Name: 인간의 3 차원의 조직 공학 시험관 종양 테스트 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-06T08:56:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 배우세요 3D 종양 조직 공학 기법을 사용하여 BioVaSc에서 인간 원발 세포로 종양 모델을 구축하는 방법을. 정적 및 동적 배양 조건에서 생체 내 종양 환경을 정확히 모사하여 암 연구에 기여합니다.

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저자는 생물 반응기와 생물 반응기 인큐베이터를 개발하기 위해 자신의 기술 지원을 위해 월 Hansmann (프라운호퍼 IGB, 슈투트가르트) 감사의 말씀을 전합니다.

1. BioVaSc의 탈세 포화 <ol><li> 유관 동맥 액세스 및 PBS와 창자 루멘을 통해 돼지의 jejunal 세그먼트의 혈관 시스템을 씻어 -. 완전히 깨끗해질 때까지 반복합니다. </li><li> 4 어댑터 직경 200 mm의 유리 탱크를 준비하고 연동 펌프 (Ismatec)에 실리콘 튜브를 통해 연결합니다. 부를 제어 압력은 멸균 일회용 돔 (도 1 참조)에 연결되는 압력 센서를 통해 모니터링 할 수있다. </li><li> 탈세 포화 (DZ) 솔루션을 저장 병을 채우고 가능한 기포의 튜브 시스템을 확인합니다. </li><li> 내강의 흐름에 대한 유리 커넥터에 케이블 타이로 장 루멘을 연결합니다. 혈관 시스템의 붉은 동맥 액세스 (그림 1B)에 500 ㎖의 DZ 솔루션을 펌프. 곧 수동으로 전체 창자 루멘을 눌러 펌핑 과정마다 15 분 인터럽트. </li><li> decellularizati 중자연의 혈압을 모델로 100 ㎜ 수은, - 과정에서 완충 용액의 압력은 80 사이 여야합니다. </li><li> PBS와 BioVaSc 씻어 - 그것은 ( &quot;완전히 흰색&quot;) 세포 잔해에서 나올 때까지. </li><li> DZ 솔루션과 완전히 BioVaSc를 기입하고 셰이커를 흔들에서 4 ° C에서 밤새 DZ 솔루션에서 물속에 알을 품다. </li><li> 1.6 단계를 반복합니다. </li><li> DNA 분해 효소 용액에 BioVaSc를 놓고 흔드는 락에 4 ° C에서 밤새 품어. </li><li> DNase의 솔루션을 제거하고 세척 완충액으로 씻어. </li><li> 25 kGy의와 γ-살균 </li></ol> 2. 다른 세포 유형 인간의 기본 피부의 미세 혈관 내피 세포 (mvECs)와 섬유 아세포의 2.1 격리 <ol><li> 2의 스트립으로 피부 조직 검사 (바람직 preputium을) 절단 - 메스 3 mm 폭과이를 PBS로 3 배 씻어 - 솔루션입니다. </li><li> 디스 파제 솔루션으로 조직을 커버하고 16 일을 품다 - 14 ℃에서 8 시간 </li><li> 별도의 2 핀셋 진피에서 표피와는 PBS +로 가득 배양 접시에 모두 개별적으로 전송할 수 있습니다. </li><li> 린스의 진피 센과 1X를 제거합니다. </li><li> 진피 스트립에 10 ㎖ 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가하고 40 분 동안 인큐베이터에서 배양한다. </li><li> 바로 1 % FCS와 효소 반응을 정지. </li><li> VascuLife 가득 배양 접시에 피부 스트립을 전송하고 약간의 압력을 추가, 각면 8 배 메스 각 지구를 뿌려. </li><li> 원심 관에 셀 스트레이너를 통해 생성 된 세포 현탁액을 전송하고 VascuLife와 셀 스트레이너의 3 배를 씻어. </li><li> 5 분 1,200 XG에서 튜브를 원심 분리기와 VascuLife와 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 섬유 아 세포를 분리, 절단 진피는 메스를 사용하여 작은 조각으로 제거합니다. </li><li> 진피 조각에 콜라게나 제 용액 10 ㎖를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터에서 45 분 정도를 품어, 다음 스와을 원심 분리기 조심스럽게 제거맑은 상등. </li><li> DMEM + 10 % FCS + % PenStrep, 원심 분리기 함께 펠릿 1X를 세척하고 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. </li><li> 배지에서 펠렛을 재현 탁하고 세포 조직 중 성장할 수 있도록 T75 배양 플라스크로 옮긴다. </li></ol> 2.2 종양 세포 라인 S462 (친절 박사 니콜라 캄프, 샤리 테 의과 대학 베를린에서 제공) 종양 세포 라인 S462은 유전 종양 경향 증후군 신경 섬유종증 제 1 형 9 여성 환자의 악성 말초 신경 칼집 종양에서 생성되었습니다. S462는 10 % FCS로 보충 된 DMEM에서 배양 하였다. 3 일 - 매체마다 2 변경할 수 있습니다. 주 일단 세포가 분할되어야한다. 3. 종양 테스트 시스템 : 정적 문화 조건 생물 반응기 시스템에서 동적 인 문화와 비교 <ol><li> 관 SIS-MUC는 한면에 열 두 개의 금속 고리 (셀 크라운 10 mm 직경, 자기 C 사이에 고정 컷onstructed). 하룻밤 세포 배양 배지에서 SIS-MUC을 커버. </li><li> SIS (모노 - 또는 공동 문화 셋업) 중 하나 또는 양쪽에 정의 된 세포 수의 씨앗 고립 된 세포 (아래 참조). <ol><li> 종자 8,000 세포 SIS (구 장막)의 기저 표면에 100 μL의 총 부피의 기본 mvECs의 / ㎠. 3 시간 이상 침수 문화를 보장하기 위해 매체를 잘 채운다. </li><li> 내피 세포는 3 일 동안 부착 할 수 있습니다. 180 °에 의해 정적 배양 시스템을 뒤집고 12 - 웰 플레이트로 전송. </li><li> SIS (구 루멘의 측면)의 꼭대기의 표면에 500 μL의 총 부피 내에서 기본 피부 섬유 아 세포의 혼합물 (8,000 세포 / ㎠) 및 종양 세포 (15,000 세포 / cm 2) 씨입니다. </li><li> 세포가 3 시간 동안 밀착 매체 잘 채울 수 있도록 (침수 문화, 중간 : 10 % FCS로 보충 50 % Vasculife + 50 % DMEM). </li><li> 종양 시험 시스템은 정적 조건하에 배양t 37 ° C, 추가로 14 일 동안 인큐베이터에서 5 % CO 2. 3 일 - 매 2 배지를 변경합니다. </li></ol></li><li> 역동적 인 문화를 들어, 두 개의 금속 고리 사이의 SIS-MUC를 수정하고 3.2.1에 설명 된대로 기본 mvECs 종자. 3 일 후에 금속 고리에서 SIS-MUC를 제거하고 (그림 2C와 2D 참조) 흐름 반응기에 막을 삽입합니다. 생물 반응기에서 매트릭스 상에 주사기와 정맥과 피부 섬유 아 세포와 종양 세포의 기본을 적용하고, 세포 배양 배지와 바이오 리액터 시스템을 채우기 전에 3 시간 동안 부착 할 수 있습니다. </li><li> 일정한 매체 흐름과 다음 날 동적 배양 조건에서 (3.8 ㎖ / 분, 37 ° C, 5 % CO 2) 시작할 수 있습니다. 동적 문화가 14 일 동안 유지, 배양 배지는 7 일 후에 변경됩니다. </li><li> 동적 테스트 설정은 펌프와 필요한 온도와 CO 2를 통해 미디어의 흐름을 제공하는 자체 제작 배양기에서 배양 </sub&gt; 내용. </li></ol> 4. 분석을위한 특성화 방법 4.1 고정 및 시드 콜라겐 매트릭스의 파라핀 임베딩 <ol><li> (면역) 조직 학적 특성 분석을위한 배지를 제거하고 2 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 조직을 고정합니다. </li><li> 4 % 파라 포름 알데히드를 제거하고 조직을 삽입 카세트에 금속 삽입물에서 SIS를 전송합니다. 남아있는 정착액을 제거하고 파라핀 침투를 위해 탈수 조직을 물. </li><li> 파라핀 블록에 삽입하기 전에, 2에서 SIS를 잘라 - 3 조각 및 절단 된면이 아래로 향하도록 파라핀 채워진 금속베이스 금형에 배치. 백업으로 금형의 상단에있는 조직 카세트를 추가합니다. </li><li> 5 μm의 조각을 잘라 교정을위한 40 ° C의 물을 욕조에 그들을 떠, 다음 적절한 유리 슬라이드에 슬라이드를 탑재합니다. 비 코팅 슬라이드는 면역 조직 염색을위한 폴리 라이신 코팅 슬라이드 첨부 파일을 개선하기 위해, H &amp; E 얼룩에 사용됩니다.슬라이스 건조시킵니다. </li><li> 파라핀을 녹여, 자일 렌을 제거하고 염색을 다음과 같은 사항에 대해 조각을 재수. </li></ol> 4.2 염색 <ol><li> 재수 조각 표준화 개요 염색으로 헤 마톡 / 에오신으로 염색 할 수 있습니다. </li><li> immunhistological 염색에 대한 고정과 파라핀 침투 조직 조각이 항체가 인식하고 특정 항원에 결합 할 수 있도록 항원 검색을 거쳐야합니다. 따라서, 탈 파라핀과 재수 슬라이드는 20 분 동안 가열 구연산 완충액 (pH 6.0)와 증기 밥솥에 배치됩니다. </li><li> 염색 솔루션에 필요한 양을 최소화하기 위해 PAP 펜 세척 완충액 (0.5 M TBS 버퍼 + 0.5 % 트윈) 및 원형 슬라이스로 전송 슬라이드. </li><li> 수분 챔버에서 슬라이드를 놓습니다. 항원 - 항체 결합의 특정 양 고추 냉이 과산화 효소 - 중재 시각화를 확보하기 위해, 내인성 퍼 옥시 다제는 3 % 과산화수소로 포화되어야한다. </li><li> 차 antib멜로디 희석은 조각에 적용 RT에서 1 시간 동안 배양하고 신중하게 세척 완충액으로 씻어됩니다. </li><li> 특정 항원 - 항체 바인딩의 검출을위한 울트라 비전 &#39;콴토 탐지 시스템 HRP DAB (온도 과학)가 권장하는 프로토콜에 따라 사용됩니다. </li><li> 핵은 1 분 동안은 Hematoxylin과 대조된다. </li><li> 슬라이드는 수성 매질에 장착 건조하고, 역 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

<html> 더 비싼 접근 방식에도 불구하고 종양 연구, 3D 시스템, 2 차원 및 3 차원 배양 시스템을 비교했을 때, 더 나은 생물 미세 환경의 조건을 모방 입증했다. 그것은 몇 가지 종양 세포가 실제 종양의 상황에 따라되는 일반 2D 문화 (12)에 비해 3D 문화에 훨씬 느리게 성장하는 것으로 나타 수 있습니다. 비셀과 동료 발암 유방 세포의 동작은 매트릭스 내에서 3D 문화 휴대 ECM 상호 작용을 제공하고 더 정확하게 세포 형태 및 신호를 포함하는 생체 내 상황을 반영하는 것이 자신의 작품에서 보여 주었다. 또한, 이들은 환경 상호 작용의 변화가 정상적인 표현형으로 악성 세포의 복귀 주도 것을 입증함으로써 3D로 세포 외 환경의 중요성을 강조 하였다. 또한 가장 중요한 것은, 이러한 결과는 생체 내 동물 모델 (10, 11)에있는 확인할 수 있었다. ontent &quot;&gt; 생체 내 동물 실험과 생체 조직 모델의 직접 비교는 두 시스템의 장점과 단점을 알 수있다. 체외 모델의 장점 중 하나는 더 나은 실시간 또는 현미경으로 고정 된 이미지의 권한입니다. 제한입니다 그들은 생체 시스템은 종종 진행하는 반면, 정적 또는 단기 조건을 모방. 혈관과 작은 분자의 정상적인 전송의 현재 부족. 면역 반응을 호스트 및 기타 세포 - 세포 상호 작용이 생체 외 모델 12의 추가 단점이 있습니다 따라서, 3D 생체 시스템에서 본 연구에서 제시된는 동물 실험에 유망한 추가를 제공합니다. 그들은 인간 유기체에 더 나은 비교를 제공하고, 따라서 실험 오해를 최소화 할 수 있습니다. 생체 모방 생체 모델 시스템에 따라서 암 및 전이성 확산 의존하는 방법을 연구하는 것이 더 관련이 될 것입니다 tumorig을 조절 미세 환경 조건에enesis 11. 우리의 연구는 SIS-MUC에서 제공하는 3D 환경은 일반적인 2 차원 세포 배양에서 관찰되지 않은 세포보다 종양과 같은 조직 형성, (그림 3A 참조)에 이르게 것을 보여줍니다. 또한, 종양 생검에서 파생 된 일차 전지의 사용은 맞춤 의학, 환자의 개인의 필요에 따라 최선의 치료를 식별하는 것을 목표로 훈련을 향한 매우 중요한 단계입니다. 생검 재료에서 분리 기본 환자 특정 종양 세포를 통합하면 치료 전략의 시험 관내 시험에 수 있습니다. 이러한 테스트 시스템은 가능한 시간 및 비용 절감 높은 처리량 검사에 그 다른 약물과 조합을 조사 할 것입니다. 종양의 미세 환경의 영향 종양의 진행 (13)이 suitab으로 증명할 수 있으므로 또한, 본 연구에서와 같이 종양 관련 기질 세포의 통합은 개인의 접근 방식에 중요하다르 치료 대상. 대안 적 개인화 방식으로, 우리의 종양 모델 확립 종양 형성 세포 라인의 혼입에 의해 일반화 된 종양 테스트 시스템의 역할을하도록 변경 될 수있다. 이 기본 연구 목적을위한 유망한 적응이다. 양쪽 약물 테스트에 대한 혈관 구조의 존재는 치료 물질의 분포 및 흡수를 테스트하는 데 필요한 접근한다. SIS-MUC 행렬 장벽 흡수 연구를위한 기본 mvEC와 기저 시드를 허용 BioVaSc의 보존 혈관 구조의 다시 시드가 더 약물 전달 연구를 향상시킬 것입니다. 조직의 모델을 생성하기 위해, 3D 생분해 성 매트릭스는 서로 다른 세포 유형 (14)의 공 배양을위한 프레임 워크로서 사용될 수있다. 이러한 3D 행렬의 사용은 종종 혈관 기능의 부재에 의해 제한된다. 이 문제는 보존 혈관 STR을 구비 BioVaSc의 사용에 의해 해결 될 수있다uctures, 이는 내피 세포로 다시 시드 할 수 있습니다. 게다가 BioVaSc는 세포의 부착을 보장하고 조직의 분화를 촉진 세포 외 성분을 제공한다. 또한 bioartificial 3D 조직 7,8,15의 장시간의 조직 특이 기능을 가능하게한다. 기능 혈관 대체의 설계를위한 전제 조건은 인간의 생리적, 생 역학적 조건의 모방이다. 따라서, 시험 관내에서 이러한 요구 사항을 구현할 수 바이오 리액터 시스템은 생물학적 종양 모델을 생성하기위한 극단적 인 관심이다. BioVaSc의 조합은, 생물 반응기 기술 및 다른 세포 유형의 공동 배양은 혈관 신생 및 전이와 같은 암 진행에 대한 중요한 메커니즘의 연구를 허용 혈관 종양 조직을 생성하기 위해 매우 유망한 방법이다. 우리는 동등한를 제공하여 동물 연구를 보완하기위한 유망한 방법으로 종양 모델을 참조하십시오인간의 종양 생리학.

새로운 의약품의 품질, 안전성, 시장의 승인 이전에 효능에 관해서는 검증해야합니다. 지금까지 동물 실험은 약물 테스트 및 검증을위한 표준 방법입니다. 그러나, 종 특이 차이로 동물 실험은 종종 종합적 인간 하나의 화합물의 효과를 평가하지 않는다. 이 때문에, 새로운 약물 및 물질의 시험 관내 시험에 사용될 수 인체 조직의 모델을 생성하는 것이 중요하다. 우리 그룹의 초점을 맞추고 중 하나는 생물학적 혈관 지지체 (BioVaSc) 2,3 생체 외 시험 모델을 만드는 것입니다. BioVaSc는 정적 또는 동적 3D 매트릭스 방식으로 사용될 수있다. 정적 문화, decellularized 돼지 jejunal 세그먼트 (소장 점막하 SIS-MUC)는 셀 다시 시드를위한 금속 삽입물에 배치됩니다. 암과 내피 세포 등 다양한 세포는 발판에 배양 할 수있다. <p역동적 인 문화에 대한 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt;, BioVaSc은 혈관을 통해 또는 지지체의 표면에 걸쳐 흐름을 적용하는 생물 반응기 시스템에 연결되어 있습니다. 현재 바이오 리액터는 세포 4의 분화 나 증식에 작용, 생물학적, 기계적 또는 전기적 자극을 구현합니다. 조직 공학 분야에서 생물 반응기의 경우, 기본 개념은 인체의 조건을 시뮬레이션하는 것이다. 상기 세포는 서로 그들의 주변 세포 외 기질 (extracellular matrix)과 상호 작용할 수있는 자연 환경을 제공한다. 시험 관내 시험 시스템 또는 이식의 생산을위한 적당한 담체 구조 및 바이오 리액터 시스템과 함께 세포의 자연 환경을 모방하는 능력이 중요하다 5. 따라서, 더 복잡하고 기술적으로 장치는 이러한 작업 6을 충족하기 위해 개발해야합니다. 그것은 establ입니다 우리의 발판을 사용하는 것이 또한 가능하다때문에 먹이 동맥, 정맥, 그리고 연결 모세관 침대를 포함하는 보존 관 구조에 혈관 모델의 징벌. 모든 돼지 세포는 화학 기계적 및 탈세 포화 효소에 의해 제거 할 필요가 있고, 발판 감마 멸균. 복원 된 관상 혈관 구조는 이후 같은 산도, 온도, 압력, 영양 공급 및 폐기물 제거 6과 생체 역학 및 / 또는 생화학 매개 변수를 모방 한 재순환 관류 생물 반응기 7을 사용하여 인간의 미세 혈관 내피 세포로 다시 시드 할 수 있습니다. 관 구조의 재 내피 세포는 콜라겐 발판 3,7 내에서 인간의 혈관 상당을 만듭니다. 다음 단계에서, 이전의 루멘 (점막)의 표면은 공동 배양 3,7,8을 확립 일차 인간 세포로 접종 될 수있다. 본 연구에서는 3 차원 종양 테스트 시스템은 일차 명세서와 종양 세포주를 공동 배양하여 설정된SIS-MUC에 대한 정적 및 동적 조건에서 romal 세포.

<table><tbody><tr><td>콜라겐 분해 효소 용액</td><td>SERVA</td><td>17454</td> <td>(500 U/ml)</td></tr> <tr><td>Dispase 용액</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td> <td>(2.0 U / ml)</td></tr> <tr><td>DMEM, 고 포도당</td><td>PAA</td><td>G0001,3010</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td>200 mg 500 ml PBS + + 1 % PenStrep</td></tr><tr><td>DZ 용액</td><td>Roth</td><td>3484.2</td><td>34g 나트륨 Desoxychelate, 1 L 초순수</td></tr><tr><td>FCS</td><td>LONZA</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td><td>DCS</td><td>PD000KIT</td><td></td></tr><tr><td>의료 압력 변환기</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>단일 클론 마우스 안티 휴먼 폰 Willebrand 요인</td><td>DAKO Cytomation</td><td>M0616</td><td>클론 F8 / 86 0.12 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>마우스 단클론 항인간 p53</td><td>DAKO Cytomation</td><td>IS616</td><td>클론 DO-7 즉시 사용 가능한</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 일회용 돔</td><td>MEMSCAP</td><td>844-28</td><td></td></tr><tr><td>트립신/EDTA 솔루션</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td>0,05%</td></tr><tr><td>VascuLife (VEGF-Mv)</td><td>Lifeline</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>깁코</td><td>15040-033</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 3 차원의 조직 공학<em&gt; 시험관</em&gt; 종양 테스트 시스템

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

암은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 현재 치료 전략은 주로 부적절하게 생체 내에서 생리적 조건을 반영하는 차원 배양 시스템에서 개발된다. 생물학적 차원 매트릭스 조직의 조직 및 세포 분화 연구를 허용 세포에게 세포가 자기 조직화 할 수있는 환경을 제공한다. 이러한 발판이 직접 3D 세포 세포 상호 작용을 연구하는 여러 종류의 세포 혼합물을 시드 할 수 있습니다. 암 종양의 3D 복잡성을 모방하기 위해, 우리의 그룹은 3 차원 생체 외 종양의 테스트 시스템을 개발했다. 우리의 3D 조직의 테스트 시스템 모델 우리가 우리의 decellularized 돼지 jejunal 세그먼트 유래 생물 혈관 지지체 (BioVaSc) 설립 악성 말초 신경 칼집 종양 (MPNSTs)의 생체 내 상황. 우리의 모델에서, 우리는 주요 섬유 아 세포, 미세 혈관 내피 세포 (와 수정 BioVaSc 행렬을 다시 시드mvECs) 및 S462 종양 세포주. 정적 배양 들어 BioVaSc의 혈관 구조를 제거하고 남아있는 지지체는 일측 (소장 점막하 SIS-MUC)에 열린 절단된다. 그 결과 행렬은 두 개의 금속 링 (세포 크라운) 사이에 고정되어 있습니다. 또 다른 옵션은 배양 응력 전단 세포를 노출 유동 바이오 리액터에서 세포 시딩 SIS-MUC이다. 여기서, 바이오 리액터는 자체 구성 인큐베이터에서 연동 펌프에 연결된다. 컴퓨터는 혈압, 온도, 유량 등의 파라미터를 통해 동맥혈 산소 및 영양소의 공급을 조절한다. 이 설정은 압력 조절 박동 또는 일정한 흐름 중 하나와 역동적 인 문화를 할 수 있습니다. 이 연구에서, 우리는 성공적으로 MPNSTs에 대한 정적 및 동적 3 차원 배양 시스템을 모두 구축 할 수 있습니다. 보다 자연스러운 3 차원 환경에서 암 종양을 모델링하는 능력은 발견, 테스트 및 검증을 가능하게인간과 같은 모델에서 미래 제약.

도 1b에 도시 된 바와 같이, 우리는 모세관 네트워크의 보존 관형 구조로 돼지 jejunal 세그먼트 (약 2 길이 m 및 직경 20 mm)를 decellularized. 화학, 효소 및 기계 탈세 포화 후, 우리는 3 차원 세포 배양에 사용할 수있는 콜라겐 I / III의 발판을 얻을. Feulgen 시험 행렬 (데이터 미도시)의 순도 (아니오 DNA 잔재)을 보여주기 위해 수행되었다. 도 2a 및도 2b는 휴대 크라운하여 주시기 SIS-MUC의 정적 배양을 나타낸다. 우리는 역동적 인 문화에 대한 자체 설계 생물 반응기 (그림 2C)에서 SIS-MUC를 해결했습니다. 그림 2D는 생물 반응기의 챔버를 통해 시뮬레이션 동적 흐름을 보여줍니다. 생물 반응기는 자기 - 구성 시스템 인큐베이터에 넣고 연동 펌프와 연결된다. 이 설정은 압력 조절 타악기 흐름 또는 C와 함께 역동적 인 문화를 수<html> onstant 흐름. 그림 3은 2 차원의 단일 문화의 정적 배양 S462의 종양 세포 라인의 개요 (그림 3A)를 제공하고 3 차원 공 배양 (그림 3B-3D)에. 그림 (b)는 종양 세포 S462와 SIS의 혀끝의 측면에서 주요 섬유 아 세포의 트리플 문화를 보여줍니다 기저 측 (구 장막 측)에-MUC (구 내부 루멘 측)과 mvEC. 다른 세포 유형의 식별은 mvEC (그림 3C)를 레이블 등의 폰 빌레 브란트 인자로 세포 유형 특정 마커를, 염색이 가능합니다. p53의 양성 S462 세포는 p53의 음성 차 섬유 아 세포 (그림 3D) 및 세포의 3 차원 분포를 분석 할 수있는 구별 될 수있다. 동적 배양 트리플 문화의 그림 3과 4는 염색에 해당하는 그림. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. 탈세 포화 설정입니다. (A) 생물 반응기 및 PC ​​모니터링하는 BioVaSc을 decellularizing위한 펌프 설정. (B) Decellularized BioVaSc 유리 탱크. 루멘과 동맥 유입구 어댑터에 연결된다. . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> 그림 2. 서로 다른 문화 셋업의 뷰입니다. 미세 적정 잘 플레이트에서 정적 문화 시스템 (A) CAD 단면도, (B) 정적 문화에 대한 금속 삽입, 흐름 생물 반응기의 상부 덮개의 동적 문화 (C) 매체 흐름 시뮬레이션 (속도 장 [m / 초]) (D) 연동 펌프에 연결된 동적 문화 흐름 생물 반응기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> 천만에 &quot;FO : 유지 - together.within 페이지를 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> 그림 3. 정적 3D 종양 모델의 면역 조직 특성의 개요. Permanox 슬라이드에 S462 세포의 정적 배양 2D 모노 문화의 (A) 헤 마톡 얼룩, 정적 배양 3D 트리플 문화의 (B) H &amp; E 염색, 화살표는, 폰 빌레 브란트 인자 (C) 면역 조직 염색, (D 내피 세포를 표시 p53의 경우) 면역 조직 염색. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> <img alt="그림 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <st룽&gt; 그림 4. 동적 3D 종양 모델의 면역 조직 특성의 개요. (A) 동적 배양 3D 트리플 문화의 H &amp; E 염색, 화살표가 내피 세포 (B)를 표시 폰 빌레 브란트 인자에 대한 면역 조직 염색, p53의 대한 (C) 면역 조직 염색. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림를 보려면 여기를 클릭하십시오</a>

테스트 시스템으로 인간의 3D 종양 조직을 만들 수있는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 decellularized 생물 혈관을 비계 (BioVaSc), 인간의 기본 세포와 흐름 생물 반응기의 동적 조건에서뿐만 아니라 정적에서 배양 할 수있는 종양 세포 라인을 기반으로합니다.

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

본 절차의 전반적인 목표는 탈세포화된 생물학적 지지체 위에 일차 세포를 배양하여 3D 종양 테스트 시스템을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 돼지의 대동맥(al) 분절에 탈세포화 용액을 펌핑하는 탈세포화 공정을 통해 지지체를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 표준 분리 프로토콜을 사용하여 환자의 생검 조직으로부터 일차 인간 세포를 분리하는 것입니다.다음으로, 관 모양의 소장 점막하층을 한쪽 면만 절개하여 두 개의 금속 링 사이에 고정하고, 정해진 세포 밀도로 종양 세포와 관련 기질 세포를 파종하여 종양 테스트 시스템을 구축합니다. 마지막 단계는 세포가 로딩된 구조체를 정적 또는 동적 조건의 적절한 설정에서 배양하는 것입니다. 최종적으로, 면역조직화학 현미경 검사를 통해 종양 성장 특성을 평가합니다.TT 종양 테스트 시스템과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 일반적인 2D 모델보다 종양의 체내(in vivo) 조건을 더 정확하게 모사하는 3D 조직 모델을 생성할 수 있다는 점입니다. 동적 배양의 장점은 세포 특이적 특성이 유지된다는 것입니다. 이 방법은 암세포가 3D 환경에서 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 어떻게 형성하는지와 같이 종양 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 이는 종양 진행 및 전이와 같은 암 관련 프로세스를 규명하는 데 기여할 것입니다.본 종양 테스트 시스템에 사용된 생물학적 혈관화 지지체(biova)는 돼지의 장 분절에서 유래되었습니다. 캐뉼라를 통한 동맥 접근법을 사용하여 돼지 장 분절의 혈관계와 장강을 PBS로 헹굽니다. 완전히 깨끗해질 때까지 이 과정을 반복합니다.4개의 어댑터가 장착된 200 mm 직경의 유리 탱크를 준비하고, 실리콘 튜브를 통해 연동 펌프에 연결합니다. 압력 제어 장치는 멸균 일회용 돔에 연결된 압력 센서를 통해 모니터링할 수 있습니다. 저장 병에 탈세포화 용액 또는 DZ 용액을 채웁니다.튜브 시스템에 기포가 있는지 확인하십시오. 케이블 타이를 사용하여 장관 내강을 내강 흐름용 유리 커넥터에 연결하십시오. 혈관 시스템의 적색 동맥 접근로로 DZ 용액 500 milliliters를 펌핑하십시오.15분마다 펌핑 과정을 잠시 중단하고 수동으로 장관 전체를 눌러 내용물을 밀어냅니다. 탈세포화 과정 동안 완충 용액의 압력을 모니터링하는 것이 중요합니다. 압력은 자연 혈압을 모델로 하여 80에서 100 mmHg 사이로 유지해야 합니다.세포 잔해물이 제거되고 혈관 구조가 완전히 하얀색이 될 때까지 biova를 PBS로 세척합니다. 먼저 메스로 피부 생검 조직을 2~3 mm 너비의 띠 모양으로 자른 뒤 PBS 용액으로 3회 헹구어 이 절차를 시작합니다. 조직을 disbe 용액으로 배양한 후, 핀셋 두 개를 사용하여 표피를 진피에서 분리합니다.1차 진피 미세혈관 내피세포(MV eecs)를 분리하기 위해 두 조직을 각각 PBS가 채워진 페트리 접시에 옮깁니다. 진피 조각을 효소로 1회 세척한 후, 진피 조각에 EDTA 용액 10 milliliters를 첨가하고 37°C에서 40분 동안 배양합니다. 1% FCS로 효소 반응을 중단시키고 피부 조각을 VascuLife가 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. 세포 현탁액을 만들기 위해 메스로 각 조각의 양면을 약간의 압력을 가하며 8회씩 긁어냅니다.그 후 세포 현탁액을 원심분리하고, 세포 펠렛을 Vascu Life로 재현탁하십시오. 섬유아세포를 분리하려면, 먼저 메스로 진피 조각을 작은 크기로 자릅니다.진피 조각들을 Falcon 튜브로 옮기고 37 °C에서 45분 동안 배양한 콜라게나아제 용액 10 mL를 추가합니다. 다음으로, 용액을 원심 분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 펠릿을 DMEM, 10% FCS 및 1% pen strep 혼합액으로 세척합니다.원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 배양액에 재현탁한 다음, T 75 배양 플라스크로 옮겨 조직에서 세포가 자라나도록 정적 조건에서 배양합니다. 종양 테스트 시스템을 구축하려면 먼저 관 모양의 소장 점막하층 또는 SIS muc의 한쪽 면을 절개하여 두 개의 금속 링 사이에 고정합니다. 이렇게 제작된 셀 크라운(cell crown)의 직경은 10 밀리미터입니다.SIS mu를 세포 배양 배지로 덮어 하룻밤 동안 둡니다. 다음 날, SIS의 기저층 표면(기존의 CI)에 primary MVE CS를 파종합니다. 37°C, 5% carbon dioxide 조건의 배양기에서 3시간 동안 배양합니다. 3시간 후, 웰에 배지를 채워 침지 배양이 되도록 한 뒤 다시 배양기로 옮깁니다. 내피세포가 부착될 수 있도록 3일 동안 둡니다.정적 배양 시스템을 180도 뒤집어 12웰 플레이트에 옮깁니다. 다음으로, SIS의 정단 표면, 즉 이전 루멘 쪽에 일차 진피 섬유아세포와 종양 세포의 혼합물이 관찰됩니다.세포를 3시간 동안 부착시킵니다. 배양액을 웰에 채워 배양물을 완전히 잠기게 한 후, 37°C, 5% carbon dioxide의 정적 조건에서 종양 테스트 시스템을 14일 동안 추가로 배양하며, 동적 배양의 경우 2~3일마다 배양액을 교체합니다. SIS mu를 두 개의 금속 링 사이에 고정하고, 앞서 설명한 방식대로 primary MV eecs를 파종합니다.3일 후, 금속 링에서 SIS mu를 제거하고 시린지와 캐뉼라를 사용하여 막을 흐름 반응기에 삽입합니다. 바이오리액터 내의 매트릭스 위에 일차 진피 섬유아세포와 종양 세포를 도포합니다. 세포가 3시간 동안 부착되도록 둔 후, 다음 날 배양액으로 바이오리액터 시스템을 채우고, 바이오리액터를 자체 제작한 인큐베이터 시스템에 배치하고 연동 펌프에 연결합니다.이 설정을 통해 압력이 조절된 박동성 흐름 또는 일정 흐름을 이용한 동적 배양이 가능합니다. 본 실험에서는 3.8 milliliters per minute의 일정 배지 흐름이 사용되었습니다. 7일 후에 배양액을 교체하며, 14일 동안 동적 배양을 유지합니다.실험이 완료되면 조직을 고정하고, 파라핀에 매몰 및 염색한 후 역방향 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 패널 A는 헤마토실린으로 염색하여 2D 단일 배양한 정적 배양 S 4 62 종양 세포주의 개요를 보여줍니다.3D 공배양 모습은 패널 B, C, D에 나타나 있습니다. 이 H&amp;E 염색 이미지는 SIS MU 및 MVEC의 정단측(apical side)에 위치한 종양 세포 S 4 62와 일차 섬유아세포의 삼중 배양 상태를 보여줍니다. 기저측(basal lateral side)의 화살표는 혈관 내피세포를 표시합니다. 패널 C에 표시된 MVEC를 라벨링하기 위한 von Willebrand factor 및 패널 D에 표시된 P 53과 같은 세포 유형 특이적 마커를 염색함으로써 서로 다른 세포 유형을 식별할 수 있습니다. P 53 양성 S 4 62 세포는 P 53 음성 일차 섬유아세포와 구별할 수 있으며, 동일한 방식으로 세포의 3D 분포를 분석할 수 있습니다.동적 배양된 삼중 배양 시스템에서 서로 다른 세포 유형을 식별할 수 있습니다. 패널 A는 H and E 염색 이미지이며 화살표는 혈관 내피 세포를 나타냅니다. 패널 B는 von Willebrand factor에 대한 면역 조직 화학 염색을 보여주며, 패널 C는 P 53 염색 결과를 보여줍니다. 이 절차 이후에, 새로운 암 치료법 탐색이나 종양 형성의 주요 신호 전달 경로 분석과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 약물 테스트와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.또한, 일차 세포를 통해 개별 환자에게 가장 적합한 맞춤형 치료법을 결정할 수 있습니다.

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