류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

다음 실험의 전반적인 목표는 단백질, 세포 인산화 수준을 정량화하기 위해 관심 단백질을 방사성 인산염으로 표지하는 것입니다. 이는 인 32가 존재하는 상태에서 세포를 배양하여 세포에서 발현되는 단백질의 인산염 변형을 방사성으로 표지함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 표지된 세포를 용해하고 용해물을 분석 대상 단백질의 면역 정제를 위해 친화성 비드와 함께 배양합니다.

다음으로 표지 및 정제된 단백질의 샘플을 sodium do desal sulfate, poly acrylamide gel 전기영동에서 실행하고 poly olaine fluoride membranes로 블롯팅합니다. 방사성 인산염 통합 및 단백질 수치를 검출하기 위해 류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2, 약칭 L rrk 1 및 L rrk 2가 자동 방사선 촬영 및 면역 검출을 기반으로 유사한 수준으로 세포에서 인산화된다는 결과를 얻었습니다. phospho, immuno blotting과 같은 다른 기술과 비교된 대사 표지 기술의 주요 이점은 이 기술을 사용하여 phospho 항체를 사용할 수 없는 단백질을 포함하여 단백질의 총 세포 인산화 수준을 측정할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 두 번째 주요 장점은 총 세포 인산화 수준에서 서로 다른 단백질 간에 정량적 비교를 수행할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 F gao가 될 것입니다.표준 배양 조건에 따라 8% 태아 송아지, 혈청 및 겐타마이신으로 dcos 변형 독수리, 매체 또는 DMM에서 HEC 2 93 T 세포주 배양을 시작합니다. Expand plate를 발현하고 텍스트 프로토콜에서 논의된 바와 같이 transfection 또는 lentiviral vector mediated transduction을 통해 태그가 지정된 L rrk two 단백질을 표시합니다.

세포가 80-100% 합류하면 예열 인산염이 없는 DMM으로 헹굽니다. 층류 하에서, 인으로 표지할 세포의 6웰 플레이트당 2.1ml의 인산염이 없는 DM a m이 있는 팔콘 튜브를 준비합니다. 32 오르토인산염.

전리 방사선 실험이 수행될 벤치를 준비합니다. 작업 공간은 흡수성 물질의 보호 라이너가 놓인 유출 매트로 덮여 있습니다. 또한 작업 공간에 방풍 항아리를 제공하고 내부에 인산염이 없는 매체 튜브를 배치했습니다.

인 32라고 표시된 오르토인산염 바이알이 들어 있는 납이 늘어선 용기를 냉장고에서 꺼내 방사능 벤치로 가져옵니다. 가이거 계수기를 사용하여 용기의 외부 방사능 오염을 모니터링하고 인 32로 표시된 오르토인산염을 무인산염 DMEM 튜브에 희석합니다. 밀리리터당 24 마이크로 큐리의 농도를 추가합니다.

튜브를 방풍 항아리에 보관하십시오. 냉장고에 다시 넣기 전에 인 32라고 표시된 나머지 인산염이 들어 있는 용기를 닫으십시오. 다음으로, 인큐베이터에서 라벨링할 세포가 있는 6개의 웰 플레이트를 제거하고 방사능 벤치에 놓습니다.

매체 상등액을 제거하고 버립니다. 그런 다음 인을 함유 한 인산염이없는 배지 2 밀리리터를 첨가하십시오. 웰 당 32 개의 표지 된 오르토 인산염.

배양 플레이트를 퍼스펙스 박스에 넣은 다음 가이거 계수기를 사용하여 용기의 외부 방사능 오염을 모니터링합니다. 그런 다음 세포가 있는 방풍 상자를 동위원소 대사 표지 전용 진핵 세포 배양기로 옮기고 1시간에서 20시간 동안 세포를 배양합니다. 프로토콜의 이 시점에서, 세포 처리 및 배양 후 세포 처리 및 배양 후 세포에서 배지를 제거하고 방풍 용기에 넣은 폐기물 수집 튜브에 폐기하는 텍스트 프로토콜의 지시에 따라 원하는 경우 세포를 화합물로 처리할 수 있습니다.

2ml의 얼음 콜드 트리스 완충 식염수로 세포를 두 번 헹굽니다. 헹굼 용액을 쓰레기 수거 튜브에 버리십시오. 그런 다음 각 웰에 0.5ml의 얼음 저온 면역침전 용해 완충액을 추가하고 위아래로 피펫팅하여 용해물을 수집합니다.

용해된 모든 세포를 느슨하게 하려면 용해물을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 면역 정제를 통해 관심 단백질을 분리하기 위해 텍스트 프로토콜의 지시에 따라 원심분리 최소 10분 전에 얼음에서 배양합니다. 먼저, 원심분리기 용해물이 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 다시 얼음으로 옮깁니다. 그런 다음 상등액을 10 마이크로 리터 베드가 들어있는 마이크로 원심 분리 튜브에 피펫으로 넣으십시오 : 플래그 M의 부피, 두 가지 aro 속도.

텍스트 프로토콜에서 논의된 대로 평형을 이루고 마이크로 원심분리기 튜브를 50ml 튜브로 옮깁니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 얼음 위에 표시된 50ml 튜브로 옮긴 후, 배양 후 1-20시간 동안 섭씨 4도에서 종단 간 혼합을 위해 냉장실의 지정된 영역에 있는 방풍 차폐 뒤의 회전 장치에 샘플을 놓고 상층액을 폐기물 수집 튜브에 버린 후 마이크로 원심분리 튜브에 있는 단백질 결합 플래그 M 두 개의 aro 비드를 스핀다운합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 비드 세척을 진행합니다.

그런 다음 세척된 비드를 40마이크로리터의 IP 샘플 SDS 로딩 버퍼에 재현탁시키고, 로딩 버퍼에서 샘플을 섭씨 95도까지 2분 동안 가열한 후 1000배 g 이상에서 1분 동안 원심분리하여 비드를 펠렛화하고, perspec 스크린 뒤의 방사능 벤치에서 단백질 겔 전기영동 모듈을 준비합니다. 전기영동을 수행하기 전에 고분자량 단백질의 크기를 식별하는 데 적합한 분자량 마커를 포함한 3-8%T tris acetate SDS 페이지 겔에 샘플을 로드합니다. 전기영동 후, 플라스틱 케이스에서 겔을 제거하고 웨스턴 블로팅 전달 버퍼가 있는 용기로 옮깁니다.

겔 및 PVDF 멤브레인의 준비 후. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반건조 블로팅 모듈의 표면에 블로팅 샌드위치를 준비합니다. 전달 후 1-2시간 동안 15볼트에서 단백질을 전달합니다.

블로팅 모듈에서 블로트된 단백질이 있는 PVDF 멤브레인을 제거하고 멤브레인을 건조시켜 자동 방사선 촬영을 수행합니다. 먼저, 멤브레인을 1-5일 동안 형광판에 노출시킵니다. 인광 스캐너를 사용하여 노출된 인광판에서 phosphorus 32를 판독하고 이미지를 고해상도 tiff로 저장하여 면역 검출을 통해 단백질 수준을 검출합니다.

멤브레인을 메탄올에 잠시 담근 다음 PBS가 있는 얕은 블롯 배양 용기로 옮겨 멤브레인을 재수화합니다. 우유 5%를 함유한 PBST의 멤브레인을 막습니다. anti LR K two 항체 또는 Anti-Flag 항체로 블롯을 배양하고 적절한 세척 단계와 2차 항체 배양으로 추가로 처리합니다.

항체 신청 다음, LRRK 2의 관계되는 단백질 수준을 확인하기 위하여 chemiluminescence 탐지를 실행하십시오. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 지름 분석을 사용하여 LRK 2에서 인 32의 법인을 정량화하는 것은 HEC 2 93 T 세포에서 L Rrk 1 및 L Rrk 2의 대사 표지에 대한 대표적인 결과입니다. 여기에 묘사된 것은 인 32 통합의 대표적인 자동 방사선 사진뿐만 아니라 트리플 플래그 태그를 통한 L Rrk 1 및 L Rrk 2 검출의 대표적인 서쪽 얼룩입니다.

방사성 인산염 혼입은 L rrk 1 및 L rrk 2 모두에서 관찰됩니다. 인의 정량화 시 Anti-Flag 항체를 사용한 면역 검출의 밀도 메트릭 분석으로 측정된 단백질 수준으로 정규화된 32 수준. 통계적 유의성에 도달하지는 못했지만, 테스트된 조건에서 L rrk 1의 평균 인산화 수치가 L rrk 2보다 낮은 것으로 밝혀졌지만, 방사능 작업은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 매우 개인적인 보호 장비 및 해당 기관의 안전 부서에서 제공하는 절차를 통한 작업과 같은 예방 조치는 항상 이 프로토콜을 수행하여 취해야 합니다.