Zebrafish의 유충의 근육 기능을 평가하기 위해 수축하는 동안 힘 측정

이 절차의 전반적인 목표는 얼룩말 물고기, 유충, 몸통 근육의 최대 수축 동안 힘 생성을 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 힘을 측정하는 동안 유충을 제자리에 고정하는 데 사용할 봉합 루프를 만들어 수행됩니다. 다음으로, 마취된 유충을 실험실 내부에 배치합니다.

일단 제자리에 고정되면 최대 경련 수축 중에 힘이 기록됩니다. 마지막 단계는 몸통 근육의 치수를 측정하여 최대 힘을 근육 단면적으로 정규화할 수 있도록 하는 것입니다. 궁극적으로 수축 중 힘 생성을 측정하는 것은 근육 기능과 전반적인 근육 건강의 변화를 보여주는 데 사용됩니다.

우리는 야생형 제브라피시 유충을 사용하여 이 방법을 시연하지만 유전자 변형 유충 또는 약물 또는 독성 물질로 처리된 유충에도 사용할 수 있습니다. 그런 다음 이 방법을 사용하여 근육 질환 모델을 특성화하고 치료를 평가하거나 근육 발달, 부상 또는 화학적 독성을 연구할 수 있습니다. 첫 번째 단계는 유충을 제자리에 고정하는 데 사용할 봉합 루프를 준비하는 것입니다.

힘 테스트 중에는 집게를 사용하여 비멸균 봉합사를 세 가닥으로 분리합니다. 분리되면 가닥 중 하나에 이중 오버핸드 매듭을 묶기 시작하되 매듭을 완전히 조여 작은 고리를 만들기 전에 멈춥니다. 대신 루프를 마무리하려면 가위를 사용하여 꼬리에서 과도한 봉합사를 자릅니다.

나중에 사용할 수 있도록 스티커 메모의 접착 면에 고리를 놓습니다. 테스트할 각 유충에 대해 두 개의 봉합 루프를 만듭니다. 먼저 테스트 장치를 실체 현미경의 무대에 놓습니다.

다음으로, 힘 트랜스듀서와 길이 컨트롤러 케이블을 테스트 장치에 연결합니다. 힘 변환기와 길이 조절기를 켜고 길이 제어기 전면에 있는 스위치를 뒤집습니다. 그것은 길이 컨트롤러 튜브를 일회용 전송으로 연결시킵니다. 피펫.

실험 챔버를 테스트 용액으로 채웁니다. 집게를 사용하여 꼬리 중 하나로 봉합 고리를 잡아 그립으로 잡습니다. 구부러진 부분의 루프는 봉합사를 꼬아 후속 단계에서 끊어질 수 있습니다.

힘 변환기 튜브에 루프 하나를 걸고 길이 컨트롤러에 다른 루프를 걸고 일회용 전사 피펫을 사용하여 제브라피시 유충을 테스트 용액으로 채워진 작은 페트리 접시에 옮깁니다. 마취제가 효과를 발휘하면 꼬리를 부드럽게 살짝 찔러 수영을 연상시키는 촉감이 부족한지 확인합니다. 다음으로, 유리 피펫을 사용하여 집게로 유충을 실험실로 옮깁니다.

힘 변환기 튜브의 봉합 루프를 통해 유충의 앞쪽 부분을 부드럽게 안내하고 봉합 루프의 양쪽 꼬리를 잡습니다. 동시에 당겨 루프를 참나무 주머니 뒤쪽으로 조이거나 집게로 방광을 수영합니다. 봉합사 꼬리 하나를 잡고 당기면 유충의 측면이 위를 향할 때까지 유충이 튜브 주위를 90도 회전합니다.

길이 컨트롤러에 부착된 X, Y, Z 포지셔닝 장치를 사용하여 길이 컨트롤러 튜브를 x축을 따라 유충의 몸통과 꼬리 아래로 이동합니다. 길이 컨트롤러 튜브의 끝과 힘 변환기 튜브 사이에 공간을 두십시오. 다음으로, 봉합 고리를 유충의 꼬리 위로 안내하고 봉합 고리를 조입니다.

이전에 시연한 바와 같이, 측면이 위를 향하도록 유충의 뒤쪽 부분을 회전해야 할 수도 있습니다. 제자리에 고정되면 봉합사 루프 꼬리를 자릅니다. XY, Z 포지셔닝 장치를 사용하여 챔버 바닥에 닿을 때까지 튜브를 천천히 내립니다.

그런 다음 유충을 챔버 바닥에서 적절한 거리로 들어 올립니다. 이는 나중에 사용되는 도립 현미경 대물렌즈의 working distance 내에 있어야 합니다. 마지막으로, 길이 컨트롤러 튜브를 조정하여 유충의 장축을 힘 변환기 튜브의 장축과 정렬합니다.

시작하려면 테스트 장치를 도립 현미경의 단계로 이동합니다. 다음으로, 수조 순환 온도계와 온도 조절기를 테스트 장치에 연결합니다. 필요한 구성 요소를 켜고 온도 컨트롤러의 설정을 원하는 값으로 조정하십시오.

자극기에서 테스트 장치로 케이블을 연결합니다. 자극기의 전원을 켜되 이 시점에서 유충을 자극하지 마십시오. 유충이 챔버 바닥과 평행한지 확인하려면 튜브 끝 사이의 유충 부분을 봅니다.

평행하면 필요한 경우 유충의 양쪽 끝에 초점이 맞춰집니다. 양쪽 끝에 초점이 맞춰지고 유충이 평행이 될 때까지 힘 변환기 튜브를 조정합니다. 비디오 sarcomere 길이 시스템을 켜고 줄무늬가 비디오 프레임의 측면과 평행이 되도록 비디오 카메라를 회전합니다.

줄무늬 간격은 sarcomere 길이의 지표로 사용됩니다. 주변 섬유에 초점을 맞추도록 현미경을 조정하고 표시된 sarcomere 길이를 기록하십시오. 필요한 경우 길이 조절기를 조정하여 sarcomere 길이가 최적보다 작아질 때까지 유충을 줄여 트위스트 힘을 최적화합니다.

먼저 자극기의 출력 전류를 낮은 크기로 설정한 다음 전류 펄스를 전달하도록 특수 소프트웨어를 프로그래밍합니다. 지속 시간 0.2밀리초. 첫 번째 펄스를 전달하고 오실로스코프를 사용하여 피크 트위치 힘을 측정합니다.

전류를 50밀리암페어 단위로 증가시키고 각각의 새로운 전류 레벨에서 최대 트위치 힘을 측정합니다. 자극 전류가 증가함에 따라 피로를 방지하기 위해 경련 사이에 30초 동안 기다립니다. 최대 경련력은 일반적으로 최대로 증가한 다음 유충이 생성하는 전류를 점차적으로 감소시킵니다.

가장 큰 힘은 최적의 자극 전류입니다.일단 확인되면 전류 진폭을 최적의 자극 전류로 설정하고 최대 경련력을 이끌어내기 위해 유충의 길이를 조정합니다. 마지막으로 유충 근육의 경련을 이끌어냅니다. 오실로스코프를 사용하여 힘 반응을 기록하고 후속 분석을 위해 기록을 저장합니다.

근육 조직의 치수를 측정하려면 테스트 장치를 실체 현미경으로 다시 옮기십시오. IP 스케일을 사용하여 측면에서 보는 근육 조직의 높이를 측정합니다. 해부학적 랜드마크에서 측정합니다.

예를 들어, 비뇨생식기 개구부는 빨간색으로 표시되어 있습니다. 그런 다음 유충의 길이를 변경하지 않도록주의하십시오. 유충을 바닥에서 보기 위해 봉합사 루프 꼬리를 사용하여 유충을 90도 회전합니다.

아래에서 보는 근육 조직의 너비를 측정합니다. 마지막으로, 건강한 야생형 제브라피쉬 유충의 경우 테스트 장비에서 유충을 방출하기 위해 마이크로 블레이드로 봉합 루프를 절단하고, 근육 섬유는 그들 사이에 큰 틈이 없이 서로 평행해야 하며 증거가 있어야 합니다. 이러한 특징을 나타내지 않거나 여기에서 볼 수 있듯이 섬유가 분리되는 등 명백한 손상이 있는 야생형 제브라피시 유충은 여기에서 폐기해야 합니다. 최대 경련력 대 자극 전류는 단일 제브라피시 유충에 대해 표시됩니다.

최적의 자극 전류는 일반적으로 400에서 600밀리암페어 사이입니다. 단일 유충의 최대 경련 수축 동안 수집된 대표적인 힘 반응이 여기에 나와 있습니다. 여기. 나이가 다른 야생형 유충의 최대 힘 값은 0.9에서 1.7 사이인 것으로 나타났습니다.

늙은 애벌레가 어린 애벌레보다 더 많은 힘을 생성하는 밀리 뉴턴. 나이가 많은 유충은 최대 힘이 단면 근육 면적으로 정규화 된 후에도 어린 유충보다 더 많은 힘을 생성합니다. 이 절차를 시도하는 동안 유충이 힘 변환기와 길이 컨트롤러 튜브 주위에서 쉽게 회전할 수 없도록 봉합사 루프를 충분히 조이는 것이 중요합니다.

봉합사 루프가 너무 느슨하면 유충에 의해 생성된 힘이 힘 변환기에 완전히 전달되지 않고 최대 트위스트 힘이 과소평가됩니다.