원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

다음 실험의 전반적인 목표는 원자간력 현미경(atomic force microscope)을 사용하여 살아있는 세포의 탄성 계수를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포의 다양한 위치에서 FM 힘 분광법(FM force spectroscopy) 측정을 수행합니다. 두 번째 단계로, 모든 힘-거리 곡선을 분석하여 AFM 팁이 세포와 처음으로 접촉하는 지점을 결정합니다.

다음으로, 접촉 지점부터 시작하여 처음 200에서 300 nm의 압입 데이터를 hertz 모델에 피팅합니다. 탄성 계수를 추출하기 위해, 각 픽셀이 단일 힘-거리 곡선을 나타내는 힘 매핑 모드를 사용하여 얻은 세포 강성의 2D 맵을 생성합니다. 이 절차는 본 연구실의 대학원생인 Guen Thomas가 시연하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 캔틸레버 홀더를 70% ethanol로 세척하고 건조시킵니다.

그 다음, 제조사의 지침에 따라 A FM에 bru DNP 10 캔틸레버를 장착합니다. 이어서 역광학 레버 민감도를 보정합니다. 이 파라미터는 캔틸레버 굴곡 1 nm당 전압으로 나타나는 포토다이오드의 응답량을 나타냅니다.

이를 수행하기 위해 먼저 깨끗한 유리 슬라이드를 시료 스테이지 위에 올립니다. AFM 헤드를 장착하고 제조사의 지침에 따라 레이저 빔과 정렬을 조정합니다. 정렬이 완료되면, P 8 O를 후퇴시킨 상태에서 AFM 팁을 유리 슬라이드에 접촉시킵니다.

거울을 재정렬하여 포토다이오드 판독값이 -2 V가 되도록 합니다. 그런 다음 포토다이오드 최대 응답 또는 트리거 지점을 +2 V로 설정하여 힘 분광법 측정을 수행합니다. 데이터 획득이 완료되면, 힘 곡선의 견고한 접촉(firm contact) 영역을 확대하고 이 영역에 대해 선형 피팅을 수행합니다.

nm당 V 단위의 기울기를 구한 후, 거울 정렬을 조정하여 자유 편향(free deflection)이 0 V가 되도록 리셋합니다. 다음으로, Levy와 Malam이 설명한 열 튜닝(thermal tune) 방법을 사용하여 캔틸레버의 용수철 상수를 교정합니다. 먼저, 팁과 샘플 사이에 상호작용이 일어나지 않도록 스캐너를 샘플 스테이지에서 멀리 올립니다.

그런 다음 캔틸레버 빔의 열 진동을 기록하여 열 데이터를 캡처합니다. AFM 소프트웨어가 이러한 열 진동의 파워 스펙트럼을 분석하여 데이터 창에 표시합니다. 그다음, 기본 공진 피크(fundamental resonance peak)라고도 하는 가장 낮은 주파수를 중심으로 하는 데이터 세그먼트에 피팅을 수행하여 용수철 상수를 결정합니다.

배양 플레이트용 a FM을 준비하기 위해, a FM 스테이지에 디쉬 히터 액세서리를 설치하고 온도를 37 °C로 설정하십시오. 시스템이 안정적인 열평형 상태에 도달할 때까지 20분 동안 기다립니다. 예열이 완료되면 배양 디쉬를 a FM 스테이지 위에 놓고, 30분 이상의 측정 시에는 디쉬 히터와 함께 제공된 클램프를 사용하여 고정하십시오. 일반 배양 배지 대신 이산화탄소 독립 배지를 사용해야 합니다.

다음으로, 37 °C 배양액을 한 작은 방울만큼 AFM 캔틸레버 팁에 도포하고, 팁이 액체에 막 잠길 때까지 AFM 헤드를 내립니다. 상단 뷰 CCD 카메라를 사용하여 캔틸레버의 레이저 빔을 다시 정렬합니다. 매질의 굴절률 변화로 인해 액체 내에서의 정렬은 공기 중에서의 정렬과 다를 것입니다.

정렬이 완료되면, 배양 접시의 세포가 없는 영역에 AFM 팁을 접촉시키고 액체 환경에서 역광학 레버 감도(inverse optical lever sensitivity) 보정을 수행합니다. 세포의 기계적 특성 측정을 시작하려면, 광학 현미경의 도움을 받아 캔틸레버 팁을 세포의 진주낭(perle eye) 부위 위에 위치시킵니다. 캔틸레버 위치의 정밀한 조정은 X 및 Y 스캐너에 오프셋을 적용하여 수행합니다.

그런 다음 FM을 네 가지 분광 모드로 전환하고, 유체역학적 효과를 방지하기에 충분히 낮은 속도인 5 µm/s로 압입 속도를 설정합니다. 다음으로, 굴곡 트리거 지점을 2 nN으로 설정합니다. 세포 손상을 방지하기 위해 시료의 강도에 따라 이 값을 조정하십시오.

또한, 편향 신호의 드리프트를 보정할 수 있도록 상대적 트리거링(relative triggering) 옵션을 선택하십시오. 그다음, 힘 측정 사이에 팁이 세포에서 완전히 분리되도록 힘 거리(force distance)를 5 µm로 설정하십시오. 각 조건에 대해 최소 30개 세포의 핵 영역 내 서로 다른 위치에서 3개의 힘 곡선을 수집하십시오.

각 세포에서 여러 개의 곡선을 측정하는 것이 유익하지만, 신뢰할 수 있는 통계 데이터를 위해 너무 많은 측정을 수행하면 AFM 프로브로 인한 스트레스로 인해 세포 강도가 변할 수 있습니다. 포스 맵(force map) 모드를 사용하여 단일 세포 전체의 기계적 특성 분포를 추가로 분석하십시오.

포스 맵(force map) 모드에서 스캔 크기를 30 µm로, 해상도를 32 x 32로 설정하고, 들입(indentation) 파라미터는 단일 포스 커브(single force curves)에 설정한 것과 동일하게 지정합니다. 그러면 AFM은 시료 영역의 각 픽셀에서 단일 포스 커브를 측정하여 전체 영역의 강성 맵(stiffness map)을 제공합니다. 그다음, 기록된 포스 커브를 MATLAB으로 분석하여 세포 강성을 계산합니다.

Matlab을 사용하여 각 지점에서 선형 적합(linear fit)과 헤르츠 적합(hertz fit)을 모두 계산하는 Lynette Al이 처음 발표한 알고리즘을 적용하여 시작합니다. 두 적합 방식의 상대 RMS 오차를 계산하고, 각 지점에서 이 값들을 합산합니다. 총 적합 오차가 최소가 되는 지점을 초기 접촉점으로 선택하며, 이 지점을 찾는 것은 세포의 영률(young's modulus)을 정확하게 측정하는 데 매우 중요합니다.

다음으로, 시료 변형 델타를 계산합니다. 세포 접촉 전(Z가 Z₀보다 작을 때)에는 변형이 0이며, 접촉 지점 이후에는 캔틸레버 굴곡 D와 총 거리 Z의 차이와 같다는 다음 식을 사용합니다. 그런 다음, 세포 접촉 전(Z가 Z₀보다 작을 때)에는 힘이 0이며, 접촉 지점 이후에는 캔틸레버의 용수철 상수 K에 접촉 지점 이후의 캔틸레버 굴곡을 곱한 값과 같다는 다음 식을 사용하여 압입력 F를 계산합니다.

그 다음, 사용된 팁의 형상을 기반으로 세포의 영률(Young's modulus)을 추출하기 위해, Hertz 모델의 post contact 영역에 있는 샘플의 변형량 대 압입력 데이터에 Elise square 피팅을 적용합니다. 여기 세 가지 서로 다른 표면에서 배양된 세 개의 T3 섬유아세포에서 얻은 대표적인 힘-변위 곡선들이 있습니다. 여기서 볼 수 있듯이, 표면의 종류에 따라 세포 세포골격의 강성이 크게 영향을 받을 수 있습니다.

단단한 플라스틱 표면에서 배양된 세포의 평균 변형은 빨간색으로 표시되어 있습니다. 단단한 폴리아크릴아마이드 겔에서 성장한 세포는 보라색으로, 탄성 폴리아크릴아마이드 겔에서 성장한 세포는 파란색으로 표시되어 있습니다. 곡선에서 접촉점을 주의 깊게 식별하면, 세포 변형의 함수로서 압입력을 정확하게 나타낼 수 있습니다.

또한, 접촉 후 초기 300 nanometers의 압입 깊이로부터 영률(Young's modulus)을 정확하게 계산할 수 있습니다. 여기 보이는 것은 중간 필라멘트의 일종인 menton에 녹색 형광 단백질 태그를 붙여 형질전환시킨 섬유아세포입니다. 이미지가 밝을수록 해당 영역에 menton이 더 많이 분포하고 있음을 나타냅니다.

이는 세포 세포골격의 강성과 관련이 있을 수 있습니다. 본 과정에서 제시하는 AFM 힘 매핑(force mapping) 기술을 사용하여, 각 픽셀이 2.5 by 2.5 microns의 세포 표면적을 나타내는 32 by 32 픽셀 해상도로 섬유아세포의 유사한 강성 지도를 보여줄 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 살아있는 조직 세포의 탄성도를 측정하기 위해 원자간력 현미경을 사용하는 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다.