 그들의 첫 번째와 두 번째 시간 미분을 (같이 9에서 설명)를 출력합니다. 분석 모듈은 선택의 통계 소프트웨어의 후속 연구를위한 공백으로 구분 된 텍스트 파일로 데이터를 출력합니다. 따라서, 패키지는 사용자가 그래픽 인터페이스를 통해 높은 품질의 시계열 데이터를 추출 할 수 있습니다. 우리는 세포주기 9의 함수로 하나의 신진 효모 세포에서 실시간 녹음 속도를 추정하기 위해이 방법을 사용했습니다. 모듈이 싹 트는 효모, 매개 변수 또는 최적화되어 있지만, 필요한 경우, 자유롭게 사용할 코드는 다른 생물 및 이미지 유형에 적용 할 수 있습니다. 분할, 추적, 혈통 할당 알고리즘은 할당 된 이미징 및 문제 유기체의 유형에 해당 할 수 있습니다. 기존의 알고리즘은 대체하지만 여전히 사용자 친화적 인 육안 검사와 분할의 보정 변함 occu 추적 오류를 허용하는 GUI 인터페이스를 유지 할 수어떤 알고리즘 연구.

<table><tbody><tr><td>Y04C 효모 관류 플레이트</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX 미세유체 관류 플랫폼</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Cascade II EMCCD 카메라</td><td>광량</td><td></td><td></td></tr><tr><td>루멘 200 메탈 할라이드 아크 램프</td><td>PRIOR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>삼중 대역 통과 이색성 필터 큐브 및 여기 및 방출 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>세트 #89006</td><td>YFP(Venus/Citrine), CFP(Cerulean), RFP(mCherry/tdTomato)</td></tr><tr><td>MAC 5000 컨트롤러 및 필터 휠</td>에 사용 <td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>64비트 버전은 32비트보다 대용량 데이터 파일을 더 잘 처리합니다.</td></tr></tbody></table>

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

형광 시간 경과 현미경은 단일 세포 수준에서 많은 생물학적 과정의 연구에 강력한 도구가되고있다. 특히, 유전자 발현의 시간적 의존성을 묘사하는 영화는 규제의 역학에 대한 통찰력을 제공하지만, 단일 세포의 형광 영화를 획득하고 분석하는 많은 기술적 과제가있다. 우리는 여기에서 이러한 데이터를 생성하는 상업적으로 이용 가능한 미세 배양 장치를 사용하여 간단한 프로토콜 및 MATLAB 기반의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 기반의 소프트웨어 패키지 형광 이미지를 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 소프트웨어 세그먼트와 트랙 세포는, 사용자가 시각적으로 데이터의 오류를 부젓가락 할 수 있도록, 자동으로 혈통과 분열 시간을 지정합니다. GUI는 또한 전체 셀 추적뿐만 아니라 첫 번째와 두 번째 유도체를 생산하는 시계열을 분석합니다. 소프트웨어는 S.를 위해 설계되었습니다 동안 cerevisiae의 그 모듈과 다양성은 그것에게 t을 허용해야몇 가지 수정을 다른 세포 유형을 공부하는 플랫폼 역할을 O를.

성공적으로 수행하고 분석 실험은 현실적으로 할당 봉오리 출현과 분열 시간을 갖는 단일 전체 셀에 대한 대부분의 연속적인 시계열을 얻을 것입니다. 예를 들어, 우리는 성장과 글로벌 식 단세포 시간 (표 4, Y47에 다를 수 있습니다 방법을 관찰하기 위해 제정 ADH1 프로모터에 의해 구동 리안 형광 단백질의 통합 사본 (CFP)를 표현하는 반수체 효모 균주 위의 프로토콜을 수행 ). 우리는 시간이 지남에 따라 (그림 7A) 측정 전체 셀을 얻기 위해 시계열 분석을 실행하고, 9 발견 세포주기에 의존 볼륨과 표현 모두 나온다. 단백질 농도, 또는 평균 강도가 약간 (그림의 7B 및 7C) 감소하면서 봉오리 형성 한 후, 총 결합 된 볼륨 (어머니 + 새싹) (8,16와 일치) 더 빨리 봉오리 출현 이전보다 증가합니다. 결합 INTEGRA 상승테드 단백질 (이 경우 볼륨...

우리는 형광 성장 효모 세포의 현미경 영화, 단일 셀 시계열 데이터를 추출하는 GUI 기반의 소프트웨어 패키지를 얻을 수있는 간단한 프로토콜을 제시한다. 분석은 자동화 혈통과 육안 검사 및 추적 데이터를 수동으로 큐 레이션과 통합 부문 시간 할당을 포함합니다.

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

이 절차의 전반적인 목표는 성장하는 단일 효모 세포의 형광 영상을 얻고, 각 세포에 대한 리포터 발현 시계열 데이터를 추출하는 것입니다. 이는 먼저 미세유체 챔버에서 세포 단층을 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 하나 이상의 리포터에 대해 타임랩스 형광 현미경 관찰을 수행하는 것입니다.다음으로, graft 소프트웨어 패키지를 사용하여 영상을 처리함으로써 시간에 따른 세포를 추적하고 측정합니다. 마지막 단계는 세포 측정값과 계통 할당을 분석하고, 각 전체 세포에 대한 리포터 발현 시계열 데이터를 내보내는 것입니다. 최종적으로, 발현 시계열로부터 추론된 순간 전사 속도를 통해 세포 주기 동안의 전사 변화와 전사 인자 수준 변화에 따른 전사 변화를 보여줍니다.이 방법은 활성 전사 인자의 갑작스러운 추가 또는 제거에 대해 서로 다른 프로모터가 얼마나 빠르게 반응하는지와 같이 유전자 조절 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 세포 집단 전반에서 이러한 반응은 얼마나 가변적이며, 형태 및 세포 주기 단계를 포함한 서로 다른 세포 특성이 반응에 어떤 영향을 미칩니까? 또한, 이 방법은 활성 전사 인자의 반복적인 추가 및 제거가 유전자 발현에 미치는 영향을 조사할 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 마이크로플루이딕 장치에 로딩하기에 적합한 밀도로 영양분이 풍부한 정상 상태에서 성장시킨 효모 세포를 준비합니다. 그다음, Cell ASIC 사의 Y04C 마이크로플루이딕 배양 플레이트를 준비합니다. 운송 용액을 제거한 후 멸균수로 웰을 헹굽니다. Onyx perfusion system을 사용하여 1번부터 6번 웰까지 6 PSI로 5분 동안 물을 흘려 채널을 세척한 다음, 로딩 웰 8번부터 6 PSI로 10초 동안 흘려줍니다. 모든 웰에서 물을 제거하고, 유입 웰 1번부터 6번까지는 250 µL의 SC 배지로, 세포 로딩 웰에는 준비된 세포 배양액 50 µL로 교체합니다.Onyx 매니폴드를 플레이트에 밀봉한 후, Inlet Well 1번부터 6번까지 6 PSI의 압력으로 2분 동안 유체를 흘려 채널과 배양 챔버를 프라이밍합니다. 이어서 초기 배지가 담긴 inlet well에서만 최소 5분 동안 유체를 흘립니다. 현미경 단계 전까지 6 PSI로 이를 계속해서 흘려줍니다. 데이터 분석 시 세포 추적 성능을 향상시키기 위해, 실험 도중 플레이트가 움직이지 않도록 스테이지 마운트에 플레이트를 테이프로 고정

acquiring-fluorescence-time-lapse-movies-budding-yeast-analyzing

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연구

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생물학

유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을...

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

우리는 핵분열 효모 성 수명 주기의 장기 현미경을 위한 재현 가능한 기본 방법을 제공합니다. 설명된 사소한 조정과 함께 제시된 프로토콜은 생식 과정의 여러 단계에 대한 연구의 초점을 맞출 수 있도록 합니다.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

소포 수송 이벤트의 정확한 정량화는 종종 특정 단백질의 역할과 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 논문은 정량적 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 세포내 이벤트를 정량화하기 위한 도구로 pH에 민감한 GFP 변이체인 초황도 pHluorin을 사용하는 방법을 제시합니다.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

이 문서에서는 마이크로 유체 칩의 생산과 수명 및 단일 효모 세포의 세포 표현형을 측정하는 미세 유체 실험의 설정에 최적화 된 프로토콜을 제공한다.

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

효모 신진 인해 강력한 유전학과 미세 소관 세포 골격의 단순함에 생체 내 미세 소관 역학 연구를위한 유리한 모델입니다. 다음 프로토콜 변환 및 문화 효모 세포, 공 초점 현미경 이미지를 수집하고, 정량적으로 효모 살아있는 세포에서 미세 소관 역학을 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

이 프로토콜은 다중 색상 4D (타임 랩스 3D) 공초점 현미경을 사용하여 신진 효모에서 형광 표지 된 세포 내 구획의 분석을 설명합니다. 이미징 매개 변수는 광손상을 제한하면서 적절한 신호를 캡처하도록 선택됩니다. 사용자 정의 ImageJ 플러그인은 레이블이 지정된 구조를 추적하고 정량적으로 분석할 수 있도록 합니다.

효모의 4D 현미경 검사법

여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

핵분열 효모는 FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질을 GFP와 함께 번역 융합 단백질로 발현하여 중합을 시각화하는 이종 숙주로 사용됩니다. 또한 중합에 영향을 미치는 화합물은 형광 현미경을 사용하여 이미징하여 식별합니다.

박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 항균 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서의 핵분열 효모

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

배우세요 형광 현미경을 이용한 효모 단일 세포 시간 경과 영상 촬영 및 계보 추적 방법입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동안 전사율 변화를 분석하여 유전자 발현 역학을 연구하는 데 활용됩니다.

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

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