모공 그라디언트, 고분자 전해질 및 그들의 간접적 인 모니터링과 금속 임플란트의 멀티 스케일 변경 생체 내

이 절차의 전반적인 목표는 여러 길이 스케일에서 금속 임플란트를 수정하여 in vitro 및 in vivo에서 세포 거동을 제어하는 것입니다. 이는 먼저 3차원 관형 임플란트 내에서 기공 크기 구배를 생성함으로써 달성되며, 이는 Biofreeze 추출 방법입니다. 두 번째 단계는 콜라겐과 알긴산을 기반으로 한 나노 섬유소 기저막 모방을 층별로 방법론적으로 개발하는 것입니다.

다음으로, 혈장 분석을 사용하여 이식 후 이러한 이식을 모니터링하는 간접적인 방법입니다. HPLC 및 후속 펩타이드 염기서열분석은 궁극적으로 서로 다른 영역이 필요에 따라 다른 세포 유형을 수용할 수 있는 임플란트입니다. 일부 다세포 조직의 경우 얻을 수 있지만 이 시스템은 금속 임플란트를 수정하는 방법을 제공할 수 있습니다.

또한 인공 조직 또는 질병 모델과 같은 3D 세포 배양 모델 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 생체 내에서 다공성 티타늄 보형물 주변의 세포 이동을 제어하는 기술을 찾으려고 할 때 처음 떠올랐습니다. 이 절차를 시작하려면 임플란트를 세척하고 냉동 및 추출을 위해 작성된 텍스트에 설명된 대로 테프론 주형을 설계 및 제조합니다.

고분자 분말을 유기 용매에 도입하여 다이옥신과 물의 이원 혼합물로 합성 고분자 PLLA 용액을 준비합니다. 자기에서 Starr는 균질한 용액을 얻기 위해 혼합물을 섭씨 60도까지 가열합니다. 이 온도는 임플란트에 용액을 도입하는 데 사용되는 정밀 유리 주사기에 대한 온도 저항의 더 높은 한계이기 때문에 선택됩니다.

한편, 동결 용액의 부피 변화를 고려하여 임플란트의 다공성에 대해 필요한 고분자 용액의 부피를 계산합니다. 다음으로, 0.1마이크로리터 정확도의 정밀 유리 주사기를 사용하여 용액을 임플란트에 주입합니다. 폴리머 농도의 하한은 재현 가능한 PO 구배 형성을 위해 3%이며, 6% 이상의 두꺼운 샘플에서 균일한 분포를 얻기 어려워지면 섭씨 영하 80도에서 샘플을 직접 동결하거나 실온에서 30분의 사전 배양 기간으로 샘플을 동결합니다.

동결 조건은 부분적으로 공극 형성을 결정합니다. 따라서 동결 조건은 목표로 하는 다공성에 따라 조정될 수 있습니다. 샘플을 섭씨 영하 80도에서 밤새 보관하십시오.

얼어붙은 상태에서 곰팡이를 분리하는 것은 매우 어려운 단계입니다. 얼어붙은 바텀러 용액과 곰팡이의 접촉을 줄이기 위해 두피를 사용하여 임플란트를 80% 사전 냉각 에탄올에 담그어 다공성 구배를 얻어야 합니다. 미리 식힌 메스를 사용하여 맨드릴을 제외한 모든 금형 부품, 관형 임플란트의 경우 및 디스크 모양의 임플란트의 경우 하단 부분을 제외한 모든 부품을 제거하고 밤새 섭씨 영하 20도에서 추출을 수행합니다.

추출 후 남아 있는 금형 부분을 제거하고 임플란트를 자연 건조시킵니다. 구조의 전체 다공성을 특성화합니다. 수은 산소 농도계 분석이 필요합니다.

이 예에서 수은 산소 농도계 측정값은 임플란트 양쪽의 기공과 더 작은 중간 분산된 기공에 해당하는 뚜렷한 피크를 보여줍니다. 그러나 더 중요한 데이터는 내강 내 표면과 광외 표면의 다공성 간의 차이이며, 이는 기공 크기 분포를 위해 이미지 J로 분석할 수 있습니다. 샘플의 동결 파괴 후 주사 전자 현미경으로 단면을 관찰합니다.

사용되는 임플란트의 개방 다공성 특성과 티타늄의 빛 반사 능력으로 인해 다공성 임플란트 내에서 라벨링된 세포의 Z 스택을 수행할 수 있습니다. PKH 26 또는 칼슘 AM으로 표지된 세포는 다층 형성을 위해 컨포칼 레이저 현미경으로 임플란트를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 디핑 로봇으로 최고의 재현성을 얻을 수 있습니다.

그러나 디핑 로봇을 사용할 수 없는 경우 이러한 단계를 수동으로 수행할 수 있습니다. 콜라겐 용액을 준비하려면 의료용 콜라겐 1형과 알긴산 나트륨을 사용하십시오. 최적화된 농도는 150밀리몰당 리터당 0.5g입니다.

pH 3.8의 염화나트륨 구연산염 완충액은 균질성을 보장하기 위해 콜라겐 용액을 밤새 용해시킵니다. 3.8의 용액 산성 pH는 구조가 불안정하기 때문에 층의 안정적인 축적에 필요합니다. 교차 연결 전에.

중성 pH 설계에서는 고분자 전해질 다층 생산에 사용되는 디핑 로봇과 함께 임플란트를 활용하기 위한 특정 홀더입니다. 티타늄 임플란트 또는 텍스트에 설명 된대로 수정 된 임플란트의 표면에 층을 증착하십시오. 디핑 로봇 시스템을 사용하여 먼저 임플란트를 알긴산 용액에 15분 동안 담근 다음 pH 3.8의 150밀리몰 염화나트륨으로 5분 동안 구조물을 헹굽니다.

그 후 콜라겐 용액에 15분 동안 담그십시오. 먼저 기저막을 안정화하려면 100 밀리몰 게닌에서 가교 결합 용액을 준비합니다. A-D-M-S-O 구연산염 완충액에서 1-4 부피 부피 비율로 게닌을 DMSO 성분에 용해 한 다음 물 성분에서 뭉치는 것을 피하기 위해 12 시간에서 24 시간 사이에 가교 용액에 담궈 샘플을

pH 3.8에서 다량의 구연산염 완충액으로 헹굽니다.단계를 세척한 후 UV 처리로 샘플을 30분 동안 또는 항생제 항진균 수조에서 살균합니다. 기저막 모방의 품질을 결정하는 주요 매개 변수는 두께와 섬유의 직경입니다. 원자력 현미경 또는 접촉 모드에서 얻은 FM 이미지를 사용하여 광섬유 직경을 계산합니다.

질소 흐름으로 샘플을 건조시킨 후 이미징 전에 이미지당 최소 10개 섬유의 두께를 정량화하여 평균 피브릴 두께를 결정합니다. 콜라겐 알긴산 24 이중층 콜라겐 다층 필름을 건조시킨 후 Image J 소프트웨어를 사용하면 스크래치 테스트를 통해 필름의 두께를 결정할 수 있습니다. 먼저 FM을 사용하여 주사기 바늘을 사용하여 필름을 긁고 광학 현미경으로 긁힌 자국을 국소화 한 후 긁힌 자국의 경계에서 10 x 10 평방 미크론 표면에서 FM으로 이미지를 얻습니다.

필름 층의 두께를 제공하는 A FM 소프트웨어로 얻은 프로파일에서 높이를 계산합니다. 텍스트에 설명 된대로 토끼의 기관에 장치를 이식 한 후 귀 정맥에서 혈액 샘플을 얻고 섭씨 4도에서 20 분 동안 5, 000 RPM에서 샘플을 원심 분리하십시오. 0.1%의 트리오르 아세트산이 함유된 토끼 혈장을 추출한 후 분석용으로 얻은 상등액을 사용합니다.

핵 세포 역상 305 C 18 컬럼을 사용하여 추출물을 정제하여 혈장 단백질 함량의 역상 HPLC 정제를 수행합니다. 214 및 280 나노미터에서 텍스트 프로토콜에 있는 용매 시스템과 유속을 사용하여 흡광도를 기록합니다. 증발을 통해 농축하기 전에 피크 분율을 수집합니다.

스피드 진공 어플리케이션을 사용하여 완전히 건조되기 전에 스피드 진공을 중지하는 것이 중요합니다. 이식 기간 동안 서로 다른 시점에서 얻은 피크를 연관시킵니다. 자동 Edmond 염기서열분석에 의한 식별을 위해 이식 과정에서 일관된 경향을 보이는 정제된 펩타이드를 사용하십시오.

샘플을 폴리 브레인 처리된 유리 섬유 필터에 로드하고, pro precise 마이크로 시퀀서를 사용하여 자동 에드몬드 분해를 통해 정제된 펩타이드의 말단 염기서열을 측정합니다. 다음 단계는 C 18 컬럼에서 크로마토그래피를 통해 페닐 th 및 1 아미노산을 식별하는 것입니다. 염기서열을 얻은 후 Swiss Prote 데이터베이스를 사용하여 폭발 소프트웨어로 식별할 수 있습니다.

PLLA 용액의 농도를 변경함으로써 임플란트의 추가 내강 쪽에 있는 기공의 크기를 제어할 수 있습니다. 모공의 크기와 모양은 티타늄 보형물의 존재에 의해 상당한 영향을 받았습니다. 기공 크기는 40에서 100 마이크로미터 범위였으며 낮은 농도를 사용하면 기공이 더 작아진 반면, 내강 내 측면 기공 크기는 제한된 추출에 의해 제어되었으며 약 9미크론으로 섬유아세포의 평균 크기보다 작았습니다.

실온에서 배양 단계를 추가하면 더 큰 기공의 기공 벽이 자체 다공성을 갖는 이중 다공성 구조를 얻을 수 있습니다. 이 기능은 가스와 영양분의 이동을 촉진하기 때문에 두꺼운 보형물에 중요합니다. 공극 구배가 형성된 후, 구조 위에 콜라겐 알긴산 필름 층을 추가할 수 있습니다.

이 필름 층은 PLLA 폼 위에서 안정적이며 폼 나노 스케일 콜라겐 섬유 형태가 없는 경우에도 표면에서 유지될 수 있습니다. 필름 층이 성장함에 따라 필름의 성장은 기하급수적으로 증가합니다. 따라서, 수백 나노미터의 후막을 얻을 수 있습니다.

다공성 티타늄 임플란트는 숙주 조직과 통합되며, 이식된 임플란트 단면에서 볼 수 있듯이 생체 내에서 4주에서 6주 사이에 완전히 채워집니다. 모공 내의 조직은 좋은 수준의 혈관 형성을 가진 성숙한 결합 조직입니다. 이 기간 동안 HPLC 분석은 이식 기간 동안 변동하는 뚜렷한 피크를 보여주었습니다.

관심 있는 피크 분획은 염기서열을 분석한 결과 알파 및 베타 헤모글로빈 반쇄로 결정되었으며, 이는 C-반응성 단백질 판독과 유사한 경향을 보였습니다. 일단 마스터하면 이 기술을 제대로 수행하면 하루 만에 완료할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 금속 임플란트 변형 및 세포 배양 실험을 위해 3D 멀티스케일 PO 그래디언트를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

필름 형성에 의한 동결 추출 및 층은 세포를 위한 고유한 변형된 임플란트 또는 미세 환경을 개발하기 위한 간단한 금속입니다.