Name: 류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 학습하세요 방사성 인산을 이용한 LRRK1 및 LRRK2 신진대사 라벨링 방법으로 세포 내 총 인산화 수준을 정량화하는 기술입니다. 이 프로토콜은 특정 인산화 항체가 없는 단백질 연구에도 활용 가능합니다.

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우리는 또한이 연구를 지원하는 마이클 J. 폭스 재단에 감사하고 있습니다. 플랑드르 FWO (FWO 프로젝트 G.0666.09, JMT에 선임 연구원의 교제), IWT SBO/80020 프로젝트 신경 TARGET, KU 루뱅 (OT/08/052A 및 IOF-KP/07 / 001) - 우리는 연구 재단 감사 자신의 지원. 이 연구는 또한 JMT은 킹 보두앵 재단에 의해 관리되는 기금 Druwé-Eerdekens에 의해 부분적으로 지원되었다.

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<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).</li>
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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 논문은 32 P-인산염과 신진 대사 라벨을 사용하여 세포 라인에 LRRK1 및 LRRK2의 일반 인산화 수준을 시금위한 기본 프로토콜을 제공합니다. 전반적인 전략은 간단합니다. 궁합 LRRK 단백질이 32 P-오르토 포스페이트를 함유하는 배지에 노출 HEK293T 세포에서 발현되는 태그. 32 P-인산염이 단 몇 배양 시간과 인산염이 들어있는 셀의 모든 분자 후 세포에 의해 동화함으로써 방사성 표시되어 있습니다. 선호도 태그 (3xflag는) 다음 면역에 의해 다른 세포 구성 요소의 LRRK 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. 면역 침전물이 후, SDS-PAGE를 통해 분리, PVDF 멤브레인 및 통합 된 인산염의 분석에 도말는 말에 단백질의 오토 라디오 그래피 (32 P 신호)와 웨스턴 검출 (단백질 신호)에 의해 수행된다. 이 프로토콜은 LRRK2의 AU를 측정하는 프로토콜과 구별 될그 LRRK1의 라벨 또는 LRRK2의 tophosphoryl...

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2)는 유사한 도메인 조직을 공유하는 멀티 도메인 paralogs 있습니다. 이 두 단백질은 효과적으로 ROCO 단백질 가족 5,6에 두 단백질을 분류, GTPases (복합 단백질의 라스, 또는 ROC)의 라스의 가족뿐만 아니라 ROC 도메인 (COR)의 C-말단에 가까운 GTPase의 시퀀스를 인코딩합니다. 만 LRRK2 여분 딜 domein 6-8을 인코딩하는 동안 ROC-COR 도메인 직렬의 N-말단이 두 단백질은 류신이 풍부한 반복 도메인뿐만 아니라 ankyrin 같은 도메인을 인코딩합니다. 만 LRRK2는 C-말단 부위 8 WD40 도메인을 인코딩하는 동안 ROC-COR의 C-말단, 두 단백질은 세린 트레오닌 키나제 도메인을 공유 할 수 있습니다. LRRK1 및 LRRK2의 정확한 세포의 역할은, 그러나 LRRK1 1,2 신호 티로신 키나제 수용체에 연루되어, 설명 될 아직 동안 파킨슨 병 3,4의 병인에 LRRK2의 역할에 대한 유전 적 증거를 가리 킵니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 단백질의 인산화는 세포의 일반적인 규제 메커니즘입니다. 예를 들어, 인산화 효소의 활성화를 위해 또는 신호의 복잡한 단백질의 모집을 위해 필수적 일 수있다. LRRK2의 세포 인산화 광범위 특징으로되어 phosphosite 매핑은 ankyrin 반복과 류신이 풍부한 반복 도메인 9-11 사이의 클러스터에서 발생하는 세포의 인산화 사이트의 대부분을 보여 주었다. LRRK1 세포 인산화 사이트를 매핑 할 수 아직 가지고 있지만, COS7 세포에서 면역 침전 LRRK1 단백질의 말의 인 단백질 염색법을 사용하여 연구의 증거가 LRRK1 단백질은 셀 (12)의 인산화 것을 제안합니다. 이 논문은 32 P-인산염과 신진 대사 라벨을 사용하여 세포 라인에 LRRK1 및 LRRK2의 일반 인산화 수준을 시금위한 기본 프로토콜을 제공합니다. 전반적인 전략은 간단합니다. 궁합 LRRK의 PROTE 태그인은 32 P-오르토 포스페이트를 함유하는 배지에 노출 HEK293T 세포에서 발현된다. 32 P-인산염이 단 몇 배양 시간과 인산염이 들어있는 셀의 모든 분자 후 세포에 의해 동화함으로써 방사성 표시되어 있습니다. 선호도 태그 (3xflag는) 다음 면역에 의해 다른 세포 구성 요소의 LRRK 단백질을 분리하는 데 사용됩니다. 면역 침전물이 후, SDS-PAGE를 통해 분리, PVDF 멤브레인 및 통합 된 인산염의 분석에 도말는 말에 단백질의 오토 라디오 그래피 (32 P 신호)와 서부 검출 (단백질 신호)에 의해 수행된다.

<table><tbody><tr><td>인-32 방사성 핵종, 1 mCi, 1 ml 물에 디소듐포스페이트 완충액</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), 액체 (고포도당)</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td>이 매체에는 인산염이 포함되어 있지 않습니다.</td></tr><tr><td>Anti Flag M2 친화력 젤</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>빨간색 젤이 있는 동등한 제품(구슬을 더 쉽게 시각화하는 데 유용)에는 cat을 사용하십시오. 번호 F2426.</td></tr><tr><td>매우 두꺼운 블로팅 필터</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S 솔루션</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr></tbody></table>

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

류신 풍부 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2)는, 세린 - 트레오닌 키나아제 복잡한 단백질 도메인의 라스 (ROC), ROC 도메인 (COR)의 C-말단을 포함하여, 유사 도메인 조직을 나누어 paralogs 아르 류신이 풍부한 및 N-말단에 ankyrin 같이 반복. LRRK1 및 LRRK2의 정확한 세포의 역할은 LRRK2는 파킨슨 병 3,4의 병인에 관여하는 동안 그러나 LRRK1가, 1,2 신호 티로신 키나제 수용체에 연루되어, 설명 될 못하고있다. 이 보고서에서, 우리는 따라서 세포에있는이 두 단백질의 전체 인산화 수준을 측정 할 수있는 방법을 제공하고, 32 P 오르토와 셀의 LRRK1 및 LRRK2 단백질 레이블을하는 프로토콜을 제시한다. 요컨데, 궁합 LRRK 단백질이 32 P-오르토 포스페이트를 함유하는 배지에 노출 HEK293T 세포에서 발현되는 태그. 32 P-인산염은 후 세포에 의해 흡수되어 단 몇배양 시간과 인산염이 들어있는 셀의 모든 분자함으로써 방사성 표시되어 있습니다. 선호도 태그를 통해 (3xflag) LRRK 단백질은 면역에 의해 다른 세포 구성 요소에서 격리됩니다. 면역 침전물이 후, SDS-PAGE를 통해 분리, PVDF 멤브레인 및 통합 된 인산염의 분석에 도말는 말에 단백질의 오토 라디오 그래피 (32 P 신호)와 서부 검출 (단백질 신호)에 의해 수행된다. 프로토콜은 쉽게 세포에서 발현 및 면역 침전에 의해 단리 될 수있는 임의의 다른 단백질의 인산화를 모니터링하도록 구성 될 수있다.

<html> 세포에서 LRRK1 및 LRRK2의 전체 인산화 수준을 비교하기 위해, 3xflag는 LRRK1 태그와 LRRK2는 HEK293T 세포 (15)로 표현했다. 세포는 6 - 웰 플레이트에서 배양 32 P로 표지 및 프로토콜 텍스트에서 설명한 바와 같이 분석했다. 그림 1은 HEK293T 세포에서 LRRK1 및 LRRK2의 신진 대사 라벨링에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 방사성 인산 결합이 LRRK1 및 LRRK2 모두 관찰된다. 통계적 의미가 있지만 반대로 플래그 항체와 면역의 농도계 분석에 의해 측정 된 단백질의 수준으로 정상화 32 P 수준의 정량화에, 그것은 LRRK1 테스트 조건에서 LRRK2보다 낮은 평균 인산화 수준을 한 것으로 나타났습니다 (P&gt; 0.05)에 도달하지. 1.JPG &quot;/&gt; 그림 1. LR...

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2는) GTPase의 키나제 도메인을 모두 인코딩 세포에서 인산화되는 멀티 도메인 단백질입니다. 여기, 우리는 따라서 전반적인 휴대 phophorylation 수준을 측정 할 수있는 수단을 제공, 32 P 오르토와 세포 LRRK1 및 LRRK2 레이블을하는 프로토콜을 제시한다.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 단백질, 세포 인산화 수준을 정량화하기 위해 관심 단백질을 방사성 인산염으로 표지하는 것입니다. 이는 인 32가 존재하는 상태에서 세포를 배양하여 세포에서 발현되는 단백질의 인산염 변형을 방사성으로 표지함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 표지된 세포를 용해하고 용해물을 분석 대상 단백질의 면역 정제를 위해 친화성 비드와 함께 배양합니다.다음으로 표지 및 정제된 단백질의 샘플을 sodium do desal sulfate, poly acrylamide gel 전기영동에서 실행하고 poly olaine fluoride membranes로 블롯팅합니다. 방사성 인산염 통합 및 단백질 수치를 검출하기 위해 류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2, 약칭 L rrk 1 및 L rrk 2가 자동 방사선 촬영 및 면역 검출을 기반으로 유사한 수준으로 세포에서 인산화된다는 결과를 얻었습니다. phospho, immuno blotting과 같은 다른 기술과 비교된 대사 표지 기술의 주요 이점은 이 기술을 사용하여 phospho 항체를 사용할 수 없는 단백질을 포함하여 단백질의 총 세포 인산화 수준을 측정할 수 있다는 것입니다.이 기술의 두 번째 주요 장점은 총 세포 인산화 수준에서 서로 다른 단백질 간에 정량적 비교를 수행할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 F gao가 될 것입니다.표준 배양 조건에 따라 8% 태아 송아지, 혈청 및 겐타마이신으로 dcos 변형 독수리, 매체 또는 DMM에서 HEC 2 93 T 세포주 배양을 시작합니다. Expand plate를 발현하고 텍스트 프로토콜에서 논의된 바와 같이 transfection 또는 lentiviral vector mediated transduction을 통해 태그가 지정된 L rrk two 단백질을 표시합니다.세포가 80-100% 합류하면 예열 인산염이 없는 DMM으로 헹굽니다. 층류 하에서, 인으로 표지할 세포의 6웰 플레이트당 2.1ml의 인산염이 없는 DM a m이 있는 팔콘 튜브를 준비합니다. 32 오르토인산염.전리 방사선 실험이 수행될 벤치를 준비합니다. 작업 공간은 흡수성 물질의 보호 라이너가 놓인 유출 매트로 덮여 있습니다. 또한 작업 공간에 방풍 항아리를 제공하고 내부에 인산염이 없는 매체 튜브를 배치했습니다.인 32라고 표시된 오르토인산염 바이알이 들어 있는 납이 늘어선 용기를 냉장고에서 꺼내 방

metabolic-labeling-leucine-rich-repeat-kinases-1-2-with-radioactive

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

류신 리치 반복 키나제 2 큰 multidomain의 키나제이며, 돌연변이가있는 파킨슨병의 가​​장 흔한 유전적 원인이됩니다. 이 단백질 키나제의 활동 분석은이 단백질의 생물학과 장애를 이해하는 중요한 도구로 입증되었습니다. 본...

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13 C - 동위 원소 라벨링은 미생물의 다양한 유형의 셀 중앙 신진 대사를 결정하기위한 유용한 기법입니다. 세포가 특정 레이블 기판과 교양되었습니다 후, GC - MS 측정은 proteinogenic 아미노산의 고유 라벨 패턴을 기반으로 기능성 대사 경로를 확인할 수 있습니다.

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여기에서는 Tau 단백질을 사례 연구로 사용하여 핵 자기 공명 분광법(NMR)으로 본질적으로 무질서한 단백질의 다중 인산화를 식별하는 방법을 설명합니다. 재조합 Tau는 데이터 수집 및 분석 전에 kinase에 의해 동위원소로 농축되고 in vitro에 변형됩니다.

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단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

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우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

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이 프로토콜은 작은 DNA와 RNA 기판에 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNKs)의 키나아제 활성을 측정하는 비 방사성 분석기를 설명합니다.

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이 동영상은 형광 염료와 인간 배아 줄기 세포 및 mesenchymal 줄기 세포의 라벨에 대한 기술을 보여줍니다. 이 기술은 광학 이미징과 이식 줄기 세포의 생체내 추적에와 형광 현미경과 histopathological 상관 관계에 대해 사용할 수 있습니다.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

학습하세요 방사성 인산을 이용한 LRRK1 및 LRRK2 신진대사 라벨링 방법으로 세포 내 총 인산화 수준을 정량화하는 기술입니다. 이 프로토콜은 특정 인산화 항체가 없는 단백질 연구에도 활용 가능합니다.

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

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