인간의 3 차원의 조직 공학 시험관 종양 테스트 시스템

이 절차의 전반적인 목표는 탈세포화된 생물학적 골격에 일차 세포가 있는 3D 종양 검사 시스템을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 돼지 al 세그먼트에 탈세포화 용액을 펌핑하는 탈세포화 공정을 사용하여 골격을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 표준 분리 프로토콜을 사용하여 환자의 생검에서 1차 인간 세포를 분리하는 것입니다.

다음으로, 관형 소장 점막하를 한쪽으로 절단하여 두 개의 금속 고리 사이에 고정하고 정의된 세포 밀도의 종양 세포 및 관련 기질 세포를 파종하여 종양 검사 시스템을 설정합니다. 마지막 단계는 정적 또는 동적 조건에서 적절한 설정에서 cell loaded 구조체를 배양하는 것입니다. 궁극적으로 면역조직화학 현미경은 종양 성장의 특성을 평가하는 데 사용됩니다.

TT 종양 검사 시스템과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법을 사용하면 일반적인 2D 모델보다 더 정확하게 종양의 생체 내 상태를 시뮬레이션하는 3D 조직 모델을 생성할 수 있다는 것입니다. 동적 배양의 장점은 세포 특이적 특성이 유지된다는 것입니다. 이 방법은 3D 환경에서 암세포가 세포 세포와 세포 매트릭스 상호 작용을 형성하는 방법과 같은 종양 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 종양 진행 및 전이와 같은 암 관련 과정을 밝히는 데 도움이 될 것입니다.

이 종양 검사 시스템에 사용되는 생물학적 혈관 골격 또는 biova는 porcine jaal segment에서 파생됩니다. 캐뉼레이트 동맥 접근을 통해 돼지 알 분절의 혈관계와 장 내강을 PBS로 헹굽니다. 완전히 깨끗해질 때까지 반복합니다.

4개의 어댑터가 있는 200mm 직경의 유리 탱크를 준비하고 실리콘 튜브를 통해 연동 펌프에 연결합니다. 압력 제어 장치는 멸균 일회용 돔에 연결된 압력 센서를 통해 모니터링할 수 있습니다. 저장 용기 병을 탈세포화 또는 DZ 용액으로 채웁니다.

튜브 시스템에 기포가 있는지 확인하십시오. 케이블 타이가 있는 장 내강을 내강 흐름을 위해 유리 커넥터에 연결합니다. 500ml의 DZ 용액을 혈관계의 적색 동맥 접근로로 펌핑합니다.

15분마다 펌핑 과정을 중단하여 전체 장 내강을 수동으로 누르십시오. 탈세포화 과정에서 완충 용액의 압력을 모니터링하는 것이 중요합니다. 압력은 자연 혈압을 모델로 한 80-100mm의 수은이어야 합니다.

세포 잔여물이 없고 혈관 구조가 완전히 흰색이 될 때까지 PBS로 비오바를 세척합니다. 메스로 피부 생검을 2-3mm 너비의 스트립으로 자르고 PBS 용액으로 세 번 헹구는 것으로 이 절차를 시작합니다. 디스베 용액으로 조직을 배양한 후 두 개의 핀셋을 사용하여 표피와 진피를 분리합니다.

PBS로 채워진 페트리 접시에 둘 다 따로 옮겨 일차 피부 미세혈관 내피 세포 또는 MV eec 린스 진피 스트립을 분리합니다.ene을 한 번 사용하면 진피 스트립에 EDTA 용액에 10밀리리터 트립을 추가하고 섭씨 37도에서 40분 동안 배양합니다. 1%FCS로 효소 반응을 중지하고 피부 스트립을 혈관 생명으로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. 메스로 각 스트립을 양쪽에서 8번씩 긁어내고 약간의 압력을 가하여 세포 현탁액을 생성합니다.

그 후, 세포 현탁액을 원심 분리하고 소생시키고 혈관 생명으로 세포 펠릿을 현탁시킵니다. 섬유아세포를 분리하기 위해. 먼저 메스를 사용하여 진피 스트립을 작은 조각으로 자릅니다.

진피 조각을 Falcon 튜브에 옮기고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양한 콜라겐분해효소 용액 10ml를 추가합니다. 다음으로, 용액을 원심 분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. DMEM과 10%FCS와 1%펜 연쇄상구균으로 펠릿을 세척합니다.

원심분리 후 상등액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 배양 배지에 재현탁시킨 다음 T 75 배양 플라스크로 옮겨 세포가 정적 조건에서 배양 조직에서 자랄 수 있도록 합니다. 종양 검사 시스템을 먼저 설정하려면 관형 소장 점막하 또는 SIS 점액을 절단하고 한쪽을 열어 두 개의 금속 고리 사이에 고정합니다. 이 자체 구성된 세포 크라운의 직경은 10mm입니다.

다음 날 하룻밤 동안 세포 배양 배지에서 SIS 뮤를 덮고, SIS의 기저 후기 표면에 1 차 MVE CS를 파종하고, 이전 CI.Incubate는 섭씨 37도에서 3 시간 동안 5 % 이산화탄소를 배양합니다. 3 시간 후, 침수 배양을 보장하기 위해 우물에 배지를 채우고 인큐베이터로 되돌립니다. 3일 후 3일 동안 내피 세포가 부착되도록 합니다.

정적 배양 시스템을 180도 뒤집어 12웰 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, SIS의 정점 표면에 있는 원발성 진피 섬유아세포와 종양 세포의 혼합물을 봅니다. 이전 루멘의 측면.

세포가 3시간 동안 부착되도록 합니다. 우물을 배지로 채워 배양 배양물을 담그고, 종양 검사 시스템을 섭씨 37도의 정적 조건에서 14일 동안 5% 이산화탄소를 채우고, 동적 배양을 위해 2-3일마다 배양 배지를 변경합니다. 앞에서 설명한 대로 두 개의 금속 링과 시드 기본 MV eecs 사이의 SIS mu를 수정합니다.

3일 후, 금속 고리에서 SIS mu를 제거하고 주사기와 캐뉼라를 사용하여 멤브레인을 유동 반응기에 삽입합니다. 1차 진피 섬유아세포와 종양 세포를 생물반응기의 기질에 적용합니다. 다음 날 생물 반응기 시스템을 배양 배지로 채우기 전에 세포가 3 시간 동안 부착되도록하고, 생물 반응기를 자체 제작 인큐베이터 시스템에 놓고 연동 펌프에 연결하십시오.

이 설정은 압력 조절 맥동 흐름 또는 일정한 흐름으로 동적 배양을 허용합니다. 이 실험에서는 분당 3.8 밀리리터의 일정한 매체 흐름이 사용됩니다. 14일 동안 동적 배양을 유지하고 7일 후에 배양 배지를 변경합니다.

실험이 완료되면 조직을 고정하고, 파라핀을 고정하고, 매립하고, 염색한 다음 역 현미경을 사용하여 이미지화합니다. 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 패널 A는 헤마트 톨린으로 염색된 2D 단일배양에서 정적으로 배양된 S 4 62 종양 세포주에 대한 개요를 제공합니다.

3D 공동 배양은 패널 B, C 및 D에 표시되며, 이 H 및 e 염색 이미지는 SIS MU 및 MVEC의 정점 측에서 종양 세포 S4, 62 및 1차 섬유아세포의 삼중 배양을 보여줍니다. 기저 측면에서는 화살표가 내피 세포를 표시합니다. 패널 C에 표시된 MVEC 및 패널 D에 표시된 P 53을 라벨링하기 위해 von Willebrand 인자와 같은 세포 유형 특정 마커를 염색하여 다른 세포 유형을 식별할 수 있으며, P 53 양성 S 4 62 세포는 P 53 음성 1차 섬유아세포와 구별할 수 있으며 세포의 3D 분포를 동일한 방식으로 분석할 수 있습니다.

동적으로 배양된 삼중 배양 패널에서 다양한 세포 유형을 식별할 수 있으며, 패널 A는 화살표가 내피 세포를 표시하는 H 및 E 염색 이미지입니다. 패널 B는 von Willebrand 인자에 대한 면역 조직학적 염색을 보여주고, 패널 C는 이 절차에 따른 P 53에 대한 염색을 보여줍니다. 새로운 암 치료법을 찾는 방법이나 종양 발생의 중요한 신호 경로 분석과 같은 추가 질문에 답하기 위해 약물 검사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

또한 일차 세포를 사용하여 개별 환자에게 가장 적합한 맞춤형 치료를 정의할 수 있습니다.