September 30th, 2013
실험 데이터의 시각화는 과학계에 결과를 제시하는 핵심 요소가되고있다. 성장하는 배아의 살아있는 시간 경과 기록의 생성은 복잡한 발달 과정의 더 나은 표현과 이해에 기여한다. 이 프로토콜은 제브라 피쉬의 단풍 나무 단백질의 광 변환을 통해 셀 라벨에 대한 단계별 가이드입니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 발달 중인 두개골 얼굴 구조의 형성을 보여주기 위해 신경 능선세포 이동에 대한 실시간 타임 랩스 기록을 생성하는 것입니다. 이는 실험 전반에 걸친 움직임을 최소화하기 위해 먼저 마취된 형질전환 SOX 10 KD 제브라피시를 아가로스에 장착하여 수행됩니다. 다음으로, 컨포칼 현미경 하에서 UV 광활성화를 수행하여 신경능선세포에서 KD를 녹색에서 빨간색으로 변환합니다.
그런 다음 사진에 초점을 맞추면 변환된 신경능선 세포가 있습니다. 타임랩스 비디오가 녹화되기 전에 현상 구조에서 Zack이 생성됩니다. 유전자 변형 SOX 10 KD 제브라피시 배아에서 제브라피시 1차 구개로 두개골 신경 능선 세포의 발달을 보여주는 결과가 얻어졌습니다.
정적 이미징과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포 이동과 같은 복잡한 발달 과정을 실시간으로 시각화할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 과학계에서 결과에 더 쉽게 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 신경능선세포 유래 구조가 어떻게 형성되는지, PTO 유전자가 발달에 어떤 영향을 미치는지와 같은 발달 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.
배아 장착을 준비하려면 125ml 플라스크를 사용하여 E 3 물과 저융점 에어로스 마이크로파를 혼합하여 용액을 용해시킵니다. 그런 다음 트리카를 넣고 플라스크를 섭씨 50도의 수조에 넣어 따뜻하게 유지하고 수정 후 60시간이 지나면 밝은 형광 형질전환 소인 KD 얼룩말 물고기 배아를 둥지로 만듭니다. 그런 다음 티슈 페이퍼와 함께 챔버 슬라이드로 각각 옮깁니다.
여분의 E 3 물을 흡수한 다음 아가로 용액을 사용하여 배아를 덮습니다. 마이크로 로더 팁을 사용하여 배아를 완벽하게 등쪽에 배치하여 배아가 수풀에 완전히 잠기도록 합니다. 한천이 설정된 후 E 3 0.015% trica를 사용하여 챔버 슬라이드를 채워 사진 변환을 수행합니다.
배아에 초점을 맞추기 위해 20 x 공기 침수 대물렌즈를 사용하여 시작합니다. 그런 다음 현미경의 L 100 조명 버튼을 누르고 소프트웨어에서 채널을 선택합니다. 아이콘을 엽니다.
획득 컨트롤 A one 설정을 보고 컨포칼 설정 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 자동을 클릭하고 창을 다시 닫기 전에 채널 4, 88, 561.9에 대해 DPI 1 2 및 3을 각각 선택합니다. 그런 다음 인터록 제거 버튼을 클릭하고 초당 한 프레임부터 시작하는 스캔 버튼과 HV 200을 누르기 전에 채널 1과 3을 끕니다.
관심 세포에 초점을 맞추기 시작합니다. 초당 프레임을 32개당 1개로 점진적으로 늘리고 배경 소음에 따라 전압을 100에서 120으로 줄입니다. 배아에 초점이 맞춰지면 화면 오른쪽 가장자리에 있는 녹색 테두리를 잡고 마우스로 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하기 전에 사진을 변환할 영역에 맞게 축소합니다.
초당 프레임을 1로, HV를 200으로 변경하고 스캔을 누릅니다. 이제 사진 변환 영역의 확대된 이미지가 표시됩니다. 다음 사진.
녹색 KD 신호가 거의 사라질 때까지 5초에서 60초 동안 채널 1을 켜서 셀을 변환합니다. 그런 다음 dappy 채널을 끕니다. 채널 2와 3을 켜서 원래 확대/축소로 돌아갑니다.
확대/축소 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 원래 크기로 돌아가기를 선택하여 원하는 셀이 사진이 적절하게 변환되었는지 확인합니다. 메뉴 표시줄에서 Capture Z Series 아이콘을 선택하여 Zack의 한계를 설정합니다. 룩업 테이블 또는 uts를 조정하여 타임랩스를 설정합니다.
A one simple GUI 상자를 선택하고 다음 설정을 선택합니다. 초당 32프레임당 1회. 크기는 1024이며 하나의 루프에서 가져와야 하는 Z 스택의 수에 따라 평균 4배 또는 8배입니다.
다음으로, 획득 제어 ND 시퀀스 획득 보기로 이동하여 기간을 설정합니다. 그런 다음 연속을 클릭한 다음 Zack을 클릭합니다. 앞에서 설명한 대로 테두리를 설정합니다.
영화를 시작하고, 챔버에 E 3 개의 0.015 % trica 용액을 추가하고, 하루 종일 슬라이드하고 야간 이미징을 위해 챔버를 완전히 채 웁니다. 이미징이 완료되면 show maximum intensity projection(최대 강도 프로젝션 표시)을 클릭하여 이미징 파일에서 고품질 비디오를 만듭니다. 그런 다음 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 새 문서를 만듭니다.
불필요한 프레임을 삭제하고 L을 조정합니다. 제브라피쉬의 팔라토 제네시스(Palato Genesis)를 보여주는 이 동영상에서, SOX 10 K 형질전환 라인은 두개골 신경능선 세포가 발달하여 일차 입천장을 형성할 때 이를 추적하는 데 사용됩니다. 형성되는 입천장의 가장 앞쪽 세포는 수정 후 60시간에 녹색에서 빨간색으로 변환된 사진입니다.
쌍을 이루는 섬유주(trabecula)가 만나 1차 입천장을 형성하면 이 세포들은 최종 목적지에 도달할 때까지 따라갑니다. 이 영화는 구강 안면 구개열, 모리노 매개 반점의 녹다운을 형성하는 교란된 입천장 발달을 보여줍니다. 1 lb, 비스듬한 안면 구순구개열에 관여하는 유전자가 예로 사용됩니다.
60 HPF에서 가장 앞쪽 사골 판 세포의 편측 광 변환은 중앙과 측면 사골 판 세포 사이의 실패 삼출을 보여줍니다. 이 결함은 인간의 비스듬한 안면 구순구개열 발병의 발병 기전과 유사하며, 외측 비강 돌기와 상악 돌출부 사이의 실패 삼출이 발생합니다. 이 기술은 발달 생물학 분야의 연구자들이 제브라피시의 신경능선세포 발달을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 이 방법을 사용하여 관심 있는 발달 과정을 포착하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 프로토콜은 집시 눈물고기 배아에서 뉴런 크레스트 세포 이동을 생생한 시간 경과 녹화를 통해 시각화하는 방법을 설명합니다. Kaede 단백질의 광변환을 이용하여, 연구자들은 두개 안면 구조의 발달을 더 잘 이해할 수 있습니다.
Visualizing cranial neural crest cell dynamics in zebrafish provides a predictive model for mechanistic de-risking in craniofacial target validation. The sox10:kaede transgenic system enables high-resolution temporal tracking of migration and differentiation events relevant to human facial morphogenesis. This approach supports early discovery by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system.
The method integrates into early discovery workflows by providing live imaging of neural crest-derived structures prior to compound screening.