원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정
2013년 6월 27일
이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 원자력 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 탄성 계수를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 셀의 다양한 위치에서 FM 힘 분광법 측정을 수행하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 모든 강제 거리 곡선을 분석하여 A FM 팁이 처음에 셀과 접촉하는 지점을 결정합니다.
다음으로, 접촉 지점에서 시작하여 처음 200-300나노미터의 압흔 데이터가 헤르츠 모델에 피팅됩니다. 탄성 계수를 추출하기 위해 결과는 각 픽셀이 단일 강제 거리 곡선을 나타내는 힘 매핑 모드를 사용하여 얻은 셀 강성의 2D 맵을 생성합니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Guen Thomas가 할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 캔틸레버 홀더를 70% 에탄올로 청소하고 건조시키십시오.
그런 다음 제조업체의 지침에 따라 bru DNP 10 캔틸레버를 A FM에 로드합니다. 다음으로 역 광학 레버 감도를 보정합니다. 이 매개변수는 캔틸레버 편향의 나노미터당 볼트 단위로 포토다이오드 응답의 양을 설명합니다.
이를 위해 먼저 깨끗한 유리 슬라이드를 샘플 스테이지에 로드합니다. FM 헤드를 설치하고 제조업체의 지침에 따라 레이저 빔과 정렬을 조정합니다. 정렬되면 P eight O를 빼낸 상태에서 유리 슬라이드의 A FM 팁을 맞춥니다.
미러를 음의 2볼트의 포토 다이오드 판독값에 다시 정렬합니다. 그런 다음 최대 포토 다이오드 응답 또는 양의 2볼트의 트리거 포인트로 힘 분광법 측정을 수행합니다. 데이터 수집이 완료된 후 힘 곡선의 확고한 접촉 영역을 확대하고 이 영역에 선형 피팅을 수행합니다.
나노미터당 볼트 단위의 기울기를 찾으려면 미러 정렬을 0볼트의 자유 편향으로 재설정하십시오. 다음으로, Levy와 Malam이 설명한 열 조정 방법을 사용하여 캔틸레버 스프링 상수를 보정합니다. 시작하려면 스캐너를 샘플 스테이지에서 멀리 들어 올려 팁과 샘플 사이에 상호 작용이 없도록 합니다.
그런 다음 캔틸레버 빔의 열 진동을 기록하여 열 데이터를 캡처합니다. A FM 소프트웨어는 이러한 열 진동의 전력 스펙트럼을 분석하고 데이터 창에 표시합니다. 다음으로, 가장 낮은 주파수(기본 공진 피크라고도 함)를 중심으로 하는 데이터 세그먼트에 대한 피팅을 수행하여 스프링 상수를 확인합니다.
배양 플레이트용 FM을 준비하려면 FM s에 식기 히터 액세서리를 설치하십시오.tage 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 시스템이 안정적인 열 평형에 도달할 때까지 20분 동안 기다립니다. 예열이 완료되면 배양 접시를 FM s에 놓습니다.tage cl을 사용하여 고정합니다.amp 30분 이상 측정을 위해 식기 히터와 함께 제공된 경우 일반 배양 배지를 교체하기 위해 이산화탄소 독립 매체를 사용해야 합니다.
다음으로, A FM 캔틸레버 팁에 섭씨 37도의 배양 배지를 약간 떨어뜨리고 팁이 액체에 잠길 때까지 FM 헤드를 내립니다. 평면도 CCD 카메라를 사용하여 캔틸레버의 레이저 빔을 다시 정렬합니다. 액체의 정렬은 매체의 굴절률 변화로 인해 공기와 다릅니다.
정렬이 완료되면 A FM 팁을 배양 접시의 무세포 영역에 맞물리고 액체 환경에서 역 광학 레버 감도 보정을 수행합니다. 세포의 기계적 특성 측정을 시작하려면 광학 현미경을 사용하여 캔틸레버 팁을 세포의 펄 아이 영역 위에 놓습니다. 캔틸레버 위치의 정밀한 조정은 X 및 Y 스캐너에 오프셋을 적용하여 수행됩니다.
그런 다음 FM을 4 분광 모드로 전환하고 압입 속도를 초당 5 마이크로 미터로 설정하며, 이는 유체 역학 효과를 피할 수있을만큼 낮습니다. 다음으로, 편향 트리거 지점을 2나노 뉴턴으로 설정합니다. 세포 손상을 방지하려면 샘플 강성에 따라 이 값을 조정하십시오.
또한 편향 신호의 드리프트를 수정하는 상대 트리거링 옵션을 선택합니다. 그런 다음 힘 거리를 5마이크로미터로 설정하여 힘 측정 사이에 팁이 셀에서 완전히 분리되도록 합니다. 각 조건에 대해 최소 30개 세포의 핵 영역의 서로 다른 위치에서 세 가지 힘 곡선을 수집합니다.
각 셀에서 여러 곡선을 사용하는 것이 유리하지만. 신뢰할 수 있는 통계 데이터를 위해 너무 많이 복용하면 A FM 프로브로 인한 조난에 대한 세포 강성의 변화로 이어질 수 있습니다. force map 모드를 사용하여 단일 셀 전체의 기계적 특성 분포를 추가로 특성화합니다.
포스 맵 모드에서 스캔 크기를 30마이크로미터로, 해상도를 32 x 32로 설정하고, 들여쓰기 매개변수는 단일 힘 곡선에 대해 선택한 매개변수와 동일합니다. 그런 다음 A FM은 샘플 영역의 각 픽셀에서 단일 힘 곡선을 취하고 전체 영역의 강성 맵을 제공합니다. 다음으로, MATLAB을 사용하여 기록된 힘 곡선을 분석하여 셀 강성을 계산합니다.
먼저 Lynette Al이 처음 발표한 알고리즘을 채택하여 matlab을 사용하여 각 점에서 선형 피팅과 헤르츠 피팅을 모두 계산합니다. 두 피팅의 상대 RMS 오차를 계산하고 각 점에서 이러한 값을 합산합니다. 최소 총 피팅 오류에 도달하는 지점이 초기 접촉점으로 선택되며, 이 지점을 찾는 것은 세포의 영률을 정확하게 측정하는 데 중요합니다.
다음으로, 샘플 변형 델타를 계산합니다. 다음 방정식을 사용하면 변형은 셀 접촉 전의 0과 같으며, 여기서 Z는 Z보다 작고, 0은 캔틸레버 처짐 D와 접촉점을 지나는 총 거리 Z의 차이와 같습니다. 그런 다음 다음 방정식을 사용하여 압입력 F를 계산하며, 여기서 힘은 셀 접촉 전에 0과 같으며, 여기서 Z는 Z보다 작고, 0은 캔틸레버의 스프링 상수 K에 접촉 지점을 지나는 캔틸레버 처짐을 곱한 값과 같습니다.
그런 다음 Elise square의 적합도를 Hertz 모델의 접촉 후 영역에서 샘플 변형 대 압입력 데이터에 적용하여 표시된 팁의 모양을 기반으로 셀의 Young's modulus를 추출합니다. 다음은 3개의 서로 다른 표면에서 배양된 3개의 T, 3개의 섬유 아세포 세포에서 가져온 대표적인 힘 곡선입니다. 여기에서 볼 수 있듯이 다양한 표면은 세포 세포골격의 강성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
단단한 플라스틱 표면에서 배양된 세포의 평균 변형은 빨간색으로 표시됩니다. 뻣뻣한 폴리 아크릴아미드 겔에서 자란 것은 자주색으로 표시되고 탄성 폴리 아크릴아미드 겔에서 자란 것은 파란색으로 표시됩니다. 곡선에서 접촉점을 주의 깊게 식별한 후 셀 변형의 함수로서의 압입력을 정확하게 표시할 수 있습니다.
또한, 그들의 Young's modular, 나는 접촉 후 처음 300나노미터의 움푹 들어간 곳에서 정확하게 계산할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 중간 필라멘트의 일종인 녹색 형광 단백질 태그가 지정된 menton으로 형질 주입된 섬유아세포입니다. 이미지가 밝을수록 해당 영역에 더 많은 멘톤이 있습니다.
이것은 세포 골격의 강성과 관련될 수 있습니다. 여기에 제시된 FM 힘 매핑 기술을 사용하면 32 x 32 픽셀의 해상도를 가진 fiberblast의 유사한 강성 맵을 표시 할 수 있으며, 여기서 각 픽셀은 2.5 x 2.5 미크론의 세포 표면적을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 원자력 현미경을 사용하여 살아있는 조직 세포의 탄력성을 측정하는 방법에 대한 좋은 아이디어를 얻을 수 있을 것입니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
이 논문은 원자력 현미경(AFM)을 사용한 마이크로인덴테이션을 통해 생체 세포의 기계적 특성을 특성화하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 연구는 힘 분광법과 데이터 분석을 통해 생체 세포의 탄성 계수를 측정하는 데 중점을 둡니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 역학
- 생물물리학
- 원자력 현미경
배경
- 세포의 기계적 특성을 이해하는 것은 다양한 생물학적 응용에 매우 중요합니다.
- 원자력 현미경(AFM)은 세포 경도의 고해상도 측정을 가능하게 합니다.
- 탄성 계수는 세포의 기계적 특성을 평가하는 핵심 매개변수입니다.
- 힘 매핑은 세포 경도의 공간적 변화에 대한 상세한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
연구 목적
- AFM을 사용하여 생체 세포의 탄성 계수를 측정합니다.
- 세포 역학적 특성을 특성화하기 위한 프로토콜을 개발합니다.
- 힘 매핑 데이터를 기반으로 세포 경도의 2D 맵을 생성합니다.
사용된 방법
- 세포의 다양한 위치에서 FM 힘 분광법 측정.
- 접점을 결정하기 위한 강제 거리 곡선 분석.
- 탄성 계수 추출을 위해 탄입 데이터를 Hertz 모델에 적합합니다.
- 세포의 2D 경도 맵을 생성하기 위한 힘 매핑 모드.
주요 결과
- 생체 세포의 탄성 계수 측정에 성공했습니다.
- 세포 경도의 변화를 보여주는 상세한 2D 맵을 생성했습니다.
- 대학원생이 프로토콜을 시연했습니다.
- 세포 역학적 특성을 특성화하는 신뢰할 수 있는 방법을 확립했습니다.
결론
- 이 프로토콜은 세포 역학을 연구하는 연구자들에게 귀중한 도구를 제공합니다.
- AFM 기반 측정은 세포 행동에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
- 미래의 응용 분야에는 질병 상태 및 세포 반응 연구가 포함될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of cell mechanical properties using atomic force microscopy (AFM) enables biopharma teams to assess cellular responses to microenvironmental changes, supporting early discovery and target validation. Reliable stiffness mapping informs mechanistic de-risking and predictive confidence in disease-relevant systems, directly impacting portfolio triage and translational research. Integrating AFM-based elasticity measurements strengthens decision-making at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of cell stiffness as a functional biomarker for physiological or pathological states.
- Supports mechanistic de-risking by correlating cytoskeletal changes with disease models or compound effects.
- Facilitates hypothesis testing regarding cellular responses to substrate or genetic perturbations.
- Provides quantitative endpoints for target validation in cell-based assays.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, quantitative force curves and stiffness maps for assay standardization.
- Enables high-content screening of mechanical phenotypes across multiple cell conditions.
- Supports development of robust, scalable assays for compound evaluation targeting cell mechanics.
- Improves assay readiness by integrating force mapping with automated data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanical property measurements with disease-relevant phenotypes for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by linking cell mechanics to functional outcomes.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, physiologically relevant data.
- Supports predictive de-risking in preclinical models by mapping mechanical heterogeneity.
Pipeline & Workflow Integration
AFM-based cell stiffness measurement fits within the early discovery to preclinical continuum, providing a bridge between mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative force mapping clarifies cellular responses and de-risks biological hypotheses.
- Screening: Standardized force spectroscopy outputs enable reproducible comparison across conditions and compounds.
- Analytics: MATLAB-based analysis yields quantitative Young's modulus values and spatial stiffness maps for robust data interpretation.
- Translational Research: Mechanical phenotyping aligns with disease models and supports biomarker continuity.
- Enterprise Reuse: AFM protocols and analysis routines are adaptable across cell types and experimental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based models.
- Operational Value: Standardizes mechanical property measurement and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs based on functional cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, force spectroscopy, and quantitative data analysis.
- Demands access to calibrated AFM instrumentation and compatible analysis software (e.g., MATLAB routines).
- Necessitates cross-team standardization of calibration, measurement, and analysis protocols.
- Adaptable to various cell types and substrates with careful adjustment of indentation parameters.
- Potential limitations include probe-induced cell stress and the need for careful contact point identification.
