Name: sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 학습하세요 제브라피쉬 신경줄기세포 이동의 실시간 시각화 방법을 공초점 현미경과 카에데 광전환 기술을 사용하여. 이 기술은 두개안면 구조 형성 과정을 연구하는 발달생물학자들에게 중요한 도구입니다.

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저자는 친절하게 제브라 피쉬 sox10 프로모터 시약을 공유 로버트 켈쉬 감사합니다.

1. 광 변환을위한 배아 컬렉션 <ol><li> 저녁에 5 오후 6시 사이에 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬 : sox10의 최소한 10 쌍을 설정합니다. </li><li> 다음 날 아침, 분배기를 끌어 정오 경 계란을 수집합니다. 페트리 접시로 전송하고 28.5 ° C의 배양기에 넣어. </li><li> 약 24 시간 게시물 수정에서 죽은 태아를 제거하여 배양 접시를 청소합니다. 라이트 필드 현미경 및 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 필터가 부착 된 형광 현미경을 이용하여 배아 (13)의 발달 단계를 확인합니다. 단풍 나무는이 필터를 통해 볼 수 있습니다. </li><li> 배아는 별도의 배양 접시에 60 HPF 전송 다섯 밝은 형광 배아에 도달하고 필요한 경우 dechorionate합니다. </li></ol> 2. 광 변환을위한 배아의 설치 <ol><li> 일반 형광 현미경을 사용하여 배아를 장착합니다. 공 초점 현미경에 배아의 설치는 매우 도전이다. </li><li> 스탠드를 사용하여ARD E3 물 또는 다음과 같은 조리법을 사용하여 신선한 E3를 준비 : 1X E3L을 확인하기 위해 다음을 추가 증류수 Dh를 2 O의 L로 다음을 추가합니다 : 0.292 g 5.0 mM의 NaCl을 0.013 g 0.17의 KCl 0.044 g 0.33mM 염화칼슘 (건조, 96 %, ACS 시약) 0.081 g · 33 mM의 망초 (anhydrated) 선택 사항 : 살균제 및 교반으로 1X E3에 0.05 % 메틸렌 블루의 200 μl를 추가합니다. 매체는 실온에서 1 주간 유지한다. </li><li> 표준 tricaine를 사용하거나 다음 조리법을 사용하여 tricaine을 준비 : 0.2 %의 5 L를 들어 다음과 같은 재료를 혼합 tricaine : 45 ㎖의 트리스로-C1 (1M pH9.5) 5 LH 2 O 10g의 tricaine </li><li> 46.​​25 ml의 E3에 4,125 ml의 0.2 % tricaine를 추가하여, &#39;영화 주스&#39;(50 ㎖ E3, 0.015 %의 tricaine 솔루션)을 준비합니다. </li><li> 50 ㎖ 유리 플라스크에 46.35 mg의 저 융점 (LMP) 아가로 오스와 46.25 ML E3 물을 혼합하여 아가로 오스 준비하고 레인지 작동에 의해 고체 입자를 용해. 그런 다음 추가아가로 오스 및 사용 때까지 50 ° C의 물을 욕조에 아가로 오스와 유리 플라스크를 넣어 3.73 ㎖의 0.2 % tricaine. </li></ol> 3. 준비 및 배아의 장착 <ol><li> 챔버 슬라이드 스텝 1.1.2 및 전송 배아에서 만든 E3/0.015 %의 tricaine 솔루션으로 배아를 마취. </li><li> 종이 조직 및 배아 상 아가 있던 모든 초과 E3를 흡수. </li><li> 위치 배아 완벽 microloader 팁과 지느러미. 전체 배아 아가로 오스 위에 떠 있지만, 몸 전체를 아래로 밀어하지 않도록하십시오. 챔버가 완전히 액체로 가득 때까지 아가 포함 된 배아에 E3/0.015 %의 tricaine 솔루션을 붓는다. </li></ol> 4. 공 초점 현미경에 소프트웨어 설정을 조정 <ol><li> 배아를 초점을 맞추기 위해, 20X 공기 내수성 목적 (구멍 크기 20 개구 825)를 사용합니다. 그런 다음 현미경 L100 라이트 버튼을 누르면 소프트웨어에서 채널을 선택합니다. 아이콘을 볼 오픈 / 수집 controls/A1settings와 카릭공 초점 설정 버튼을 K. 다음 &#39;자동&#39;을 클릭하고 다시 창을 닫기 전에 다음 채널을 선택 : CH1 : DAPI 채널 403.4 NM (350-410 나노 미터 사이의 파장이 사용될 수있다) 채널 2 : 488.0 nm의 3 장 : 561.9 nm의 </li></ol> 5. 광 변환 <ol><li> 채널 1과 3의 전원을 끄고 제거 연동 버튼 및 스캔을 클릭하기 전에 채널 2를 켭니다. </li><li> 광 변환에 대한 관심의 세포에 집중하는 것입니다 1frame/sec 고전압 (HV) 200로 시작하는 다음 프레임 / 초에 예정하고 그에 따라 약 1 / 32 프레임 / 초와 HV에 도달 할 때까지 HV를 낮추는 방법으로 수행하는 것이 가장 100 ~ 120, 배경 잡음에 따라. </li><li> 배아에 초점이 맞으면, 화면의 오른쪽 가장자리에 보이는 녹색 테두리를 잡고는 광 변환하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭에 대한 관심의 영역을 맞도록 더 작게 만든다. 광 변환은 되돌릴 수 있기 때문에 작은 좋습니다. </li><li> (200)에 1 HV에 프레임 / 초를 켜고 충돌스캔 할 수 있습니다. 광 변환의 영역에서 확대 된 이미지는 이제 볼 수 있습니다. </li><li> 채널 1 (403.4 nm의)에 돌려 Photoconvert 세포. GFP 채널을 통해 본 녹색 단풍 나무가 거의 없을 때까지이 지역의 크기에 따라, 어디 5-60초 photoconverting 레이저에 노출. </li><li> 녹색 단풍 나무의 신호가 거의없는 경우, 채널 1을 끄십시오. 채널 2와 3을 켭니다. 그런 다음 A1 스캔 영역 필드에 창에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 원하는 세포 photoconverted했다 있는지 확인하는 &#39;원래 크기로 돌아 가기&#39;를 누르십시오. </li></ol> 6. Z-스택 만들기 <ol><li> 메뉴 표시 줄의 아이콘 &#39;캡처 Z-시리즈&#39;를 찾아서 시작하기 전에 Z-스택의 상한과 하한을 설정합니다. LUT를 설정합니다. </li></ol> 7. 소프트웨어 설정 시간 경과 <ol><li> A1Simple GUI 상자로 이동 한 다음 설정을 선택해서 1 / 32 프레임 / 초 크기 1024 보통 4 또는 8X 한 루프에서 촬영되어야하는 Z-스택의 수에 따라 </li><li> :로 이동보기 / 인수 컨트롤 / ND 순서 수집 및 설정 기간 (8 - 30 분), 연속 클릭하고 Z-스택을 클릭합니다. 테스트 이전의 경계를 설정하고 영화를 시작합니다. </li><li> 하루 동안 E3/0.015 %의 tricaine 솔루션 챔버 슬라이드를 계속 추가. 밤에는 완전히 실을 입력합니다. 그 다음날 아침까지 지속됩니다. </li><li> 다음 날 아침, E3/0.015 %의 tricaine 솔루션을 보충하고 태아가 아직 살아 있는지 확인. 형광의 손실이 죽음을 나타냅니다. 하루 동안 보충 및 검사를 계속합니다. </li><li> 구조가 형성 완료, 또는 태아가 사망 한 때, 영화를 완성합니다. </li></ol> 8. 포스트 프로덕션 처리 <ol><li> 도구 모음에 &#39;쇼 최대 강도 투사&#39;를 클릭 한 다음 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 새 문서를 만듭니다. 동영상은 현재 최고의 품질을 볼 수 있습니다. 필요없는 프레임을 삭제하고의 LUT를 조정에 대한 이동합니다. 마지막으로. AVI로 저장합니다. 이 형식은 Windows 용 잘 될 것입니다. 맥 소프트웨어 다운로드 T에 대한오. MOV 또는. wmv로 변환합니다. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+at+Birth+of+Cleft+Lip+With+or+Without+Cleft+Palate%3A+Data+From+the+International+Perinatal+Database+of+Typical+Oral+Clefts+%28IPDTOC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cleft+Palate+Craniofac.+J%22%5BJournal%5D)">Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC).</a> Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).</li>
<li>Dixon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%3A+understanding+genetic+and+environmental+influences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).</li>
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<li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+photoconvertible+proteins+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development.</a> J. Vis. Exp. (67), e4350(2012).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

다음은 제브라 피쉬 모델에서 두개 안면 개발의 시각화를위한 새로운 방법이 표시됩니다. sox10 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬 라인이 성공적으로 자세히 CNCC의 이주 패턴을 설명하는 데 사용 된이 모델 생물 5로 사용됩니다. 이전 연구는 세포를 대상으로 같은 눈으로 총 랜드 마크를 사용하고 단풍 나무 mRNA의 주입, 광 변환 분석 또는 광 변환 10, 11, 14, 15 갇힌 플루 오레 덱스 트란에 의존 삭스 :. 10 단풍 나무 형질 전환 라인이에 비해 많은 장점을 가지고 방법. 신경 능선 세포 이미 단풍 나무 및 매우 특정한 분포를 따르는로 표지로, 운명 매핑에 영역을 설정하기위한 더 정확한 마크가 사용될 수있다. 또, 단풍 나무 갖는 단백질 sox10 프로모터의 제어하에 발현 내생는 신경 능선 세포 photoconverted되도록하고 만 유도체는 이후 단계에서 표시 될 것이다 데잠재적 인 배경 (5) ...

구강 안면 쪼개진 조각이 1/700-1로, 가장 널리 두개 안면 기형을 나타내고, 000의 배송은 1에 영향을 미쳤다. 초기 배아 두개 안면 개발의 중단은 갈라진 입술과 구개 (CL / P)의 형성으로 이어질 수 있습니다. syndromic 분열에 대한 원인은 크게 표시되어 있지만, 구강 안면 clefting의 nonsyndromic 형태의 유전과 후생 유전 학적 기초는 여전히 2-4를 발견해야합니다. 이러한 기형의 병인 및 발병 기전을 이해하기 위해, 셀룰러 기초 두개 안면 구조의 발달을 규명 할 필요가있다. 모든 척추 동물 종에서 두개골 신경 능선 세포 (CNCC)는 구강 안면 구조의 형성에 기여 인두 아치를 채우는 등의 신경 튜브에서 마이그레이션. 초기 배아 신경 능선 개발 중단 CL / P 5-7를 포함한 두개 안면 기형의 형성으로 이어질 수 있습니다. 광고에제브라 피쉬와 포유류의 두개 안면 개발 (CNCCs는 상동 지역에 거주) 사이의 구조적 유사성에 dition은 유전자 조절 네트워크는 매우 절약됩니다. 또한 CNCCs은 제브라 피쉬에게 CL / P.의 발달과 유전 적 기초 연구를위한 강력한 유기체를 만드는 amniote 종과 제브라 피쉬 8과 같은 방식으로 개발하는 것으로 나타났습니다 그것은 작은 크기, 신속하고 전 자궁 내 배아 발달, 높은 번식 속도 등 많은 장점을 가지고 있습니다. 또한, 배아는 현미경 9에서 복잡한 발달 사건의 관찰에이 의무 만들기, 광학적으로 투명합니다. 그것은 마이그레이션 및 두개골 신경 능선 세포의 분화 연구를위한 이상적인 동물 모델입니다. 단풍 나무 형질 전환 모델 5 : 이전에 출판 된 작품 8, 10, 11, CNCC의 이주 패턴에 확장하는 sox10를 사용하여 상세하게 설명했다. 단풍 나무는 광 변환 단백질입니다 TU사진을 활성화 한 후 녹색에서 빨간색으로 RNS와는 가능한 정확하게 CNCCs를 추적 할 수 있습니다. 이 변환 동안 펩타이드 골격은 변환이 세포가 자신의 최종 목적지 (12)에 추적 할 수있는 의미, 안정 것을 제안, 절단됩니다. sox10의 전사 제어에 단풍 나무로 표지 유전자 변형 라인은 amniote 구개 및 제브라 피쉬의 사골 판은 Y 모양의 융합 솔기 사이 유사하다 frontonasal 돌기 ​​(FNP)와 그 양측 상악 홍염 (MXP)의 융합에 의해 상동 형성되는 것으로 나타났다 종. 다른 응용 중에서도 sox10 : 단풍 나무 형질 전환 지브라 피쉬 모델은 정상 및 비정상 두개 안면 구조의 형성을 보여주기 위해 다양한 개발 단계에 제브라 피쉬 배아의 영상을 생성하는 데 사용 하였다. 세포의 특정 그룹의 광 변환은 가능한 그들의 발달을 추적 할 수있다. craniofac 개발의 라이브 영상을 만들려면이 방법 접근 방식제브라 피쉬의 원점이라 구조는 쉽게 시각적으로 복잡한 발달 과정을 설명하기 위해 제작, 도입된다. 예를 들어 형질 전환 지브라 피쉬 단풍 나무 :이 프로토콜은 sox10있는 사골 플레이트의 정상적인 발전을 이용하여 동영상을 생성하는 이들의 경험을 공유 할 목적으로한다. 이 프로토콜은 더 제브라 피쉬의 뇌 신경 능선 세포에서 파생 된 구조의 시간 경과 비디오를 만들기에 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Sox10 : kaede 형질 전환 제브라 피쉬 라인 </td><td>MGH</td><td></td><td>Liao lab</td></tr><tr><td>페트리 접시 100x15 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Petri 접시 35 mmx10 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15517022</td><td></td></tr><tr><td>Lab Tek 2 챔버 슬라이드 시스템 </td><td>LabTek</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더 200/pk</td><td>Fisher</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R Si Confocal Ti 시리즈</td><td>Nikon</td><td>카탈로그 번호</td><td></td></tr><tr><td>없음 NIS 요소 소프트웨어 AR3.2 64비트</td><td>Nikon</td><td>카탈로그 번호</td><td></td></tr></tbody></table> 없음

sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

척추 palatogenesis는 두개골 신경 능선 (CNC) 세포 융합과 얼굴 홍염의 확장 및 두개 안면 골격 성숙의 마이그레이션을 포함하는 고도의 안무와 복잡한 발달 과정이다. 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬 라인이 생성되었습니다 제브라 피쉬 미각의 특정 지역 sox10에 두개골 신경 능선의 기여를 공부합니다. Sox10함으로써 기존의 염료 또는 기자 mRNA의 주입보다 더 정확한 과정을 라벨 세포를 만드는 신경 능선에 단풍 나무 기자 단백질의 계보 제한을 제공합니다. 단풍 나무는 사진을 활성화 한 후 녹색에서 적색으로 점등하고 가능한 정확하게 세포를 수행 할 수있게 광 변환 단백질이다. sox10 : 단풍 나무 유전자 변형 라인은 하악 요소에 비해 상악에 상승을 제공하고 양막 류 (amniotes)에 얼굴 홍염의 상 동성을 설명 CNC의 세포 집단을 묘사하는 혈통 분석을 수행하는 데 사용되었다. 이 프로토콜은 공정을 설명단풍 나무 제브라 피쉬 배아 : sox10의 라이브 시간 경과 비디오를 생성하는의. 사골 판의 개발은 실용적인 예제가 될 것입니다. 이 프로토콜은 형질 전환 제브라 피쉬의 모든 단풍 나무 또는 유사한 photoconvertible 기자 단백질의 시간 경과 공 촛점 촬영하기에 적용 할 수 있습니다. 또한, 제브라 피쉬 돌연변이있는 두개 안면 구조의 정상 만 아니라 비정상적인없는 발전을 캡처하는 데 사용될 수있다.

sox10의 : 단풍 나무 형질 전환 라인, 이주 및 사후 이주 CNCCs은 형광 녹색 표시되어 있습니다. 녹색 형광 단풍 나무로 표지 CNCC 세포는 내생 sox10의 mRNA 발현 5 요점을 되풀이. 다른 애플리케이션 사이에서,이 동물 모델은 더 CNCC 종속 두개 안면 구조의 발달을 시각화하는데 사용되었다. 특정 구조 또한 두개 안면 기형의 병리학 적 개발, 특히 갈라진 입술과 구개의 정상적인 발달을 캡처 한. 다른 발달 시점에 제브라 피쉬의 라이브 시간 경과 비디오 시리즈가 생성되었습니다. 예로서, 60 HPF에서 배아는 페어링 trabeculae은 사골 플레이트를 형성하기 위해 충족되는 스테이지 선택 하였다. 사골 판에서 세포의 가장 앞쪽 부분의 빨간색 표시의 결과로 일방적 인 대상으로 광 변환을 수행 하였다. 우선, 통상의 확장과 토륨의 형성전자 사골 판은 야생형 튀빙겐의 제브라 피쉬 <stro...

실험 데이터의 시각화는 과학계에 결과를 제시하는 핵심 요소가되고있다. 성장하는 배아의 살아있는 시간 경과 기록의 생성은 복잡한 발달 과정의 더 나은 표현과 이해에 기여한다. 이 프로토콜은 제브라 피쉬의 단풍 나무 단백질의 광 변환을 통해 셀 라벨에 대한 단계별 가이드입니다.

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 신경능세포의 이동을 실시간 타임랩스로 기록하여 발달 중인 두개안면 구조의 형성을 보여주는 것입니다. 이를 위해 먼저 마취된 형질전환 SOX 10 KD 제브라피시를 아가로스에 고정하여 실험 중 움직임을 최소화합니다. 그다음 공초점 현미경 하에서 UV 광활성화를 수행하여 신경능세포 내의 KD를 녹색에서 적색으로 전환합니다.그 다음, 광전환된 신경능세포에 초점을 맞춥니다. 타임랩스 영상을 기록하기 전, 발달 중인 구조의 Z-stack을 생성합니다. 그 결과, 형질전환 SOX 10 KD 제브라피쉬 배아에서 두부 신경능세포가 제브라피쉬의 일차 구개로 발달하는 것을 보여주는 결과를 얻습니다.정적 이미징과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포 이동과 같은 복잡한 발달 과정을 실시간으로 시각화할 수 있다는 점입니다. 이를 통해 과학계에서 연구 결과에 더 쉽게 접근할 수 있게 됩니다. 이 방법은 신경능선 세포 유래 구조가 어떻게 형성되는지, 그리고 PTO 유전자가 그 발달에 어떤 영향을 미치는지와 같은 발생 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.배아 마운팅을 준비하기 위해, 125 mL 플라스크를 사용하여 E3 medium과 저융점 agarose를 혼합한 후 마이크로파를 이용해 용액을 용해시킵니다. 그다음 TRITC를 첨가하고 플라스크를 50 °C 항온수조에 넣어 따뜻하게 유지하며, 수정 후 60시간이 경과한 형광 전이 소이네 KD zebrafish 배아를 준비합니다. 이어서 조직지를 사용하여 배아를 각각 챔버 슬라이드로 옮깁니다.과잉의 E three 수를 흡수시킨 다음, agarro 용액을 사용하여 배아를 덮습니다. 마이크로 로더 팁을 사용하여 배아가 완전히 agarro에 잠기도록 배아를 완벽하게 등쪽으로 배치합니다. agarro가 굳으면, 광전환을 수행하기 위해 챔버 슬라이드를 E three 0.015%trica로 채웁니다.먼저 20x 공기 침수 대물렌즈를 사용하여 배아의 초점을 맞춥니다. 그다음 현미경의 L 100 조명 버튼을 누르고 소프트웨어에서 채널을 선택하십시오. 아이콘을 엽니다.획득 제어 A 1 설정을 확인하고, 공초점 설정 버튼을 클릭하십시오. 다음으로, auto를 클릭하고 창을 닫기 전에 채널 1, 2, 3에 대해 각각 DPI 4 88 및 561.9를 선택하십시오. 그런 다음 채널 1과 3을 끄고, 인터락 제거 버튼을 클릭한 후 초당 1프레임 및 HV 200에서 스캔 버튼을 누르십시오.관심 세포에 초점을 맞추기 시작합니다. 초당 프레임 수를 32프레임당 1회로 서서히 늘리고, 배경 노이즈에 따라 전압을 100에서 120으로 낮춥니다. 배아에 초점이 맞으면, 화면 오른쪽 가장자리에 있는 녹색 테두리를 잡고 광전환할 영역에 맞게 크기를 줄인 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭합니다.초당 프레임 수를 1로, HV를 200으로 변경하고 scan을 누릅니다. 이제 광전환 영역의 확대 이미지가 보일 것입니다. 다음 사진으로 넘어갑니다.채널 1을 5초에서 60초 사이로 켜서 녹색 KD 신호가 거의 사라질 때까지 세포를 전환합니다. 그 다음 댑피(dappy) 채널을 끕니다. 채널 2와 3을 켜서 원래 배율로 되돌립니다.확대 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '원래 크기로 돌아가기'를 선택하여 원하는 세포가 적절하게 사진 변환되었는지 확인하십시오. 메뉴 바에서 'Z 시리즈 캡처' 아이콘을 선택하여 Z-stack의 범위를 설정하십시오. 룩업 테이블(LUT)을 조정하여 타임랩스를 설정하십시오.A one simple GUI 상자를 선택하고 다음 설정을 체크하십시오. 초당 32프레임으로 설정합니다. 크기는 1024로 하고, 한 루프에서 촬영해야 하는 Z 스택 수에 따라 평균 4 또는 8x로 설정하십시오.다음으로, ND 시퀀스 획득 뷰어 제어 창으로 이동하여 시간 프레임을 설정하십시오. 그런 다음 continuous를 클릭하고, Zack을 클릭하십시오. 앞서 시연한 대로 경계선을 설정하십시오.영상을 시작하고, 0.015% trica 용액을 챔버에 추가한 후, 하루 동안 슬라이드하여 밤샘 이미징을 위해 챔버를 완전히 채웁니다. 이미징이 완료되면, 최대 강도 투영(maximum intensity projection) 표시를 클릭하여 이미징 파일로부터 고품질 영상을 생성합니다. 그런 다음 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 새 문서를 생성합니다.불필요한 프레임을 삭제하고 L uts를 조정합니다. 제브라피시의 구개 형성(Palato Genesis)을 보여주는 이 영상에서는, primary palate를 형성하기 위해 발달하는 두개 신경능 세포를 추적하기 위해 SOX 10 K 형질전환 라인을 사용합니다. 형성 중인 구개의 가장 앞쪽 세포들은 수정 후 60시간에 녹색에서 적색으로 광전환(photo converted)됩니다.쌍을 이룬 소주(trabecula)가 만나 일차구개(primary palate)를 형성하면, 이 세포들이 최종 목적지에 도달할 때까지 추적합니다. 본 영상에서는 speckle 1b 유전자의 모르노(morino) 매개 넉다운으로 인해 구강안면열 형성으로 이어지는 구개 발달 저해 과정을 보여줍니다. 사선형 안면열 형성에 관여하는 유전자가 예시로 사용되었습니다.60 HPF에서 가장 앞쪽의 사골판 세포를 편측 광전환했을 때, 정중 사골판 세포와 외측 사골판 세포 사이의 융합 실패가 관찰됩니다. 이러한 결함은 외측 비돌기와 상악 돌기 사이의 융합 실패로 인해 발생하는 인간의 사선 안면열 발달 병태생리와 유사합니다. 이 기술은 발달 생물학 분야의 연구자들이 제브라피시의 신경능세포 발달을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후에는 관심 있는 발달 과정을 캡처하기 위해 이 방법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

visualization-craniofacial-development-sox10-kaede-transgenic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

두개 안면 뼈의 세포 조직은 긴 가설하지만 직접 시각화 적이있다. 멀티 스펙트럼 셀 라벨 및 생체 라이브에서   영상은 제브라 피쉬 아래턱에 동적 셀 동작을 시각화 할 수 있습니다. 여기, 우리 세부 프로토콜은 Zebrabow에게 유전자 변형 물고기를 조작하고 직접 세포 인터 및 멕켈의 연골에서 연골 세포의 형태 학적 변화를 관찰한다.

배아 멕켈의 연골에 Zebrabow 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 인터와 방향 확산의 시각화

여기에 기재된 방법은 초점 및 평면 드리프트를 보정하는 광학 절편 및 재조정 간단한 전략을 수행 할 해부 현미경 형광을 사용하여 제브라 피쉬 배아 장기 발전 경과 분석을 허용한다.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

여기에서는 정상적인 발달을 방해하지 않고 살아있는 제브라피시 배아의 후체 발달을 장기간 타임 랩스 이미징할 수 있는 다목적 장착 방법을 제시합니다.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

여기, 우리 제시 우수한 눈 고 랑을 관찰 하는 프로토콜의 표준화 된 시리즈 척추 눈에서 최근 발견, 진화론 보존 구조. Zebrafish 애벌레를 사용 하 여, 형성 및 우수한 눈 고 랑의 폐쇄에 기여 하는 요소를 식별 하는 데 필요한 기술을 설명 합니다.

Danio rerio Embryogenesis 동안 우수한 눈 고 랑의 시각화

이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

학습하세요 제브라피쉬 신경줄기세포 이동의 실시간 시각화 방법을 공초점 현미경과 카에데 광전환 기술을 사용하여. 이 기술은 두개안면 구조 형성 과정을 연구하는 발달생물학자들에게 중요한 도구입니다.

sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

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