Name: 원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 배우세요 원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 탄성률을 측정하는 방법을. 힘 분광법과 헤르츠 모델 피팅을 통해 세포 기계적 특성을 정량화하고 2D 강성 지도를 생성할 수 있습니다.

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저자는이 논문에서 사용 된 세포주를 제공하기 위해 펜실베니아 대학에서 박사 폴 Janmey 감사합니다. QW는 AFM 기술에 대한 통찰력있는 논의를 위해 JF 바이 필드와 에반 앤더슨을 인정합니다.

1. 캔틸레버의 스프링 상수 보정 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 AFM으로 캔틸레버를 넣습니다. 그것은 어떤 실험을하기 전에 에탄올로 캔틸레버 홀더를 청소해야합니다. 이 AFM 측정시 문화 세균 오염을 제한하는 데 도움이됩니다. </li><li> InvOLS을 (역 광 레버 감도) 보정합니다. 이 매개 변수는 캔틸레버 편향 나노 미터 당 다이오드 응답 (볼트)의 양을 설명합니다. </li><li> 샘플 무대에 깨끗한 유리 슬라이드를로드 한 후 제조업체의 지침에 따라 AFM 헤드를 설치하고 레이저 빔과 정렬을 조정합니다. 유리 슬라이드에 AFM 팁을 갖습니다. </li><li> 압전 철회로, -2의 포토 다이오드 독서 미러를 다시 정렬 V. +2의 트리거 포인트 (최대 다이오드 응답)에 힘 분광 측정을 수행 V. </li><li> 압전 철회로, -2의 포토 다이오드 독서 미러를 다시 정렬 V. FO를 수행+2 V. 노트의 트리거 포인트 (최대 다이오드 응답)로 경찰 분광 측정 : 여기 전압 값은 정신 병원 AFM에 따라 다릅니다. 이 값은 제조업체에서 제공하는 사양에 따라 설정해야합니다. 데이터 수집이 완료되면, 힘 곡선의 확고한 접촉 영역을 확대. V / 뉴 멕시코에있을 것이다 경사를 찾기 위해이 지역에 선형 피팅을 수행합니다. 이 값의 역수는 캔틸레버 다이오드 앙상블의 광 감도를 설명합니다. </li><li> 0의 무료 편향에 거울 정렬을 다시 V. </li><li> 캔틸레버의 스프링 상수 보정합니다. 열 조정 방법은 캔틸레버 28 스프링 상수를 결정하는 데 사용됩니다. </li><li> InvOLS을 보정 한 후, 팁과 샘플 사이의 상호 작용이 없다는 것을 같은 샘플 단계에서 스캐너를 멀리 올립니다. </li><li> 열 데이터를 캡처 시작합니다. 이 과정에서, 외팔보의 열 진동 기록 병입니다라. AFM 소프트웨어는 열 진동 및 데이터 창에서 플롯을의 파워 스펙트럼을 분석합니다. </li><li> 데이터 수집의 몇 초 후에, 스프링 상수를 결정하기 위해 낮은 주파수 (기본 공명) 피크를 중심으로 데이터 세그먼트에 적합을 수행합니다. </li></ol> 2. 샘플을로드 <ol><li> AFM 무대에서 접시 히터 액세서리를 설치, 이미 장착되지 않은 경우. </li><li> 37 ° C 온도를 설정하고 안정적​​인 열적 평형에 도달하도록 시스템을위한 20 분을 기다립니다. </li><li> AFM 무대에서 배양 접시를 놓고 접시 히터와 함께 제공되는 클램프를 사용하여 고정합니다. 그것은 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세포에 외상을 방지하기 위해 무대에 배치 사이의 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 30 분 이상 측정, CO 2 독립 매체는 일반 문화 매체를 대체하는 데 사용되어야한다. </li><li> T의 끝을 37 ° C 배양 배지의 작은 방울을 적용그는 AFM 캔틸레버와 팁 그냥 액체에 빠져들 때까지 AFM 헤드를 낮 춥니 다. </li><li> 상위 뷰 CCD 카메라를 사용하여 외팔보 (액체 정렬 때문에 매체의 굴절률의 변화, 공기 다를 것이다)에 레이저 빔을 맞 춥니 다. </li><li> 배양 접시의 청정 지역에서 AFM 팁을 갖습니다. </li><li> 액체 환경에서 캔틸레버 감도, 위에서 설명한대로 InvOLS 교정을 수행합니다. </li></ol> 참고 : 세포가 수화를 배양하는 경우)는, InvOLS의 교정은 세포 배양 매체로 가득 배양 접시의 바닥면에 대하여 사전에 수행해야합니다. 세포 샘플을 전환 할 때 특별한주의가 캔틸레버와 레이저 빔 정렬을 변경하지 지불해야합니다. B) InvOLS는 레이저 정렬에 변화가있을 때마다 다시 보정해야합니다. C) 그것은 또한 몇개의 교정 곡선의에서 값의 평균으로 InvOLS을하는 것이 좋습니다각 교정은 다른 InvOLS를 생성 인스. InvOLS의 변동은 평균값을 비교하지만, 작은 수 있습니다. 예를 들어, 100 배 0.06 N 액체 / m의 스프링 상수와 브루 커 DNP-10 캔틸레버를 교정하는 0.5 나노 / 표준 편차, 66.3 nm의 / V의 평균 InvOLS 값을 생성 V. 3. 셀의 들여 쓰기 힘 곡선 수집 <ol><li> 들여 쓰기 셀을 선택합니다. 광학 현미경의 도움으로, 끝이 요정 핵 지역에 위치한되도록 셀 위의 캔틸레버를 배치하는 단계를 이동합니다. 캔틸레버의 위치를​​ 정밀 조정은 X와 Y 스캐너에 오프셋을 적용하여 수행 할 수 있습니다. 참고 : AFM 캔틸레버가 대상 셀을 선택 샘플 스테이지를 이동하는 동안 시료 표면에서 인출 할 수있다. 시료 표면이 평평하지 않을 수 있기 때문에 이것은 샘플로 노크에서 캔틸레버를 보호합니다. </li><li> 분광학 모드를 강제로 전환합니다. 들여 쓰기를 설정유체 효과를 방지하기 위해 충분히 낮은 1-10 μm의 / 초 범위 내 속도. </li><li> 세포에 손상을 방지하기 위해 최대의 들여 쓰기 힘을 제한하는 편향 트리거 포인트를 설정합니다. 편향 신호의 모든 드리프트를 교정 할 상대 트리거링 옵션을 선택합니다. 2 윈은의 최대 힘은 대부분의 샘플에 대한 좋은 출발점입니다. 이 값은, 그러나, 샘플 강성에 따라 조정되어야한다. 부드러운 샘플 낮은 값은 샘플 과도한 들여 쓰기를 방지하기 위해 사용되어야한다. 뻣뻣한 샘플은 높은 값이 측정 들여 쓰기를 생성하는 데 사용되어야한다. </li><li> 끝이 완전히 힘의 측정과 세포에서 분리 될 수 있도록 충분히 큰 힘 거리를 설정합니다. 보통, 힘 거리가 5 μm의에서 설정됩니다. </li><li> 하나의 힘 곡선을 취할 수있는 AFM을 명령. </li><li> 각 셀의 요정 핵 영역의 다른 위치에서 적어도 세 힘 커브를 수집합니다. 그것은 여러를 취할 유용하지만너무 많은 힘 곡선을 가지고 신뢰할 수있는 통계 자료에 대한 각 셀 곡선, AFM 프로브에서 때문에 스트레스 세포 강성의 변화로 이어질 수 있습니다. </li><li> 데이터 수집이 완료되면, 팁을 철회하고, 특정 샘플 조건에서 세포의 강성 좋은 통계 데이터를 필요에 따라 반복은 많은 셀 3.1-3.6 단계를 반복합니다. 보통 30 세포는 각 조건에 대해 측정됩니다. </li></ol> 단일 셀 내에서 강성 분포의 특성을 강제 맵 모드가 적용됩니다. 강제 맵 모드에서, 관심의 영역을 포함하는 스캔 크기를 설정, 적절한 해상도를 설정하고, 하나의 힘 곡선 선택한 것과 같은 들여 쓰기 매개 변수를 설정, AFM는 정의 된 샘플 영역에 걸쳐 래스터하고 하나의 힘 곡선을 샘플 영역의 각 픽셀에서. 4. 데이터 분석 기록 된 힘 곡선은 세포의 강성을 계산하는 사용자 정의 MATLAB 프로 시저를 사용하여 분석. 다음은 MATLAB 절차에 대한 간략한 설명입니다 : <ol><li> . MATLAB 프로그램은 접점이 린 등에 의해 게시 방법에서 채택 된 알고리즘 29을 사용하여 (그림 1 참조) Z0와 D0 좌표를 식별합니다 : </li><li> 최대 세트, 힘 곡선의 각 데이터 포인트에 대해, 관심 지점의 왼쪽에있는 데이터의 선형 피팅을 수행하고, 헤르츠 모델은 오른쪽 (접점의 초기 지점으로 선택한 점 사용)에 적합 최대 들여 쓰기 (200-300 nm의 권장). </li><li> 각 포인트에 모두 적합의 상대 RMS 오차를 계산하고이 값을 합계입니다. </li><li> 최소 총 피팅 오류를 달성 점 접촉의 초기 점으로 선택됩니다. 참고 : 계산 시간이 아니라 선형 전체 힘 곡선을 스캔보다 황금 섹션 검색을 구현하여 줄일 수 있습니다. </li><li> 샘플 변형 δ와 힘 F를 들여 다음과 같이 계산된다 : <img alt="식 1"FO : 콘텐츠 너비 = &quot;3.073in&quot;FO : SRC = &quot;/이 files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot;/&gt; </li><li> 최소 제곱 피팅 대 F에 맞게 적용 포스트 접촉 영역에서 δ 데이터, Z ≥ Z 0,의 탄성 계수, 세포의 E를 추출하는 헤르츠 모델 : <img alt="식 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> 여기서 V는 푸 아송의 비율입니다. 참고 : δ는 샘플의 두께 (셀 높이)의 10 % 이상이면, 측정 셀 강성 기판 강성에 의해 영향을받습니다. 요정 핵 영역의 두께는 일반적으로 몇 마이크로 미터의 순서입니다. 따라서, F-δ 곡선의 첫 번째 200 ~ 300 nm의은 헤르츠 모델에 적합하다. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

AFM 들여 쓰기 방법은 살아있는 세포의 기계적 성질을 특성화하는 장점이 있습니다. piconewton 레벨 32 힘을 측정 할 수있는 자기 왜곡 세포 계측법 및 광학 핀셋보다 덜 민감이기는하지만, AFM은 힘의 범위를 비교 피코 뉴턴의 수십에서 나노 뉴턴의 수백에 이르는 샘플에서 저항 힘을 감지 할 수 마이크로 피펫 19을 사용하여 셀에 적용 할 수 있습니다. 힘의이 범위는 셀 19의 모든 종류의 측정 변형을 만들 요구에 맞는. 높은 공간 해상도는 가능한 서브 미크론 수준에서 33 조직 및 단일 세포 내에서 이질성을 특성화 할 수 있습니다. 또한 실시간 라이브 셀 측정을 할 수 있습니다. 생물 학적 샘플 용으로 설계된 여러 AFM 모델은 유체 환경에서 작동 할 수 있으며 정확한 온도 제어를 제공 가열 샘플 단계가 장착되어, 가능한 생리적 인 ENVI를 유지하고측정 기간 동안 살아있는 세포에 대한 ronment. AFM 들여 쓰기가 성공적으로 세포 ...

각각의 세포와 그 주변의 세포 외 기질의 기계적 특성, 특히 강성 (ECM)은 세포 성장, 운동, 분열, 분화 및 조직 항상성 등 많은 생물 학적 과정에 중요한 1. 그것은 세포 기계적 강성은 주로에 의해 결정되는 증명되었다 악틴 및 중간 필라멘트의 체외 네트워크에서의 기계적 시험의 골격, 악틴 및 중간 필라멘트 및 그와 관련된 다른 단백질 특히 네트워크 2. 결과는 세포 역학의 골격 구조와 미리 스트레스에 크게 의존하는 것이 좋습니다 세포 골격. 살아있는 세포의 3-5 강성은 다음 골격 구조 6, 미오신 활동 7 및 다른 많은 세포 과정을 평가하는 지표로 간주됩니다. 더 중요한 것은, 세포 기계적 성질의 변화는 종종 밀접하게 연관된다는 것을 발견하는종양의 형성과 전이 등 다양한 질병 상태와 ated 8-10 모니터링 살아있는 세포의 기계적 강성 따라서 세포 생리학을 모니터링하는 새로운 방법을 제공 할 수 있습니다. 감지 및 질병에게 8을 진단;. 및 약물 치료의 효과를 평가하기 11 12 입자 추적 미세 유변학, 13-16 자기 왜곡 세포 계측법, 17 micropipette의 열망 18,19 및 microindentation 20-22 등 다양한 방법이 세포의 탄력성을 측정하기 위해 개발되었습니다. 입자 추적 미세 유변학은 세포의 cytoskeleton 세포 내부 또는 기준점 표지에 주입 미크론 형광 입자 하나의 열 진동을 추적합니다. 세포의 23 탄성과 점성 특성이 변동 방산 정리를 사용하여 측정 된 입자의 변위에서 계산됩니다. 14,23이 방법은 수 지역의 동시 측정셀에 다른 장소에서 높은 공간 해상도를 가진 기계적 성질. 그러나 세포에 형광 입자를 주입하면 세포 기능의 변화, 세포 골격 구조, 따라서 세포 역학으로 이어질 수 있습니다. micropipette의 열망 방법은 피펫으로 세포막의 작은 조각을 빨아 1 ~ 5 μm의에 이르기까지 직경 마이크로 피펫에 부정적인 압력을 적용합니다. 세포의 강성이 적용 부정적인 압력과 세포막의 변형. 18이 방법은 계산한다, 그러나, 세포를 통해 강성의 불균일 분포를 감지 할 수 없습니다. 자기 왜곡 세포 계측법 (MTC)는 세포막에 부착 된 초 상자성 구슬 토크를 생성하는 자기장을 적용합니다. 17 셀 강성이 적용되는 토크와 세포막의 왜곡 변형 사이의 관계에서이 방법으로 파생됩니다. 그것은 MTC 방법에 자석 구슬의 위치를​​ 제어하기 어렵고, 또한 challengi입니다높은 해상도 왜곡 변형의 특성을 NG. Microindentation은 세포에 구멍을 뚫을 수있는 잘 정의 된 지오메트리 압자를 적용합니다. 들여 쓰기 힘과 세포의 결과 들여 쓰기는 종종 헤르츠 모델의 예측을 수행합니다. 세포의 영의 계수는 헤르츠 모델로 피팅에 의해 강제 압입 곡선으로부터 계산 될 수있다. 이 방법은 널리 접점 결정, 헤르츠 모델의 적용, 물리적으로 세포를 손상하는 가능성의 불확실성 등의 한계에도 불구하고 조직과 세포의 기계적 특성을 시험하기 위하여 적용되었습니다. microindentaion 20 많은 장치 사이에서 원자 힘 현미경 (AFM)은 시판되고 널리 살아있는 세포와 조직 21,24-27의 기계적 성질을 특성화하기 위해 적용되었습니다. 이 논문은 세포 역학의 특성을 정신 병원 MFP3D 바이오 AFM을 사용하는 절차를 보여줍니다. AFM하지에LY 세포의 고해상도 지형을 제공하지만 또한 널리 조직 세포의 기계적 특성을 특성화하기 위해 적용되었습니다. AFM 들여 쓰기의 원리는 그림 1에 나와 있습니다. AFM 캔틸레버는 위의 몇 마이크로 미터에서 셀을 접근, 세포와의 접촉을 만든다; 들여 쓰기 셀 캔틸레버 편향이 미리 선택된 세트 포인트에 도달 할 수 있도록하고, 멀리 셀에서 가져옵니다. 그림 1과 같이이 과정에서 캔틸레버의 처짐은 그 위치의 함수로 기록됩니다. 세포와 접촉하기 전에, 캔틸레버는 명백한 편향하지 않고 중간에 이동합니다. 셀 캔틸레버 굴절과 편향 신호 증가에 들여 쓰기를합니다. 캔틸레버들은 편향은 셀에 적용된 힘에 비례하도록 탄성 빔으로 모델링된다. 최대 캔틸레버 편향을 설정하여 샘플에 적용되는 힘의 최대 크기는 D를 방지하기 위해 제한됩니다세포 amage. 셀에 팁 들여 쓰기는 세포의 강성을 추출 헤르츠 모델에 적합하다 그림 1에서 C를 가리 B 지점에서 힘 곡선의 부분입니다. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> 그림 1. AFM의 microindentation와 힘 곡선의 해석의 그림입니다. 상단 패널은 피에조 스캐너에 의한 AFM 캔틸레버의 움직임을 보여줍니다. 캔틸레버 Z와 캔틸레버 편향 신호 D의 수직 위치는 과정에서 기록됩니다. 캔틸레버 포인트, 셀 위의 몇 마이크로 미터부터 시작합니다. 셀을 접근하면서 끝이 세포와 접촉에 와서 B 지점에 도달 할 때까지, 샘플 들여 쓰기 δ 제로 남아있다. 플롯의 점 B의 좌표는 중요한 값이다데이터 분석, (Z 0, D 0&gt;)로 표시. B에서 C로, 셀에 캔틸레버 들여 쓰기 캔틸레버 편향 대상으로 최대의 들여 쓰기 힘과 상수 캔틸레버 봄의 비율로 설정되어 세트 포인트에 도달 할 때까지. 편향 신호가 설정 한 최대 값에 도달하면, 캔틸레버 다음 셀은 종종 팁 - 샘플 부착으로 인해 아래를 뽑아 점 D에 철회 세포를 반환에서 전자의 초기 위치로 분리되어 있습니다. 오른쪽 패널은 들여 쓰기 및 기록 Z와 D 신호 사이의 관계를 보여줍니다. 왼쪽 하단 패널에있는 스프링 상수가 M / 0.07N로 측정하는 대표 힘 곡선, 외팔보의 최대 들여 쓰기의 음모로는 최대의 들여 쓰기 힘에 적용될 수 있도록 17 나노로 설정되어 있습니다 예제 1.2 윈은입니다. 들여 쓰기를하는 동안 키 위치가 표시됩니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

세포와 세포 외 기질 (ECM)의 기계적인 특성은 줄기 세포 분화, 종양 형성, 상처 치유 등 많은 생물 학적 과정에 중요한 역할을한다. 세포와 ECM의 강성의 변화는 종종 세포 생리학 또는 조직의 질병의 변화의 징후입니다. 따라서, 세포 강성 세포 배양의 상태를 평가하는 인덱스입니다. 세포와 조직의 강성을 측정하는 적용 방법의 무리 사이, 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 마이크로 들여 쓰기 안정적으로 살아있는 세포의 강성을 측정하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 널리 금속 표면에서 부드러운 생물학적 조직과 세포에 이르기까지 다양한 재료에 대한 마이크로 스케일 강성의 특성을 적용하고있다. 이 방법의 기본 원리는 선택한 형상 AFM 팁과 셀을 들여 쓰기 AFM 캔틸레버의 휨에서 적용되는 힘을 측정하는 것입니다. 헤르츠 모드로 강제 압입 곡선을 피팅해당 팁 지오메트리 난 재료 강성의 정량적 측정을 제공 할 수 있습니다. 이 논문은 AFM을 이용하여 살아있는 세포의 강성을 특성화하는 과정을 보여줍니다. MATLAB 루틴을 사용하여 AFM 교정 과정, 강제 곡선 수집, 데이터 분석 등 주요 단계를 설명합니다. 이 방법의 제한 사항에 대해서도 설명합니다.

그림 2a는 각각 플라스틱 표면, 영의 계수 3000 아빠와 17,000 아빠의 폴리 아크릴 아마이드 젤에 배양 3T3 섬유 아세포에서 가져온 세 가지 대표적인 힘 곡선을 보여줍니다. 조심스럽게 곡선의 접점을 식별 한 후, 세포 변형 함수로 들여 힘은 그림 2B에 나타내었다. 0.3 윈은, 3 kPa의 폴리 아크릴 아마이드 젤에 배양 세포에 피라미드 모양의 팁 들여 3 마이크로 미터보다 작은 크기의 힘 아래. 반면, 강제보다 1.6 윈은이 같은 팁을 사용하여 일반 배양 접시에서 자란 세포로 500 나노 미터 들여 쓰기해야합니다. 부드러운 폴리 아크릴 아마이드 젤에 배양 세포가 딱딱 배양 접시에 배양 한 세포보다 부드러운 것을이 그래프에서 분명하다. 헤르츠 모델 포스 δ 곡선의 첫 번째 세그먼트 (δ &lt;30 nm의) 피팅은 각각 10 kPa의 1.2 kPa의, 1.10 kPa의 이러한 세 가지 세포의 탄성 계수를 제공합니다. cultur의 셀전자 요리는 폴리 아크...

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 원자간력 현미경(atomic force microscope)을 사용하여 살아있는 세포의 탄성 계수를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포의 다양한 위치에서 FM 힘 분광법(FM force spectroscopy) 측정을 수행합니다. 두 번째 단계로, 모든 힘-거리 곡선을 분석하여 AFM 팁이 세포와 처음으로 접촉하는 지점을 결정합니다.다음으로, 접촉 지점부터 시작하여 처음 200에서 300 nm의 압입 데이터를 hertz 모델에 피팅합니다. 탄성 계수를 추출하기 위해, 각 픽셀이 단일 힘-거리 곡선을 나타내는 힘 매핑 모드를 사용하여 얻은 세포 강성의 2D 맵을 생성합니다. 이 절차는 본 연구실의 대학원생인 Guen Thomas가 시연하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 캔틸레버 홀더를 70% ethanol로 세척하고 건조시킵니다.그 다음, 제조사의 지침에 따라 A FM에 bru DNP 10 캔틸레버를 장착합니다. 이어서 역광학 레버 민감도를 보정합니다. 이 파라미터는 캔틸레버 굴곡 1 nm당 전압으로 나타나는 포토다이오드의 응답량을 나타냅니다.이를 수행하기 위해 먼저 깨끗한 유리 슬라이드를 시료 스테이지 위에 올립니다. AFM 헤드를 장착하고 제조사의 지침에 따라 레이저 빔과 정렬을 조정합니다. 정렬이 완료되면, P 8 O를 후퇴시킨 상태에서 AFM 팁을 유리 슬라이드에 접촉시킵니다.거울을 재정렬하여 포토다이오드 판독값이 -2 V가 되도록 합니다. 그런 다음 포토다이오드 최대 응답 또는 트리거 지점을 +2 V로 설정하여 힘 분광법 측정을 수행합니다. 데이터 획득이 완료되면, 힘 곡선의 견고한 접촉(firm contact) 영역을 확대하고 이 영역에 대해 선형 피팅을 수행합니다.nm당 V 단위의 기울기를 구한 후, 거울 정렬을 조정하여 자유 편향(free deflection)이 0 V가 되도록 리셋합니다. 다음으로, Levy와 Malam이 설명한 열 튜닝(thermal tune) 방법을 사용하여 캔틸레버의 용수철 상수를 교정합니다. 먼저, 팁과 샘플 사이에 상호작용이 일어나지 않도록 스캐너를 샘플 스테이지에서 멀리 올립니다.그런 다음 캔틸레버 빔의 열 진동을 기록하여 열 데이터를 캡처합니다. AFM 소프트웨어가 이러한 열 진동의 파워 스펙트럼을 분석하여 데이터 창에 표시합니다. 그다음, 기본 공진 피크(fundamental resonance peak)라고도 하는 가장 낮은 주파수를 중심으로 하는 데이터 세그먼트에 피팅을 수행하여 용수철 상수를 결정합니다.배양 플레이트용 a FM을 준비하기 위해, a FM 스테이지에 디쉬 히터 액세서리를 설치하고 온도를 37 °C로 설정하십시오. 시스템이 안정적인 열평형 상태에 도달할 때까지 20분 동안 기다립니다. 예열이 완료되면 배양 디쉬를 a FM 스테이지 위에 놓고, 30분 이상의 측정 시에는 디쉬 히터와 함께 제공된 클램프를 사용하여 고정하십시오. 일반 배양 배지 대신 이산화탄소 독립 배지를 사용해야 합니다.다음으로, 37 °C 배양액을 한 작은 방울만큼 AFM 캔틸레버 팁에 도포하고, 팁이 액체에 막 잠길 때까지 AFM 헤드를 내립니다. 상단 뷰 CCD 카메라를 사용하여 캔틸레버의 레이저 빔을 다시 정렬합니다. 매질의 굴절률 변화로 인해 액체 내에서의 정렬은 공기 중에서의 정렬과 다를 것입니다.정렬이 완료되면, 배양 접시의 세포가 없는 영역에 AFM 팁을 접촉시키고 액체 환경에서 역광학 레버 감도(inverse optical lever sensitivity) 보정을 수행합니다. 세포의 기계적 특성 측정을 시작하려면, 광학 현미경의 도움을 받아 캔틸레버 팁을 세포의 진주낭(perle eye) 부위 위에 위치시킵니다. 캔틸레버 위치의 정밀한 조정은 X 및 Y 스캐너에 오프셋을 적용하여 수행합니다.그런 다음 FM을 네 가지 분광 모드로 전환하고, 유체역학적 효과를 방지하기에 충분히 낮은 속도인 5 µm/s로 압입 속도를 설정합니다. 다음으로, 굴곡 트리거 지점을 2 nN으로 설정합니다. 세포 손상을 방지하기 위해 시료의 강도에 따라 이 값을 조정하십시오.또한, 편향 신호의 드리프트를 보정할 수 있도록 상대적 트리거링(relative triggering) 옵션을 선택하십시오. 그다음, 힘 측정 사이에 팁이 세포에서 완전히 분리되도록 힘 거리(force distance)를 5 µm로 설정하십시오. 각 조건에 대해 최소 30개 세포의 핵 영역 내 서로 다른 위치에서 3개의 힘 곡선을 수집하십시오.각 세포에서 여러 개의 곡선을 측정하는 것이 유익하지만, 신뢰할 수 있는 통계 데이터를 위해 너무 많은 측정을 수행하면 AFM 프로브로 인한 스트레스로 인해 세포 강도가 변할 수 있습니다. 포스 맵(force map) 모드를 사용하여 단일 세포 전체의 기계적 특성 분포를 추가로 분석하십시오.포스 맵(force map) 모드에서 스캔 크기를 30 µm로, 해상도를 32 x 32로 설정하고, 들입(indentation) 파라미터는 단일 포스 커브(single force curves)에 설정한 것과 동일하게 지정합니다. 그러면 AFM은 시료 영역의 각 픽셀에서 단일 포스 커브를 측정하여 전체 영역의 강성 맵(stiffness map)을 제공합니다. 그다음, 기록된 포스 커브를 MATLAB으로 분석하여 세포 강성을 계산합니다.Matlab을 사용하여 각 지점에서 선형 적합(linear fit)과 헤르츠 적합(hertz fit)을 모두 계산하는 Lynette Al이 처음 발표한 알고리즘을 적용하여 시작합니다. 두 적합 방식의 상대 RMS 오차를 계산하고, 각 지점에서 이 값들을 합산합니다. 총 적합 오차가 최소가 되는 지점을 초기 접촉점으로 선택하며, 이 지점을 찾는 것은 세포의 영률(young's modulus)을 정확하게 측정하는 데 매우 중요합니다.다음으로, 시료 변형 델타를 계산합니다. 세포 접촉 전(Z가 Z₀보다 작을 때)에는 변형이 0이며, 접촉 지점 이후에는 캔틸레버 굴곡 D와 총 거리 Z의 차이와 같다는 다음 식을 사용합니다. 그런 다음, 세포 접촉 전(Z가 Z₀보다 작을 때)에는 힘이 0이며, 접촉 지점 이후에는 캔틸레버의 용수철 상수 K에 접촉 지점 이후의 캔틸레버 굴곡을 곱한 값과 같다는 다음 식을 사용하여 압입력 F를 계산합니다.그 다음, 사용된 팁의 형상을 기반으로 세포의 영률(Young's modulus)을 추출하기 위해, Hertz 모델의 post contact 영역에 있는 샘플의 변형량 대 압입력 데이터에 Elise square 피팅을 적용합니다. 여기 세 가지 서로 다른 표면에서 배양된 세 개의 T3 섬유아세포에서 얻은 대표적인 힘-변위 곡선들이 있습니다. 여기서 볼 수 있듯이, 표면의 종류에 따라 세포 세포골격의 강성이 크게 영향을 받을 수 있습니다.단단한 플라스틱 표면에서 배양된 세포의 평균 변형은 빨간색으로 표시되어 있습니다. 단단한 폴리아크릴아마이드 겔에서 성장한 세포는 보라색으로, 탄성 폴리아크릴아마이드 겔에서 성장한 세포는 파란색으로 표시되어 있습니다. 곡선에서 접촉점을 주의 깊게 식별하면, 세포 변형의 함수로서 압입력을 정확하게 나타낼 수 있습니다.또한, 접촉 후 초기 300 nanometers의 압입 깊이로부터 영률(Young's modulus)을 정확하게 계산할 수 있습니다. 여기 보이는 것은 중간 필라멘트의 일종인 menton에 녹색 형광 단백질 태그를 붙여 형질전환시킨 섬유아세포입니다. 이미지가 밝을수록 해당 영역에 menton이 더 많이 분포하고 있음을 나타냅니다.이는 세포 세포골격의 강성과 관련이 있을 수 있습니다. 본 과정에서 제시하는 AFM 힘 매핑(force mapping) 기술을 사용하여, 각 픽셀이 2.5 by 2.5 microns의 세포 표면적을 나타내는 32 by 32 픽셀 해상도로 섬유아세포의 유사한 강성 지도를 보여줄 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 살아있는 조직 세포의 탄성도를 측정하기 위해 원자간력 현미경을 사용하는 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

여기, 우리 podosomes 지형 이미지의 자동 분석 영화의 준비에서 규격 필름에 적용 되는 돌출 세력을 평가 하는 데 사용 하는 실험 기법을 상세하게.

돌출 힘 현미경 검사 법: 셀 돌출에 의해 개발 된 세력을 계량 하는 방법

이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

우리는 면역학적 연구를 위한 단 하나 T 세포 및 비드 입자를 가진 원자력 현미경 (AFM) 캔틸레버를 기능화하는 프로토콜을 제시합니다. AFM에 의해 단일 쌍 T 세포 수지상 세포 결합을 조사하고 형광 이미징을 통해 AFM에 의해 단일 고체 입자에 대한 대식세포의 실시간 세포 반응을 모니터링하는 절차가 도시된다.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

여기에서, 우리는 세포와 조직에 나노 및 마이크로 들여 쓰기 공구로 작동하는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 제시합니다. 이 계측기는 시료의 3D 표면 지형과 세포벽 Young의 계수및 터거 압력을 포함한 기계적 특성을 동시에 수집할 수 있습니다.

식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용

이 프로토콜은 수백 개의 미생물 세포에 대한 AFM 측정을 자동화하는 것을 목표로합니다. 첫째, 미생물은 PDMS 스탬프 미세 구조로 고정된 다음 수백 개의 고정된 세포에서 분광법 측정이 자동으로 수행됩니다.

수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

여기에 제시된 Conpokal 기술의 프로토콜은 공초점 및 원자력 현미경 검사를 단일 계측기 플랫폼으로 결합합니다. Conpokal은 살아있는 생물학 견본의 동시 공초점 화상 진찰 및 기계적인 특성에 가까운 동일 세포, 동일 지구를 제공합니다.

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

세포벽 생체 역학에 대한 연구는 식물 성장과 형태 형성을 이해하는 데 필수적입니다. 다음 프로토콜은 원자력 현미경을 사용하여 젊은 식물 기관의 내부 조직에서 얇은 1 차 세포벽을 조사하기 위해 제안됩니다.

원자력 현미경을 사용한 살아있는 식물 장기의 일차 세포벽의 기계적 특성 특성 분석

원자력 현미경(AFM) 프로브 팁이 샘플 표면에 가하는 접촉 면적과 힘을 정량화하면 나노 크기의 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 탄성 계수 또는 기타 나노기계적 특성을 측정하기 위해 연질 및 경질 샘플의 공기 또는 유체에서 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 구현하는 모범 사례에 대해 설명합니다.

원자력 현미경 캔틸레버 기반 나노인덴테이션: 공기 및 유체의 나노 스케일에서 기계적 특성 측정

배우세요 원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 탄성률을 측정하는 방법을. 힘 분광법과 헤르츠 모델 피팅을 통해 세포 기계적 특성을 정량화하고 2D 강성 지도를 생성할 수 있습니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

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