Name: 전기 생리학 및 고해상도 두 광자 현미경을위한 마우스 전정 감각 상피의 격리 된 세미 그대로 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 배우세요 마우스 전정 감각 상피의 반정형 준비법을 통해 전정 모세포의 전기생리학적 특성과 칼슘 신호를 연구하는 방법을. 고해상도 두 광자 현미경과 패치 클램프 기술을 활용하여 생리학적 조건에서 세포 기능을 분석할 수 있습니다.

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이 작품에 대한 자금 조달은 R. 임과 AJ 캠프에 가넷 패스포트와 로드니 윌리엄스 기념 재단 프로젝트 교부금에 의해 제공되었다.

1. 동물 <ol><li> 마우스는 호주의 설치류 센터 (ARC, 퍼스, 호주)에서 얻은 환경 농축과 일반 12 시간 빛 / 어둠주기 시드니 보쉬 동물 시설의 대학에서 개최. 설명 모든 실험은 시드니의 동물 윤리위원회의 대학에 의해 승인되었습니다. </li><li> 남성과 여성의 생쥐 (C57/BL6)이 변형은 일반적으로 유전자 조작을위한 배경으로 사용되기 때문에 모든 실험에 사용하였고, 8-9 야생형 같은 것으로 간주 될 수 있습니다. </li></ol> 2. 조직 준비 <ol><li> 26 NaHCO3를 11 포도당, 250 글리세롤, 2.5 KCl을, 1.2의 NaH 2 PO 4, 1.2 MgCl 2, 2.5 염화칼슘 2 : 구성된 글리세롤 기반의 인공 뇌척수 (ACSF) (단위 : mm)의 300 ML을 준비합니다. 염화칼슘의 추가 이전에, 가스 carbogen (95 % O 2 5 % CO 2)와 솔루션은 AP를 구축하는7.4 H 피하고 칼슘 침전 (흐려). 아이스 슬러리가 형성되도록 45 분 -80 ° C의 냉동고에서 솔루션을 고정합니다. </li><li> 깊이 복강 주사를 통해 케타민 (100 ㎎ / ㎏) (파넬, 알렉산드리아, 호주)와 쥐를 마취시키다. </li><li> 일단 뒷다리 사지 핀치 반사 날카로운 스테인리스 가위를 사용하여 결석 목을 벨 마우스이며 두개골을 노출하는 면도날 (# 22 반올림)를 사용하여 시상 ​​피부 절개를합니다. 이 시점에서와 같이 2.3-2.8에 걸쳐 두개골 금고, 뇌 및 기본 전정 장치는 조직에 얼음처럼 차가운 ACSF의 일반 응용 프로그램에서 가능한 시원한로 유지해야합니다. </li><li> 표준 패턴 가위의 뾰족한 팔 (FST, 노스 밴쿠버, 캐나다)를 사용하여 람다에서 두개골에 작은 절개를하고 시상 봉합을 따라 잘라. 뇌가이 단계에서의 전단 블레이드로 &quot;드래그&quot;되지 않았는지 확인합니다. </li><li> 조심스럽게 옆으로 멀리 정수리 뼈와 뒤통수 뼈 posterio 껍질RLY 얕은 굴곡 피어슨 rongeurs (FST)를 사용하여. </li><li> 작은 스테인레스 스틸 주걱은 조심스럽게 중간과 후방 두개골 fossae의 표면에서 머리를 들어 올리는 데 사용하고, 노출 vestibulocochlea 신경 (CNVIII)는 내이 (内耳) 및 미세 홍채 가위와 뇌간 사이의 중간을 잘라. 이 신경을 절단 머리 세포의 기본 심성과 연결 축삭에 과도한 긴장을 최소화합니다. </li><li> CN VIII의 절개에 따라 뇌 토토에서 제거됩니다. </li><li> 전정 미로는 달팽이관이 anteromedially 가리키는 이제 중간 두개골 포사에서 명확하게 볼 수 있습니다. 조심스럽게 앞쪽에 반원형의 운하를 잡고 옆으로 잡아 당겨 절개 전에 전정 미로의 양쪽을 Rongeur. </li><li> 2.1 절에 설명 된 얼음처럼 차가운 지속적으로 가스를 공급 ACSF를 포함하는 해부 접시에 절제 미로 (그림 1)을 담가. 입체 현미경 아래에 미로를 개최달팽이관을 잡고하여 요리의 기초. 전방 반원의 운하 팽대부를 덮고있는 뼈에 멀리 스크래치 미세 집게를 사용합니다. 뼈에 작은 구멍이 달성되면 멀리 팽대부에서 뼈를 가볍게하기 시작합니다. 주의이 기본 막성 미로와 감각 상피에 손상을 일으킬 수 있으므로 뼈를 집게를 밀어하지 않도록주의해야한다. 전방과 인접한 수평 반원 막 덕트 및 ampullae 모두 (그림 2) 노출 될 때까지이 절차를 계속합니다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> 그림 1. 고립 된 마우스 전정 미로입니다. A. 왼쪽 패널) 고립 된 마우스 전정 미로의 도식 표현. 전정 감각 상피에 액세스하기위한 기준의 중요한 점은, 달팽이관, 전방, 수평 반원의 운하 실험실입니다으로 모델링. 별표 전정 감각 상피를 포함하는 반원의 운하 팽대부를 나타냅니다. B.는 1 개월 마우스에서 분리 된 전정 미로의 오른쪽 패널) 현미경 사진. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> 그림 2. 막성 전정 미로의 노출. 전방 수평 반원의 운하 ampullae를 덮고있는 뼈는 블랙 / 브라운 반점이 막 ampullae 및 관련 팽대부 신경 (CNVIII)을 나타 내기 위해 멀리 긁힌되었습니다. 하단 패널의 회로도 현미경의 강조 표시된 영역에서 구조를 나타내고 ampullae 및 CNVIII에 반원의 운하 덕트의 관계를 보여줍니다. <ol start="10"><li> 미세 집게를 사용, 가볍게 보장, 뼈 ​​미로에서 멀리 ampullae 및 관련 난형를 들어 그 ampullae의 중심 지역 (콘타감각 상피를) ining가 손상되지 않습니다. 어떤 경우에는 반원형 막 덕트의 근위 부분은 뼈 ampullae을 해제 홍채 가위로 잘라해야 할 수 있습니다. </li><li> Leibovitz의 L-15 배양액 (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO)로 가득 페트리 접시에 두 ampullae과 난형 낭을 포함하는 화음을 전송합니다. &quot;백라이트&quot;조직에 광학 섬유를 사용합니다. 이 ampullae 내 감각 상피를 포함하는 crista의 명확한 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 잘 홍채 가위로 난형의 얼룩덜룩 한 &quot;지붕&quot;의 절개를합니다. 전방의 지붕 그리고 수평 ampullae 통해 절개를 계속합니다. 합니다 (그림 3A)를 문의하지 않고 가능한 한 감각 상피의 가장자리에 가깝게 절개를합니다. 감각 상피를 덮고있는 막에는 조각 (그림 3B)가 없는지 확인 </li><li> 작은 GLAS에 고립 된 반 그대로 준비를 전송의 바닥 녹음 챔버 L-15 미디어로 채워진. 평평 U-모양의 백금 와이어 (그림 3B)에 고정 좋은 나일론 섬유의 격자를 사용하여 준비를 무게. 이상적으로, 그리드의 섬유 감각 상피를 덮어 쓰기하지 말아야하지만 더 많은 안정성이 요구되는 경우에, 어쩌면 선호하는 감각 상피를 끊어 버렸네 단 하나 섬유. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> 그림 3. 반 그대로 준비 및 전극 구성의 전정 감각 상피. A. 도식 표현의 고립 된 반 그대로 준비. crista을 덮고 팽대부는 감각 상피 (녹색)의 표면을 노출하는 &quot;드 지붕&quot;이다. 전방 (AC)과 수평 (HC) crista (난형를 보여 준 그대로 &#39;깡패&#39;의 준비 B. 현미경 사진 할 가려) AC 뒷다리. 녹음 챔버의 기초에 준비를 고정하는 데 사용되는 나일론 섬유를합니다. 스케일 바 :. 100 μm의 C. 개별 전정 헤어 셀 위치 기록 전극. 스케일 바 : 15 μm의. 3. 전기 생리학 <ol><li> 지속적으로 산소 L-15 배지로 준 그대로 준비를 붓는다. 미디어 녹음을 통해 모니터링해야 배지의 pH 표시기 (페놀 레드)와 색상을 포함합니다. 산소와 pH는 7.3-7.4이어야하며 붉은 색에 해당합니다. </li><li> 를 달성하기 위해 micropipette의 풀러 (모형 PP-830 Narishige, 일본)에 :; 두 단계 프로토콜 (50 열 2 단 72 열 1 단계)를 사용하여 1.5 mm (1.19 mm의 ID) 붕규산 유리에서 녹음 피펫을 준비 MΩ 3-4의 마지막 임피던스. </li><li> MgCl 2 (mm 단위) 110 KF, 12 KCl을 27 KOH 1, 염화나트륨, 10 HEPES, 10 EGTA, 1.8가 포함 된 칼륨 불소 기반의 내부 용액 3-4 mm 인 피펫의 정강이를 기입3 D-포도당과 2 NA-ATP, KOH로 pH를 7.4. </li><li> 멀리 아래로 전극을 절연 및 피펫 용량을 줄이기 위해 파라 필름 (parafilm)의 얇은 스트립 가능한 팁 피펫 2 ~ 3 배의 정강이를 래핑합니다. </li><li> 직립 현미경 (올림푸스 BX51)의 낮은 전력 배율 (배)에서 감각 상피에 피펫을 놓습니다. 높은 전력 (40X)로 전환 연결된 CCD 카메라로 개인의 전정 유모 세포를 시각화. </li><li> micromanipulator에 (셔터 악기, 캘리포니아, USA)를 사용하여 시각화 머리 세포 (그림 3C)의 막에 위치 피펫. 기가 옴 씰이 달성되면, 파열 피펫 홀더 흡입 포트를 통해 적용 부정적인 압력의 작은 양의 세포막. </li><li> 표준 기술 8-9를 사용하여 전체 셀 전압 클램프 녹음을합니다. </li></ol> 4. 두 광자 현미경 <ol><li> 5 mM의 오레곤 그린을 포함하는 0.9 % 생리 식염수를 준비488 BAPTA-1 (OGB-1, hexapotassium 소금, Invitrogen 사, 독일). </li><li> 감각 상피는 위의 방해임을 보장, 여전히 침수 동안 필터 종이의 작은 조각 (밀리 포아, 독일 4X4 mm, 두께 0.8 μm의)에 &quot;드 지붕&quot;반 그대로 깡패 준비를 놓습니다. </li><li> 합성 칼슘의 5 밀리미터 솔루션의 추가로 5 μL와 필터 종이 준비 펄스 발생기와 광대역 앰프의 조합으로 이루어진 electroporator의 염분 적용 기본 백금 전극 (7 μL) 위에, 그리고 덮개를 전송 표시 염료 오레곤 그린 488 BAPTA-1 (그림 4). </li></ol><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> 그림 4. 대량의 electroporation. A. 회로도 일렉트로 구성의 단면을 표시합니다. 준 그대로 준비 (*)는 칼슘 DY에 몰두 필터 종이에 배치됩니다E (오레곤 그린 488 BAPTA-1)과 전류는 2 백금 전극 사이에인가. Briggman 오일러 2011 년 10에서 적응. <ol start="4"><li> 오레곤 그린 488 BAPTA-1 용액을 만들어 접촉 할 때 준비의 방향을 방해하지 않도록주의, 대략 2 mm의 거리에서베이스 전극 위에 백금 전극과 평행을 가져온다. </li><li> 10-11, 준비 (+13 V, 10 밀리 초 펄스 폭, 1 Hz의 주파수, 10 방형 파 펄스 전류에 대한 매개 변수)를 통해 짧은 전류 펄스를 전달합니다. </li><li> L-15 배지로 가득 유리 바닥 녹음 챔버의 바닥에, 다시 감각 상피 위에서 방해 것을 보장 그것에 실리콘 오일 및 위치 반 그대로 준비의 작은 덩어​​리를 놓습니다. (포인트 2.13 참조) 위에서 설명한대로 이미지를 통해 안정성을 보장하기 위해 준비에 나일론 격자를 교체합니다. </li><li> 두 광자 현미경을 사용하여 sponta의 광학 녹음을표준 영상 프로토콜에게 10-11를 사용하여 감각 상피 (그림 7)에서 neous 칼슘 활동. </li></ol>

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<li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

균형 우리의 감각을 기본 메커니즘은 다른 감각 시스템에 비해 제한적인 주목을 받고 있고, 시각 및 청각 시스템을 예를 들어. 전정이나 균형 기능의 변화를 연구 한 연구의 대부분은 밸런스 전정 유모 세포 자체의 기본적인 빌딩 블록의 불완전한 지식, 전정 안구 반사 등의 행동 조치에 초점을 맞추고있다. 자신의 네이티브 환경에서 제거 심하게 격리 된 머리 세포를 사용하므로 유모 세포에 집중 한 그 연구는 거의 변함 했어요. 이 문서에서 우리는 이러한 기초 연구에 확장 마우스 전정 감각 상피의 반 그대로 준비를 보여줍니다. 전정 유모 세포는 상대적으로 견고하지만, 반 그대로 준비 유틸리티는 절단 속도에 매우 의존한다. 일반적으로 준비 루에서 가능한 상태로 유지됩니다절제술 후 약 2-5 시간의 기간 동안 M 온도. 따라서 동물이 기록에 안락사시에서 소요되는 시간을 최소화하는 것이 가장 중요합니다. 절단 (9 개월 된 생쥐에서 최대 25 분) 비교적 간단하고 3 주 된 ...

우리의 일상 생활에 전정의 큰 공헌에도 불구하고, 나이 전정 기능 관찰 하락에 대한 책임 프로세스의 명확한 이해가 어려운 남아있다. 지식이 부족 한 이유는 전정 기능이 저하 거의 독점적으로 전정 안구 반사 (VOR), 외적 전정 기능의 정확한 지표 등 행동 분석을 사용하여 탐구되었습니다,하지만 본질적인 구성 요소의 변경에 제한 통찰력을 제공합니다 . 이 건강, 질병 또는 노화 전정 헤어 세포 기능에 대한 우리의 이해에 큰 장애물이다. 각각의 전정 유모 세포의 많은 연구가되어 있지만, 주요 단점은 머리카락 세포와도 꽃받침 성의 터미널은 기계적 및 / 또는 효소 처리를 통해 정상적인 환경에서 제거됩니다 급성 머리 세포 준비에 의존하고있다. 이러한 접근 방식의 필연적BLY 머리 세포와 꽃받침, 헤어 세포와지지 세포 사이의 섬세한 마이크로 아키텍처를 중단. 준 그대로 준비 1-5, 그리고 고립 된 마우스 미로 준비 6의 발달과 함께, 더 밀접하게 생체 내에서 이러한 닮은 상태에서 시냅스 통신의 다양한 형태를 연구 할 수있는 기회가 지금있다. 실제로 임 하였다. (2011) I 전정 유모 세포가 neuroepithelium 내에 포함 된 유지하는 사람에 비해 심하게 고립 된 형식에서 기록 된 전체 셀 전류에 표시된 차이를 보였다. 특히 칼륨은 머리 세포 성의 꽃받침 사이 간 공간에 축적 생각하고, 크게 머리 세포 반응 7 변경합니다. 이러한 유형의 정보는 여기에 설명 된 전정 감각 상피의 반 그대로 준비없이 취득하는 것은 불가능합니다. 우리는 마우스 crista 3 반 그대로 준비를 보여줍니다, 및 전체 세포 패치 전기 생리학에서 얻은 대표적인 결과, 두 광자 칼슘 이미징을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Leibovitz medium L-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA-1-oregon green</td><td>Invitrogen</td><td>O6806</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>이광자 현미경</td><td>Olympus/La Vision</td><td>BX51WI/ TriMScope II</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 SF 집게</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>표준 패턴 가위</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>InstraTECH A-D 변환기</td><td>HEKA</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>셔터 Micromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-225/M</td><td></td></tr><tr><td>멀티클램프 증폭기</td><td>Axon Instruments</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 소프트웨어(전기생리학)</td><td>Axograph</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imspector 데이터 수집 소프트웨어(이광자)</td><td>Max Planck innovation</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

전기 생리학 및 고해상도 두 광자 현미경을위한 마우스 전정 감각 상피의 격리 된 세미 그대로 준비

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

이해 전정 유모 세포가 정상 조건 하에서 작동하는 방법이나 외상, 질병,이 기능을 방해 노화가 예방 방법 및 / 또는 새로운 치료 전략의 개발에 중요한 단계입니다. 그러나 비정상적인 전정 기능을 찾고 연구의 대부분은 세포 수준에서하고 있지만, 주로 보행 분석과 전정 안구 반사 성능과 같은 전정 기능 장애의 행동 분석에 집중하지 않았습니다. 이 작품은 일이 잘못 갈 때 일어나는에 대한 귀중한 데이터를 굴복하면서, 약간의 정보는 장애의 근본 원인에 대한 수집하고 있습니다. 전정 기능의 기초가 세포와 세포 내 프로세스에 집중하는 연구의 대부분은 시냅스 연결 및 지원 세포 환경의 결여 심하게 고립 된 유모 세포에 의존했다. 따라서 중요한 기술적 과제 준비에 절묘하게 맞는 전정 유모 세포에 액세스 할 수있다aration은 최소한 생리 학적, 중단됩니다. 여기에서 우리는 헤어 셀 / 기본 심성 단지 등 지역의 미세 환경을 유지 마우스 전정 감각 상피의 반 그대로 준비를 보여줍니다.

전정 유모 세포의 전기 생리학 속성들은 7 포함하는 내 복잡한 마이크로 아키텍처에 따라 다릅니다. 반 그대로 전정 상피 준비가 유형을 구별하는 데 사용할 수 있습니다 그림 5를 보여줍니다 I 유모 세포 (그림 5A), II 형 유모 세포 (그림 5B), 그리고 꽃받침 기본 심성 (그림 5C) 특징 전체 세포의 컨덕턴스에 따라. 이러한 특성은 탈분극하는 동안 발음 &quot;저하&quot;및 유형 I 머리카락 세포에서 큰 &quot;붕괴&quot;꼬리 전류와 꽃받침 기본 심성의 활동 전위 (그림 5C에있는 화살표)을 나타내는 과도 안쪽 나트륨 전류의 존재를 이용하실 수 있습니다. 준비는 개별 전정 머리 세포 유형에 대한 노화의 영향을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 6은...

전정 헤어 세포 기능의 분석은 두개골, 추체 측두골의 가장 어려운 부분 깊은 곳의 위치가 복잡합니다. 대부분의 기능 모발 세포 연구는 심하게 고립 된 유모 세포를 사용했습니다. 여기에서 우리는 전기 생리학 및 2 광자 현미경 연구를위한 마우스 전정 상피 세포의 반 그대로 준비에 대해 설명합니다.

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 전정 유모 세포의 기본적인 세포 및 세포 내 프로세스를 연구하는 데 사용할 수 있도록, 마우스 전정 감각 상피의 거의 정상적인 상태의 표본을 얻는 것입니다. 이를 위해 먼저 두개골에서 골성 전정 미로를 분리합니다. 두 번째 단계에서는 미세 핀셋으로 골성 미로를 조심스럽게 긁어내어 하부의 막성 미로를 노출시킨 후, 이를 골성 외피에서 완전히 제거합니다.다음으로, 미세 홍채 가위를 사용하여 상부 막을 절제함으로써 전정 감각 상피를 노출시킵니다. 마지막 단계는 반쯤 온전한 상태의 감각 상피 표본을 유리 바닥 챔버에 장착하고 무게추가 달린 나일론 망으로 고정하는 것입니다. 최종적으로, 패치 클램프 전기생리학과 이광자 현미경을 사용하여 각각의 전정 유모 세포 및 또는 일차 신경의 내인성 막 특성과 칼슘 신호 전달 프로파일을 각각 분석합니다.단리된 유모세포 표본을 포함한 기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 유모세포와 그 일차 구심성 신경세포의 배열을 가능한 한 정상 상태에 가깝게 유지할 수 있다는 점입니다. 이는 생리적 조건과 유사한 환경에서 측정을 수행할 수 있으며, 이러한 측정들을 동시에 진행할 수 있음을 의미합니다. 전정 기관이 두개골의 측두골 깊숙이 둘러싸여 있고 감각 상피 자체가 매우 작아 박리 과정에서 손상되기 쉽기 때문에, 박리법을 습득하는 것이 매우 어려우며 따라서 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.전기천공법과 이광자 절차의 시연은 본 연구실과 협력 중인 동료인 Stefano DeMarco가 진행하겠습니다. 지역 기관 및 정부 가이드라인에 따라 C 57 black six 마우스를 깊게 마취하고 안락사시킨 후 두개골을 노출시킵니다. Lambda 부위의 두개골에 작은 절개를 넣고 시상 봉합선을 따라 절개합니다. 이때 전단 날(shear blade)에 의해 뇌가 끌려가지 않도록 주의하십시오.이 단계에서는 조직을 냉각시키기 위해 얼음처럼 차가운 A CSF를 뇌에 도포한 후, 얕게 구부러진 Pearson 포셉을 사용하여 두정골은 외측으로, 후두골은 후방으로 조심스럽게 벗겨냅니다. 이때 다시 한번 얼음처럼 차가운 A CSF를 도포합니다. 다음으로, 작은 스테인리스 스패튤라를 사용하여 중두개와 및 후두개와 표면에서 뇌를 부드럽게 들어 올립니다. 이제 중두개와에서 와우가 향하고 있는 전정미로가 명확하게 보입니다.얼음처럼 차가운 A CSF를 내측으로 추가하고 전정 미로의 양측을 조정합니다. 그런 다음 전반고리관을 잡고 외측으로 당겨 전정 미로를 조심스럽게 절제합니다. 절제한 미로를 얼음처럼 차가운 액체가 담긴 해부 접시에 담급니다.스테레오 현미경 아래에 지속적으로 가스 공급이 이루어지는 A CSF를 배치합니다. 이 도식은 적출된 미로를 상세히 보여줍니다. 다음으로, 스테레오 현미경 하에서 미세 핀셋으로 와우를 잡고 미로를 디쉬 바닥에 고정합니다.두 번째 포셉을 사용하여 전반고리관 팽대부 상단의 골 조직을 긁어냅니다. 뼈에 작은 구멍이 생기면, 팽대부로부터 뼈 조각을 튕겨내듯 제거하기 시작합니다. 포셉을 뼈 너머로 밀어 넣지 않도록 주의하십시오. 이는 하부의 막성 미로와 감각 상피에 손상을 줄 수 있습니다.여기 보이는 것과 같이 전반고리관 및 인접한 수평반고리관의 막, 관 및 구형낭이 모두 노출될 때까지 이 절차를 계속하십시오. 이제 미세 핀셋을 사용하여 구형낭과 연관된 난형낭을 골미로에서 조심스럽게 들어 올리며, 감각 상피가 포함된 구형낭의 중앙 영역이 손상되지 않도록 주의하십시오. 두 개의 구형낭과 난형낭이 포함된 삼조직을 Lebovitz's L 15 배양액이 채워진 페트리 접시로 옮기십시오.광섬유를 사용하여 조직의 뒷면에 빛을 비춰 팽대부 내의 감각 상피를 포함하는 Krista를 명확하게 시각화합니다. 이제 미세 홍채 가위를 사용하여 팽대부의 반점이 있는 지붕 부위를 조심스럽게 절개합니다. 감각 상피에 닿지 않도록 주의하면서 가능한 한 상피의 가장자리에 가깝게 절개하십시오.여기에 표시된 것처럼, 감각 상피 위에 막 조각이 덮여 있지 않은지 확인하십시오. 이 도식은 최종 준비물의 형태와 기록 전극의 배치를 보여줍니다. 분리된 반온전(semi intact) 준비물을 L 15 배지가 채워진 작은 유리 바닥 기록 챔버로 옮기십시오. 평평한 U자형 백금 와이어에 고정된 미세 나일론 섬유 그리드를 사용하여 준비물을 아래로 누르십시오. 이제 조직은 전기생리학적 기록을 수행할 준비가 되었습니다.지속적으로 산소가 공급된 L 15 배지를 사용하여 반-온전한(semi intact) 표본에 관류를 실시합니다. 배지가 붉은색을 유지하여 산소 상태에서의 pH가 7.3에서 7.4임을 나타내도록 합니다. 절차 전반에 걸쳐 내경이 1.19 millimeter인 1.5 millimeter 유리관으로 기록용 피펫을 준비합니다.마이크로 피펫 풀러(micro pipette puller)를 사용하여 2단계 프로토콜로 실리케이트 유리를 가공하여 최종 임피던스가 3~4 MΩ이 되도록 합니다. 피펫의 섕크(shank) 부분에 불화칼륨(potassium fluoride) 기반의 내부 용액을 3~4 mm 채웁니다. 그다음, 전극을 절연하고 피펫 커패시턴스를 줄이기 위해 파라필름(param) 얇은 조각으로 피펫 섕크를 팁에 최대한 가깝게 2~3회 감싸줍니다.정립 현미경의 5배 저배율 상태에서 피펫을 감각 상피 위에 위치시킵니다. 40배 고배율로 전환하고 CCD 카메라를 통해 개별 전정 유모 세포를 시각화합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 시각화된 유모 세포의 막 위에 피펫을 위치시킵니다.기가옴 씰(giga ohm seal)이 형성되면, 피펫 홀더의 흡입 포트를 통해 소량의 음압을 가해 세포막을 파열시키고, 이광자 현미경의 표준 기술을 사용하여 전세포 전압 클램프 기록을 수행합니다. 지붕 제거(de deroofing) 상태를 반쯤 유지하십시오. 준비된 시료를 침전시킨 후 작은 필터 페이퍼 조각 위로 옮깁니다.감각 상피의 윗부분이 막혀 있지 않은지 확인하십시오. 필터 페이퍼와 표본을 식염수가 도포된 일렉트로포어(electro por)의 하단 백금 전극 위에 올리십시오. 표본의 방향이 흐트러지지 않도록 주의하면서, 상단 백금 전극을 하단 전극과 평행하게 맞추고 약 2 mm 거리까지 접근시키십시오.Oregon Green 4 88 bafta와 접촉했을 때, 이 이미지에서 보는 바와 같이 하나의 용액을 제조합니다. 준비물에 짧은 전류 펄스를 가합니다. L 15 배지로 채워진 유리 바닥 기록 챔버 바닥에 실리콘 오일을 소량 도포합니다.그런 다음, 감각 상피가 위쪽에서 가려지지 않도록 주의하며 반부분 절제 표본을 다시 그 위에 배치합니다. 이미징 과정 동안 안정성을 유지하기 위해 표본 위에 나일론 그리드를 다시 덮어줍니다. 이어서 이광자 현미경을 사용하여 표준 이미징 프로토콜에 따라 감각 상피의 자발적 칼슘 활성을 광학적으로 기록합니다.이 이미지는 여기 화살표로 표시된 커다란 붕괴 꼬리 전류(collapsing tail currents)가 특징인 1형 전정 유모 세포에서 기록된 전체 세포 전류를 보여줍니다. 전체 세포 전류가 2형 전정 유모 세포에서 기록되었습니다. 꼬리 전류가 나타나지 않음에 유의하십시오.이 이미지는 -120 mV의 음성 휴지 전위로부터 탈분극된 후, 화살표로 표시된 일시적인 나트륨 매개 전류가 특징인 칼릭스 일차 구심성 신경의 전체 세포 기록(whole cell recording)을 보여줍니다. 모든 세포는 -60 mV로 유지되었습니다. 이 그림은 탈분극 지속 시간의 증가에 반응하여 어린 쥐와 고령 쥐에서 기록된 2형 유모 세포의 IV 관계를 보여줍니다.이 히스토그램들은 100 millisecond IV 곡선을 기반으로 한 어린 쥐와 늙은 쥐의 2형 유모세포의 평균 전도도 및 활성화 비율을 보여줍니다. 이 이광자 현미경 사진은 상단 패널의 일반 L 15 PERFU 8 또는 하단 패널의 100 millimolar potassium chloride가 포함된 L 15에 반응하여 나타나는 BAFTA one Oregon green 칼슘 활성화를 보여줍니다. 화살표는 potassium chloride 첨가 전후의 동일한 개별 유모세포를 나타냅니다.이 그래프는 이전 이미지에서 화살표로 표시된 개별 세포의 칼슘 형광 프로파일을 보여줍니다. 감각 상피의 이 이광자 현미경 사진은 개별 유모 세포에 로딩된 Oregon Green 488 bta-1을 보여줍니다. 삽입도는 화살표로 표시된 1형 유모 세포 세포질 또는 이중 화살표로 표시된 1형 유모 세포를 둘러싼 칼릭스 일차 구심성 신경 말단으로의 칼슘 세포 내 국소화를 보여줍니다.숙달되면 해부 과정은 10분 미만으로 소요될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 전정 감각 상피를 분리하는 방법, 상피의 온전함을 유지하는 방법, 그리고 전기생리학적 기록 및 이광자 칼슘 이미징을 위해 생존력을 유지하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

an-isolated-semi-intact-preparation-mouse-vestibular-sensory

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

이 비디오는 쥐 성기 장기(VNO)의 분리 및 진동 절편을 위한 조직 준비에 대해 간략하게 설명합니다. 섹션은 특정 감각 뉴런 그룹의 생물물리학적, 생리학적 특성을 특성화하는 데 사용됩니다.

Vibratome Sectioning을 위한 Mouse Vomeronasal Organ의 준비

이 비디오는 플랫 마운트 마우스 망막에서 전기 생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 기술을 보여줍니다. 전극이 있는 얇은 유리 피펫을 사용하여 망막 내의 별방울 무축삭 세포(SAC)에 접근합니다. 씰을 형성한 후 흡입이 가해져 멤브레인을 파열하고 전체 세포 패치 클램프 구성을 형성합니다. 마지막으로, SAC 시냅스 수용체를 통한 이온의 흐름은 구성을 사용하여 측정됩니다.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

출처: Van Wonterghem, E., et al. Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus(쥐 맥락막 신경총의 Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy) 시각화. J. Vis. Exp. (2022)이 비디오는 주사전자현미경(SEM)을 사용하여 마우스 뇌에서 맥락막 신경총 조직을 준비하고 이미징하는 방법을 보여줍니다. 이 공정에는 조직 고정, 탈수 및 전도성 백금 층으로 코팅하여 이미징을 위해 샘플을 안정화하고 준비하는 것이 포함됩니다. SEM은 미세융모로 상피 세포의 상세한 이미지를 캡처하여 조직의 구조적 특징에 대한 통찰력을 제공합니다.

Visualization of a Mouse Brain Choroid Plexus Using Scanning Electron Microscopy(주사 전자 현미경을 사용한 마우스 뇌 맥락막 신경총의 시각화)

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