세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화

다음 실험의 전체적인 목표는 체세포 피부 유래 줄기세포를 사용하여 난모세포 유사 세포를 형성하는 것입니다. 이는 신생 마우스 피부에서 유래한 깨끗한 미분화 줄기세포를 활용함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 줄기세포를 단일 세포로 분리하여 분화 준비 과정을 거칩니다.

다음으로, 줄기세포를 정해진 분화 배지에 플레이팅합니다. 생식세포 형성을 유도하기 위해 반정량적 실시간 PCR을 기반으로 난모세포 특이적 마커의 발현을 확인하여 결과를 얻습니다. 이 방법은 생식 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

생식 세포, eSight 형성 및 발달을 연구할 수 있는 폐쇄형 시스템을 제공함으로써, 프로토콜에 필요한 모든 배지는 사용 2~3시간 전에 준비하여 실험이 진행될 세포 배양 인큐베이터 내에 캡을 느슨하게 닫아 보관해야 합니다. 여기서 사용되는 두 가지 배지는 D-M-A-M-F 12에 B 27, BFGF 및 EGF를 첨가한 줄기세포 배지와, M1 99에 FSH, LH, B-S-A-I-T-S, sodium pyruvate, tuin 및 EGF를 첨가한 생식 세포 분화 배지입니다. 줄기세포는 갓 태어난 생쥐로부터 분리합니다.

2~4세대(passage two through four)의 펍(pups)을 사용하여 인 비트로(in vitro) 생식세포 분화를 진행합니다. 시트 유사 세포(cyte like cell) 또는 OLC 형성 효율은 시작 단계의 줄기세포 품질과 직접적인 관련이 있으므로, 세포군이 깨끗하고 건강해 보이는 즉시 분화를 시작하는 것이 가장 좋으며, 이는 일반적으로 2세대 무렵입니다. 분화 전배양을 시작하기 48시간 전에 세롤로지컬 피펫을 사용하여 줄기세포를 하위 배양하고, 배양 접시에서 부유된 구형 세포 응집물과 폐배지를 모두 제거하여 15 mL 튜브에 담습니다. 이때 접시 바닥에 부착되어 자연적으로 분화하고 있는 세포가 아니라, 부유된 구형의 세포 응집물만 수집하는 것이 중요합니다.

500 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성하고, 상층액을 제거한 뒤 500 µL의 신선한 줄기세포 배지에 세포를 재현탁합니다. 37 °C로 가온합니다. 응집체를 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 부분적으로 해리시킵니다.

세포 생존율이 저하될 수 있으므로 세포를 너무 강하게 파이펫팅하지 마십시오. 저부착 10 centimeter 세포 배양 접시에서 9.5 milliliters의 신선하고 예열된 줄기세포 배지로 부분적으로 해리된 세포를 세척합니다. 세포를 37 degrees Celsius, 5%CO2 세포 배양 인큐베이터로 옮겨 48시간 동안 배양합니다.

OLC 분화 절차를 시작하려면, 세롤로지 피펫을 사용하여 배양 접시에서 줄기세포를 제거하고 15 mL 튜브에 넣습니다. 부착된 세포는 남겨둡니다. 세포를 500 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛을 형성하고, 상층액을 제거한 후 500 µL의 멸균 PBS에 세포를 재현탁합니다. 와이드 보어 1000 µL 팁을 사용하여 세포가 10~20개 이하의 덩어리가 되도록 강하게 피펫팅합니다.

본 프로토콜을 성공시키기 위해서는 해리 과정 중에 적절한 수준의 해리가 이루어지는지 확인하기 위해 해리 정도를 정기적으로 점검하는 것이 매우 중요합니다. 주기적으로 소량의 세포를 채취하여 백색광 현미경으로 관찰함으로써, 응집된 세포들이 10~20개의 개별 세포 덩어리를 형성하고 있는지 확인하십시오. 과도한 해리는 세포 생존율을 저하시키므로 세포를 과하게 해리하지 마십시오.

다음으로, 해리된 세포에 9.5 milliliters의 PBS를 추가하고, 이 세포 현탁액 15 microliters를 세포 계수를 위해 혈구계수기에 옮깁니다. 세포를 500 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 침전시킵니다. 상층액을 제거한 후, 세포를 분화 배지에 1.32 × 10⁶ cells/milliliter 농도가 되도록 재현탁합니다.

평평한 바닥의 24웰 부유 배양 디쉬의 각 웰에 500 µL씩 세포를 분주합니다. 24웰 디쉬를 37 °C, 5% CO2 조건의 세포 배양 인큐베이터에 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후, 각 웰에서 250 µL의 배지를 제거하여 각각 라벨이 부착된 1.5 mL 튜브에 옮깁니다.

각 웰에 신선한 분화 배지 250 µL를 넣고, 사용한 배지를 500 ×g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 펠렛화된 세포를 신선한 분화 배지 50 µL에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 분화 플레이트의 해당 배양 웰로 다시 옮깁니다. 분화 12일까지 48시간마다 동일한 방식으로 배지의 절반을 교체합니다.

분화 초기 단계에서 세포는 배양 접시 바닥에 부착되어 넓게 퍼집니다. 이 대표 이미지에서는 분화 42~72시간 된 세포 중 OCT four 양성 세포를 보여줍니다. 미분화 줄기세포 마커는 녹색으로 표시되었으며, 핵은 hirst로 대조 염색하여 청색으로 표시되었습니다.

분화가 진행됨에 따라, 일부 세포 응집체에서 녹색으로 표시된 OCT four 양성 세포들이 OCT four 음성 세포들에 둘러싸여 있는 것을 확인할 수 있습니다. 이 이미지의 스케일 바는 100 microns입니다. 이 그림은 배양 표면에서 분리된 여포 유사 구조의 백색광 이미지를 보여주며, 스케일 바는 40 microns를 나타냅니다.

배양을 지속하면 LCS는 직경 약 45 µm까지 성장합니다. 이 이미지의 스케일 바는 10 µm를 나타냅니다. OCT 4 양성인 거대 LCS가 세포들에 둘러싸여 있거나 배양액 내에 단독으로 존재하는 것을 확인할 수 있습니다.

이러한 LCS는 지지 세포와 함께 수집하거나 트립신 처리를 통해 다른 세포가 부착되지 않은 상태의 LCS를 얻을 수 있습니다. LCS가 천연 ol 부위와 유사한 전사체를 발현하는지 확인하기 위해, LCS를 수집하여 Z-P-C-S-C-P three CMOs, T four BMP 15, vasa와 같은 공통 OO 부위 마커의 발현을 테스트했습니다. 이 그림은 10 Newborn mouse cytes 대비 10 LCS에서의 이러한 마커들의 전사체 수준을 보여줍니다.

결과에 따르면 LCS는 cytes보다 ZPC를 적게 발현합니다. ZPC는 CYTE 특유의 zop lucidum 막 구조의 구성 성분이므로, 이는 lcs의 zita 막이 더 얇고 취약한 성질을 갖는 이유를 설명해 줄 수 있습니다. 감수분열 SCP three의 발현은 천연 cytes와 비교했을 때 LCS에서 더 높게 나타납니다.

하지만, 다른 감수분열 마커인 CMOs는 더 낮은 수준으로 발현됩니다. 이러한 발현 수준의 차이는 현재 LCS가 감수분열을 완료하지 못하는 이유를 부분적으로 설명해 줄 수 있습니다. BMP 15 및 vasa와 같은 다른 마커들은 lcs와 O 부위 간에 유의미한 차이가 없습니다.

이 절차를 시도할 때, 초기 줄기세포 집단의 건강 상태가 성공의 결정적인 요인임을 기억하는 것이 중요합니다.