Name: 합성, 세포 전달 및 생체 내 덴드리머 기반 pH 센서의 응용 프로그램 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: 배우세요 덴드리머 기반 형광 pH 센서 합성 및 세포 전달 방법을 통해 생체 내 pH 이미징을 수행하는 기술입니다. 이 방법은 신경과학 및 세포 생물학 연구에서 pH 변화를 정밀 측정하는 데 활용됩니다.

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Isja 데 Feijter와 매트 베이커 유용한 논의에 대해 감사의 말을 전한다.

1. 센서의 합성 <ol><li> 다음 섹션에서 우리는 PAMAM 덴드리머에 산도 지표의 활용에 대한 절차를 제공합니다. 동일한 프로토콜이 다른 아민 - 함유 덴드리머에 최소한의 변형으로 적용 할 수있다. 5,17,13,14 시판 덴드리머 및 염료 더욱 않는 정화없이 사용할 수있다. </li><li> 무수 DMSO (50 μM 최종 농도)의 덴드리머를 녹인다. 무수 DMSO에 플루오 레세 인 NHS와 테트라 메틸 로다 민 - NHS (TMR)의 10mM을 재고 솔루션을 준비합니다. </li><li> 덴드리머의 용액에 형광 및 TMR의 원하는 금액을 추가합니다. 혼합물 중 몰비는 덴드리머에 로딩 염료의 양을 반영 할 것이다. 일반적으로 microcentrifuge 관에있는 G4의 PAMAM 덴드리머 용액 1 ㎖는 형광의 8 EQ (40 μL) 및 TMR의 8 EQ (40 μL)와 반응한다. 12 시간 동안 실온에서 용액을 교반 하였다. </li><li> 탈 이온수로 1:10 희석하고 반응을로드투석 백 (MWCO = 10 kDa의)의 혼합물. 저수지에서 자주 물을 대체하는 탈 이온수에 24 시간 동안 Dialyze. </li><li> 유리 병에 솔루션을 전송하고 동결 건조 24 시간 동안을. 보라색 ​​분말을 얻을 수 있어야합니다. 무게 고체 수득하고 10 μM의 최종 농도를 MilliQ 물에 녹여. -20 ° C에서 솔루션 및 저장을 나누어지는 </li></ol> 2. 체외 pH 측정 <ol><li> 체외 교정 석영 큐벳에 PBS에서 덴드리머의 용액 500 ㎚ (2 MM의 인산)를 준비하고 있습니다. 적정 기간 동안의 pH의 급격한 변화를 방지하기 위해 매우 희석 PBS 버퍼 (2 ㎜)을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 형광의 발광 스펙트럼 (EXC 488 NM) 및 TMR (EXC 550 NM)를 측정하고 양호한 신호 대 잡음 비율을 달성하기 위해 형광 계의 광학 설정을 최적화. </li><li> 모든 첨가가 큐벳을 흔들어 후 NaOH를 0.1 N 염산과 0.1 N.의 소량을 첨가하여 pH를 적정을 수행믹싱, 평형 1 분을 기다린 산도 미세 전극에 의해 pH를 측정한다. 형광 및 TMR의 발광 스펙트럼은 광 설정의 변경없이 모든 단계에 기록되어야한다. </li><li> 적정 산도를위한 대 형광 강도를 플롯. 로다 민 신호의 pH (&lt;10 %)에 의해 영향을받지 않습니다. 형광 신호는 S 자형 곡선이어야하며 PK = 6.4의 단일 결합 모델을 설치해야한다. </li></ol> 3. 세포 배양 및 Electroporation에 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 (Invitrogen 사)로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 HeLa 세포를 연마한다. 가습 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 세포 배양을 유지합니다. </li><li> 덴드리머 일렉트로의 경우, 세포가 컨 플루 언트 될 때, 미디어를 제거하고 DPBS (둘 베코 인산염 완충 식염수)를 사용하여 세포를 씻어. DPBS를 제거하고 트립신-EDTA를 추가합니다. 트립 중화매체에 포함 된 혈청하지만 항생제를 추가하여 죄. 실온에서 2 분 동안 900-1,200 rpm에서 원심 분리기. 용지를 제거하고 DPBS를 사용하여 알약을 씻어. </li><li> 세포를 세어 4 × 10 6 세포를 취할. 실온에서 2 분 동안 1,200-1,500 rpm에서 원심 분리기. </li><li> (microporator 제조업체에서 제공) microporation 완충액 200 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 세포를 옮긴다. </li><li> 재현 탁 세포로 덴드리머 수용액을 추가합니다. 샘플 당 필요한 덴드리머의 양은 PAMAM 타입 (양이온과 중성 덴드리머 2 μM에 대한 일반적으로 250 nm의)에 따라 달라집니다. </li><li> microporation 튜브 (microporator 제조업체에서 제공) 일렉트로 버퍼를 추가합니다. 100 μL 볼륨 크기의 일렉트로 끝을 가진 세포와 덴드리머 혼합물을 피펫. 피펫 스테이션에 microporator 피펫을 삽입합니다. microporation의 펄스 조건을 설정 : 펄스 전압 = 1,005 V, 펄스 떨어 졌일 35 밀리 초 =; 펄스 수 = 2. </li><li> 1,200 rpm에서 5 분 동안 1.5 밀리리터 microcentrifuge 관 원심 분리 세포 펄스 전송 세포 배지에서 덴드리머의 과잉을 제거 후. 새로운 배지와 함께 접시 35mm 유리 바닥 요리 상에 electroporation하여 세포의 10 μL (WillCo - 요리 GWSt-3522) w / 항생제 오. </li></ol> 4. 생활 헬라 세포의 pH를 감지 <ol><li> 일렉트로 후 공 초점 현미경 12 시간과 이미지 세포. </li><li> 플루오 레세 인 및 로다 민을위한 기본 필터 세트가 사용될 수있다. 550 ㎚, 580 ㎚ ​​내지 650 nm의 빨강 채널 - 파장 가변 필터는 500에서 녹색 채널을 사용할 수 설정되어있는 경우. 로다 민은 하나 543nm 또는 561 레이저 줄을 이미지화 할 수있는 동안 488nm에서 여기가 형광에 최적입니다. </li><li> 시험편에 초점 레이저 전력을 조정하고 검출기는 신호 대 잡음비를 최대화하도록 얻는다. 일렉트로 이었다면 성공적인 세포는 두 채널에서 밝은 형광해야한다.현지화는 사용 된 덴드리머의 크기와 비용에 따라 달라집니다. 종종 일부 리소좀 현지화 (작은 핵 주변 소포가)에 의한 엔도 시토 시스 또는 구획화에 존재한다. 리소좀 현지화가 지배적 인 경우, 즉 형광의 대부분은 소포 내부 지역화와 가난한 신호가 세포질에서 관찰되며,이 의미 독성 측정을 폐기해야합니다. 획득 여러 이미지를 필요로하는 경우, 순차적으로 두 개의 채널을 획득하고 이미지 품질을 개선하기 위해 이미지를 평균. </li><li> 교정 클램프 셀 pH가 상이한 pH에서 ionophores로 버퍼를 이용하여 전술 한 바와 같이 pH를 당 적어도 20 세포를 얻기위한. 절차에 대한 자세한 설명 및 버퍼의 구성을 위해 Bizzarri 및 동료를 참조하시기 바랍니다. 16 우리는 pH가 5.5에서 pH가 7.5 이상 5 점을 측정하는 것이 좋습니다. 6 아래 pH가 세포에 독성하지만 시간이 짧은 금액에 대한 허용, 우리는 가능한 한 빨리 이미지를 수집하는 것이 좋습니다. 만약 세포세포 사멸의 조짐을 보여, 세포를 폐기하고 다시 시작합니다. </li><li> ImageJ에 또는 데이터 분석을위한 유사한 소프트웨어를 사용합니다. 녹색과 적색 채널의 이미지를 가져, 배경을 빼고 도구 &quot;이미지 계산기&quot;와 픽셀의 비율을 영상으로 픽셀을 만듭니다. </li><li> 원하는 셀을 선택이자 (ROI)의 영역을 그리고 세포 내 녹색에 붉은 비율을 측정합니다. 획득 한 모든 이미지를 분석 한 후 pH를 대 비율을 플롯. 5.5-7.5 범위에서 경향은 선형이어야한다. 얻어진 점의 선형 피팅은 pH로 녹색 대 적색의 비율을 변환하는 데 사용되는 검량선을 줄 것이다. </li><li> 또한 제어 등 여러 가지 치료 세포 (아무 ionophores)를 획득하고 획득 된 보정 곡선으로 pH를 계산하려고합니다. 7.2과 7.4 사이의 값을 얻을 수 있어야합니다. </li></ol> 5. 생체 시료 준비 <ol><li> 실험은 출생 후 D 사이에 C57BL/6J (남성과 여성)에 실시 하였다바깥 (28) 및 (70). 우레탄의 복강 내 주사 (즉, 에틸 카바 메이트) (20 % 생리 식염수에있는 W / V, 20 ㎎ / ㎏ 우레탄)와 마우스를 마취. 동물은 같은 마취의 심장 내 주사 다음에 우레탄의 과다 복용과 실험 후 희생되었다. </li><li> 수술하는 동안 대뇌 피질의 스트레스 반응과 대뇌 부종을 줄이기 위해 덱사메타손 인산 나트륨 (2 ㎎ / ㎏ 체중)의 근육 내 주사를 수행합니다. </li><li> 동물의 머리를 면도하고 두피에 2.5 % 리도카인 젤을 적용합니다. </li><li> 두 반구의 두개골을 덮고있는 피부의 플랩을 가위로 잘라 사용 </li><li> 식염수에 노출 된 뼈를 세척하고 부드럽게 집게를 사용하여 골막을 제거합니다. 이 접착제와 함께 준수하는 치과 용 시멘트를위한 더 나은 기반을 제공 할 것입니다. </li><li> 중앙 이미징 챔버와 주문품 스틸 헤드 게시물을 적용하고 평면에서 시아 노 아크릴 레이트로 접착제를 약 I의 대뇌 피질의 영역에 대한 두개골과 평행nterest 화이트 치과 시멘트 (Paladur) 제자리에 고정합니다. </li><li> 관심 영역에 걸쳐 드릴 직경 2 ~ 3 ㎜의 개두술을 수행하기 위해 마우스의 머리를 고정한다. </li><li> 수술, 경막 눈물, 또는 출혈 중에 피질의 발열을 최소화하기 위해보십시오. </li><li> 멸균 ACSF (126 mM의 NaCl을, 3 밀리미터의 KCl, 1.2 mM의 KH 2 PO 4, 1.3 mM의 망초, 26 mM의 탄산 수소 나트륨, 2.4 mM의 염화칼슘과 superfused 피질을 유지, 15 mM의 포도당, 1.2 mM의 HEPES 증류수 H 2 O , 산도 = 7.4). </li></ol> 6. 마우스의 뇌에있는 산도 영상 <ol><li> O 2 풍부한 공기를 제공하는 실험 보조 동물의 호흡시. 산소는 80 %까지 충실. O 2 분압 및 흐름은 종종 적절한 호흡 원조를 구하는 조정된다. 피드백 제어 난방 담요로 37 ° C에서 몸의 온도를 일정하게 유지. </li><li> 두 사진의 목적하에 강주 통해 동물 고쳐N 영상 설치. </li><li> 뇌 피질 센서를 주입하기 위해 덴드리머의 용액 (1 μM)와 함께의 AgCl 전극 (팁 직경 4mm)를 함유하는 유리 피펫을로드. 전극은 세포 분야의 잠재력을 기록 할 수 있습니다. </li><li> 미세 주입 설정으로 약 150 μm의 깊이에서 피질에 피펫을 삽입합니다. 0.5 PSI의 압력에서 1-2 분 동안 주입한다. </li><li> 이미징을위한 광학 설정을 최적화합니다. 레이저 파워는 광표백 및 광 손상을 최소화하기 위해 조정해야합니다. 채용 전형적 레이저 파워는 이전의 교정은이 전압이 최상의 S / N 비율을주는 것으로 나타났다 이후 mW의 PMT 및 이득이 667 V로 일정하게 유지 하였다 약 20이다. </li><li> 영상의 경우 820 nm에서 센서를 자극하고 표준 FITC와 TRITC 필터를 통해 형광 및 로다 민 형광을 동시에 탐지. </li><li> 시간이 해결 된 측정은 2 Hz에서 시간 경과 시리즈를 획득. </li><li> 배경 보정 LASE과 어두운 프레임을 취득 들어R 셔터 통상 전자에 의해 추가 및 PMT의 대좌에 발생하는 평균 열 잡음을 측정하는 폐쇄. </li><li> 데이터 분석을 위해 4 장에서보고 된 절차를 따릅니다. </li></ol>

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</ol>

기본값 : 저자가 공개하는 게 없다.

덴드리머 기반 센서와 성공의 pH 이미징을위한 중요한 단계는 다음과 같습니다 I) 올바른 돌기 발판의 선택과 그것을 복합 지표의 수와 세포 또는 생체 내에서 센서 배달 프로토콜의 II) 최적화. 합성 절차는 매우 쉽고, 모든 아민 - 함유 하이퍼 브랜치 폴리머에 거의 적용 할 수있다. 센서는 하나의 단계에서 시판 덴드리머 및 NHS-활성화 된 염료로부터 얻어 질 수있다. 우리는이 모듈 식의 간단한 절차 생물학적 다양한 질문에 대한 이러한 센서의 추가 응용 프로그램에 도움이 될 것이라고 믿는다. 정제 효과적으로 비 접합 염료를 제거하기 위해 투석에 의해 달성 될 수있다. 수지상 발판의 선택은 매우 중요합니다 원하는 특정 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 다른 덴드리머는 s의 특정 상호 작용으로 인해 세포 내부에 특유의 현지화 버전이 표시되었습니다ubcellular 구조. 중립 덴드리머 (예를 들어 PAMAM G4를 아세틸 화) 세포 내부의 상호 작...

특정 생물학적으로 중요한 분자를 라벨에 형광 분자의 사용은 완전히 우리가 생물 학적 시스템을 연구하는 방법을 변경했습니다. 위드 요즘 실시간 고해상도 생물학적 과정의 시각화를 허용 공 초점 현미경 세포와 생체 내에서 체외에서 생체 이벤트를 공부하는 가장 인기있는 방법 중 하나입니다. 1 관련 개선이 형광 지표의 개발에 의해 표현 된 누구의 형광 특정 분자 기업의 농도에 따라 달라집니다 즉, 염료. 특히 pH와 칼슘 지표로 인해 H + 및 CA 생물학 2 + 이온의 거대한 관련성에 세포 생리학의 연구에 큰 영향을 미쳤다. 2,3 세포 내 targeti에있는 I)의 어려움 그러나, 현재 감지 염료의 대부분의 몇 가지 고유 제한과 같은 자신의 작은 분자 동작과 관련된NG, 물, 결과적으로 가난한 생체 적합성 II) 용해도;. 및 III) 세포의 누출과 긴 시간 경과 이미징 능력 4, 따라서 부족 또한, 다양한 프로브의 신호는 염료 농도에 의존 보정 할 수없는 (비 비율 계량 영상) 때문에, 세포 또는 생체 내에서 절대 측정이 불가능합니다. 우리는 최근 덴드리머 골격에 감지 염료의 공액에 기초하여 이러한 한계를 극복하기위한 간단하고 효과적인 방법을 설명했다. 5 덴드리머 생물학적 응용을위한 매우 매력적인 특성을 갖는 단 분산 하이퍼 브랜치 폴리머이다. 특히 6가 몇개 수지상 구조가 개발되고 사용되어왔다 약 7 및 유전자 전달을 위해. 8 만 아주 최근에 여러 그룹이 감지 장치를위한 발판으로 이러한 분자의 잠재력을 탐구하기 시작했다. 9,10,11 이전에 우리는NHS-활성화 된 에스테르에 따라 다른 폴리아의 기능화 향해 락 합성 경로 (PAMAM) 발판을 설명했다. 12 접합체만을 정제로서 투석에 의해 단일 단계로 얻어 질 수있다. 흥미롭게도이 방법은 쉽게 수지상 또는 중합체 지지체의 다양한 적용 할 수있다. 13,14 I)의 pH 표시 (예 : 플루오 레세 인) 및 II)의 pH에 의존 형광 부분 (즉, 로다 민) : 비율 적 영상 덴드리머를 달성하기 위해 두 번 표시 염료의 두 세트와 함께했다. 이것은 우리가 형광 및 로다 민 사이의 비율은 pH를에만 의존하고 더 이상의 프로브의 농도에서 정확한 산도 촬상을 수행 할 수 있었다. 수명이 측정이 비율 적 교정이 필요하지 않습니다 프로브 농도에 의존하지 않기 때문에이 문제에 대한 또 다른 흥미로운 접근 방식은 수명 기반 프로브의 사용. (15)에 의해 표현된다. 그러나, 난생etime 측정은 더 복잡 수단 설정이 필요하고 자신의 시간 해상도는 이렇게 자신의 잠재적 인 응용 프로그램을 제한, 빠른 생리 학적 프로세스 차선입니다. 세포 이미징을 수행하기 위해, 프로브는 세포질로 세포막을 가로 질러 전달 될 필요가있다. 덴드리머 때문에 크기와 친수성을 투과 막되어 있지 않으므로, 세포 내 전달은 전기 충격을 통해 달성 될 수있다. 널리 형질에 대한 생물학에서 사용되는이 기술에 의해, 표시 고분자 효율적으로 고품질의 영상을 수행하는 세포로 전달 될 수있다. 고분자 직접 세포질로 전달 될 때 더욱이, 전기 천공으로 덴드리머 내 이입에 관련된 합병증을 피할 수있다. 일렉트로 다른 덴드리머도 특정 표적 서열의 부재에서 세포 내부에 서로 다른 언어 버전을 보여줍니다 흥미롭게 후. 5이 passiv에게전자 만 인해 덴드리머의 물리 화학적 특성에 따라, 대상, 세포 기관 고유의 pH 영상을 달성하기 위해 이용 될 수있다. 비례 이미징은 공 촛점 현미경을 사용하여 수행 될 수있다. 공유 돌기 발판에 접합 플루 오레와 로다 민은 개별적으로 몇 군데 있었다 및 픽셀 단위 비율의지도를 만들었습니다. ionophores에 의해 살아있는 세포에서 세포 내 산도를 제어하는​​ 몇 가지 절차가보고되었다. Ionophores는 세포막을 통해 이온을 수송 할 수 작은 소수성 분자, H + 이온에 대한 ionophores 같은 nigericin로 사용할 수 있습니다 및 덴드리머 기반 센서를 보정하는 데 사용할 수있는 16로 이러한 측정치가 관찰 된 것과 유사 산도에 선형 응답을 공개했다. 체외. 교정 세포 내 pH를 기초로 정확하게 측정 될 수있다. 이러한 측정은 덴드리머 기반 센서는 연구 H + homeost에 귀중한 도구가 될 수 있다는 것을 보여 주었다아시시는 살아있는 세포 병리학 과정에서 pH를 조절 오작동을 포함하는. 우리는 최근 덴드리머 pH 센서는 또한 마취 된 쥐의 뇌에서의 pH 촬상을 행하는, 생체 내에서 적용 할 수 있음을 보여 주었다. 17 인해 생체 센싱 고품질 기술적 도전 생체 조직의 복잡한 환경. 여기에서 우리는 뇌의 정확한 pH를 이미징을 수행하기 위해 해결해야 할 중요한 문제에 중점을두고 생체 내 pH를 영상에 대한 실험 절차에 대한 자세한 설명을 보여줍니다. 이광자 현미경은 두 가지 이유 때문에 사용되어왔다 : ⅰ) 외광의 사용은 표준 공 초점 현미경의 조직 침투의 부족을 극복 할 수 있도록, II) 형광 및 로다 민의 광범위한 이광자 흡수은 동시 자극은 회피 허용 여기 두 파장의 사용과 관련된 합병증. 마우스 뇌의 pH를 측정했다성공적으로 수행, 센서는 쉽게 뇌 세포 외 공간에서의 pH의 변화를 유도 저산소증에 반응한다. 이러한 측정은 덴드리머 계 지표 성공적 동물 모델에서 생체 내에서의 pH의 생리 학적 및 병리학 적 변화를 강조하는 데 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>PAMAM G4</td><td>시그마 알드리치</td><td>412449</td><td></td></tr><tr><td>카르복시 플루오레세인 NHS 에스테르</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>C-1311</td><td></td></tr><tr><td>TMR NHS 에스테르</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>C-1171</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마 알드리치</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dyalsis 가방</td><td>스펙트럼 연구소</td><td>132117</td><td></td></tr><tr><td>WillCo 접시</td><td>WillCo 웰스</td><td>GWSt-3512</td><td></td></tr><tr><td>우레탄</td><td>시그마-알드리치</td><td>U2500</td><td></td></tr></tbody></table>

합성, 세포 전달 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 덴드리머 기반 ph 센서의 응용 프로그램

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

형광 지표의 개발은 생명 과학 분야의 혁명을 표현. 유전자 인코딩 감지 능력을 가진 합성 형광체는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 생물학적으로 중요한 종의 시각화를 허용했다. 합성 염료는 높은 조정 기능과 측정 가능한 분석의 다양한 분야에 특별한 관심 덕분이다. 그러나 이러한 분자 (용해도가 타겟팅에 어려움이 종종 더 비율 계량 영상은 허용되지 않습니다) 작은 분자 행동과 관련된 몇 가지 제한 사항을 겪고 있습니다. 본 연구에서 우리는 덴드리머 기반 센서의 개발을 소개하고 살아있는 세포 및 생체 내에서, 시험관 내에서 pH를 측정하는 절차를 제시한다. 우리는 그 몇 가지 생물 의학 장치에 널리 사용되는 발판 만든 그들의 많은 바람직한 특성 (단 분산, 조정 가능한 속성, multivalency)에 대한 우리의 센서를위한 이상적인 플랫폼으로 덴드리머를 선택합니다. 형광의 pH의 활용덴드리머의 발판을 지표들이 감지 성능의 향상되었다. 특히 덴드리머 전시 세포 누출, 개선 된 세포 타겟팅 및 비율 계량 측정을 할 수 감소. 이 새로운 센서는 성공적으로 HeLa 세포 생활에 마우스 뇌의 생체 내에서의 pH를 측정하기 위해 사용되었다.

도 1은 상이한 수지상 비계에 염료를 감지 공액의 개략도를 나타낸다. 얻어진 지표 시판품으로부터 한 락 합성 단계에서 얻을 수있다. 아민 함유 덴드리머는 DMSO의 NHS-활성화 염료와 반응 투석에 의해 정제된다. 이 일반적인 절차는 이미 성공적으로 여러 덴드리머의 라벨에 사용되었습니다 I) PAMAM 덴드리머의 세대 2, 4, 6, 12 페 길화 된 PAMAM 덴드리머 (17)와 PEG-돌기 하이브리드 18. 별개의 덴드리머는 세포와 조직 (현지화, 독성, 투과성, 확산)와 다른 상호 작용을 보여으로 돌기 구조의 선택은 강하게 원하는 응용 프로그램 및 관심 시편에 관련이 있습니다. I)의 pH 지표와 내부 참조를 행동 II)의 pH를 구분하지 않는 부분 : 센서는 형광 염료의 두 ​​세트를 포함한다. Alth만이ough 지표와 참조의 큰 다양성은 최상의 결과를 형광 및 테트라 메틸로 얻...

형광 센서는 생명 과학에있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 합성하고 살아있는 세포 및 생체 내에서의 pH를 측정하는 덴드리머 계 형광 센서를 사용하는 방법을 설명한다. 수지상 발판이 개선 감지 특성에 이르는 복합 형광 염료의 특성을 향상시킨다.

합성, 세포 전달 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 덴드리머 기반 pH 센서의 응용 프로그램

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

다음 실험의 전반적인 목표는 살아있는 세포 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) pH 이미징을 위해 특성이 개선된 덴드리머 기반의 새로운 형광 센서를 개발하는 것입니다. 이를 위해 먼저 pH 민감성 염료를 표적화 그룹 또는 pH 비민감성 염료와 같은 다른 작용기와 함께 덴드리틱 스캐폴드에 결합합니다. 이후 pH 교정 곡선을 생성하기 위해 in vitro 측정을 수행하고, 살아있는 세포 내의 pH를 이미징합니다.센서는 전기천공법(electroporation)으로 전달되며, 뇌의 세포 외 공간 내 pH를 이미지화하기 위해 공초점 현미경을 사용하여 pH 맵을 생성합니다. 생리학적 및 병리학적 신경 활동 동안, 센서를 마취된 마우스의 뇌에 미세 주입합니다. 그 후 이광자 현미경을 사용하여 형광 데이터를 획득합니다.결과에 따르면 drimmer 기반 센서는 살아있는 세포와 생체 내 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 pH 변화를 성공적으로 측정하는 것으로 나타났습니다. pH 민감성 거동을 보이는 여러 형광 염료가 이미 사용되어 왔으나, 낮은 이동성과 세포 누출과 같은 몇 가지 단점이 있습니다. 또한, 이러한 염료들은 ratiometric 절대 측정을 가능하게 하지 않습니다.본 연구에서는 pH 민감성 염료를 DNA 유전적 스캐폴드에 결합시키는 방법을 입증하였으며, 이 방법은 높은 공간 및 시간 해상도로 정확한 측정이 가능하므로 살아있는 세포 내에서 pH에 의해 조절되는 생리적 및 병리적 과정을 연구하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 신경계의 pH 조절 장애는 뇌졸중 및 뇌전증과 같은 여러 질환과 관련이 있으며, 기존의 pH 센서들은 효과가 낮은 것으로 입증되어 본 연구의 센서를 설계하게 되었습니다. 비록 본 방법은 여기에서 pH 이미징에 적용되었으나, 이는 일반적인 접근 방식이므로 다른 생물학적 관련 종에도 적용 가능합니다.이익 감지 염료를 선택함으로써, 쉽고 다재다능한 합성 접근법을 통해 이러한 절차를 단순하게 만들 수 있습니다. 오늘 pH 지시약을 Piam Demers에 결합하는 절차를 시연할 분들은 Giovanni re, Barbara ti, Marco Brody, Sebastian Suli입니다. 우선 rimer를 무수 DMSO에 녹여 최종 농도가 50 µM이 되도록 합니다.마이크로 원심분리 튜브에 무수 DMSO를 사용하여 fluorescein NHS와 Tetraethyl RUMINE NHS(TMR로도 알려짐)의 10 µM 스톡 용액을 준비합니다. 1 mL의 g 4 peram dederer 용액에 fluorescein 8당량(40 µL)과 TMR 8당량(40 µL)을 혼합합니다. 혼합물의 몰비는 demer에 로딩되는 염료의 양을 나타냅니다. 용액을 실온에서 12시간 동안 교반합니다.다음으로, 혼합물을 탈이온수로 1:10 비율로 희석하고, 분자량 컷오프(molecular weight cutoff) 10 kilodaltons의 투석 막에 반응 혼합물을 넣습니다. 탈이온수로 투석하며, 24시간 동안 저장조의 물을 세 번 교체합니다. 다음 날, 용액을 유리 바이알로 옮겨 -80°C에서 몇 시간 동안 냉동합니다. 용액이 완전히 얼면, 바이알을 동결건조기에 옮겨 24시간 동안 동결건조합니다.보라색 분말을 얻어야 하며, 얻어진 고체를 mqe water에 용해합니다. 최종 농도는 10 µM이 되도록 합니다. 용액을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 50 µL씩 소분하여 담고, -20 °C에서 보관합니다.in vitro 보정을 위해, 쿼츠 Q-vet에 2 mM PBS 내의 500 nM D drummer 용액을 준비합니다. 적정 과정 중 pH의 급격한 변화를 방지하기 위해 매우 희석된 PBS 버퍼를 사용합니다. 플루오레세인(fluorescein)과 TMR의 방출 스펙트럼을 측정하고, 좋은 신호 대 잡음비를 얻도록 형광 분석기의 광학 설정을 최적화합니다.다음으로, 0.1 normal 수산화나트륨과 0.1 normal 염산을 소량씩 첨가하여 pH 적정을 수행합니다. 매 첨가 후에는 Q vet을 흔들어 혼합합니다. 평형 상태에 도달하도록 1분 동안 기다린 후 pH 미터를 사용하여 pH를 측정합니다.fluorescein과 TMR의 마이크로 전극 방출 스펙트럼은 매 단계마다 변경 없이 기록되어야 합니다. 광학 설정에서 형광 강도를 pH에 대해 도식화하십시오. 적정에 있어서, rod domine 신호는 pH의 영향을 받지 않아야 합니다.플루오레세인 신호는 시그모이드 곡선을 나타내어야 하며, 전기천공법(electroporation)에 대해 PK 값이 6.4인 단일 결합 모델로 피팅되어야 합니다. 72 µL에 현탁된 HeLa 세포 6 × 10⁵개를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 2 µM 농도의 dendri 또는 수성 용액을 추가하고, 전기천공용 튜브에 3 mL의 전기천공 버퍼를 추가합니다.그런 다음 10 µL 전기천공 팁을 사용하여 세포와 프라이머 혼합액을 흡입합니다. 다음으로 마이크로 피펫을 피펫 스테이션에 삽입하고 전기천공 펄스 조건을 설정합니다. 펄스 전압은 1005 V로 설정합니다.펄스 폭은 35 milliseconds로 설정하고, 펄스 플레이트 이후의 펄스 수는 2회로 설정합니다. 전기천공된 세포 20 µL를 항생제가 없는 신선한 배지가 담긴 유리 바닥 디시에 분주합니다. 전기천공 12시간 후에 플루오레세인(fluorescein) 및 로다민(rhodamine)용 표준 필터 세트를 사용하여 공초점 현미경으로 세포를 촬영합니다.시료에 초점을 맞추고 레이저 출력과 검출기 게인을 조절하여 신호 대 잡음비를 최대화하십시오. 전기천공법이 성공했다면, 세포들은 두 채널 모두에서 밝은 형광을 띠어야 합니다. 국소화 정도는 사용된 D의 크기와 전하에 따라 달라집니다. 흔히.작은 핵 주변 소포로 관찰되는 Sun의 리소좀 국소화는 엔도사이토시스(endocytosis) 또는 공동 구획화로 인해 발생합니다. 대부분의 형광이 소포 내부에 국소화되고 기공 신호가 세포질에서 관찰되어 리소좀 국소화가 지배적인 경우, 이는 독성을 의미하므로 해당 측정값은 폐기해야 합니다.두 채널을 순차적으로 획득하고, 여러 장의 이미지를 획득한 후 이를 평균하여 이미지 품질을 향상시킵니다. pH 교정 곡선을 생성하려면, 세포 내 및 세포 외 pH를 동일한 값으로 고정시키기 위해 서로 다른 pH의 opfor 버퍼를 사용하십시오. pH당 최소 20개의 세포 이미지를 획득하고, pH 5.5에서 pH 7.5까지 최소 5개 지점을 측정하십시오.pH B six는 세포에 독성을 나타내지만 짧은 시간 동안은 견딜 수 있으므로, 가능한 한 짧은 시간 내에 이미지를 획득하십시오. 만약 세포 사멸(apoptosis)의 징후가 보이면, 해당 세포를 폐기하고 다시 시작하십시오. 이미지 획득 후의 과정은 다음과 같습니다.데이터 분석을 위해 Image J 또는 유사한 소프트웨어를 사용하십시오. 먼저, 녹색 대 적색 비율을 결정하십시오. 그 다음, 해당 비율을 pH에 대해 도식화하여 추후 실험에서 비율을 pH로 변환하는 데 사용할 수 있는 검정 곡선(calibration curve)을 생성하는 선형 추세를 도출하십시오.in vivo 시료 준비를 위해, 생후 28일에서 70일 사이의 C 57 black six J 암컷 마우스를 준비합니다. 우레탄으로 마우스를 마취한 후, 발가락 꼬집기 테스트를 통해 동물이 완전히 마취되었는지 확인하고 안연고를 도포하여 피질 스트레스 반응과 뇌부종을 줄입니다. 수술 중에 덱사메타손 소듐 포스페이트 2 mg/kg(체중당)를 근육 내로 주입합니다.다음으로, 수술용 가위를 사용하여 동물의 머리를 삭모한 후, 수술용 드레이프를 덮고 두피에 2.5% lidocaine 겔을 도포합니다. 가위를 사용하여 양측 뇌반구의 두개골을 덮고 있는 피부 플랩을 절개합니다. 노출된 뼈를 식염수로 세척하고, 포셉을 사용하여 골막을 조심스럽게 제거합니다.이렇게 하면 접착 표면이 더욱 개선됩니다. 접착제와 치과용 시멘트를 사용하여, 중앙에 이미징 챔버가 있는 맞춤 제작된 스틸 헤드 포스트를 시아노아크릴레이트로 접착하여 피질 관심 영역 위의 두개골과 거의 평행하게 고정합니다. 그 후 화이트 치과용 시멘트로 포스트를 고정합니다.마우스의 머리를 고정하고, 관심 영역 위를 드릴링하여 지름 2~3 mm의 두개골 절개술(craniotomy)을 수행합니다. 드릴링 과정 전반에 걸쳐 주사기를 사용하여 두개골에 신선하고 멸균된 A CSF를 수시로 도포함으로써 수술 중 피질의 가열을 최소화합니다. 두개골 절개술 후, 대물렌즈 아래에서 머리가 움직이지 않도록 동물을 이미징 스테이지로 옮깁니다.이미징 챔버를 조절 가능한 포스트에 나사로 고정합니다. 산소가 연결된 맞춤 제작 플라스틱 마즐을 씌웁니다. 이는 실험 중에 산소가 풍부한 공기를 공급하여 동물의 호흡을 돕기 위함입니다.뇌 피질에 센서를 주입하려면, 팁 직경이 4 µm인 유리 피펫과 염화은 전극을 준비합니다. 1 µM drimmer ER 용액을 사용하면, 마이크로주입 장치를 통해 세포외 전위 기록이 가능해집니다. 피펫을 피질의 약 150 µm 깊이까지 삽입하십시오.이미징을 위한 광학 설정을 최적화하기 위해 0.5 pounds per square inch의 압력으로 1~2분 동안 주입합니다. 광퇴색 및 광손상을 최소화하도록 레이저 출력을 조정합니다. 일반적으로 사용되는 레이저 출력은 약 20 milliwatts이며, PMT gain은 667 volts로 일정하게 유지합니다.레이저 파장을 820 nanometers로 설정하여 센서를 여기시키고, 표준 FTSE 및 trit 필터를 통해 플루오레세인(fluorescein)과 로드 도민(rod domine) 형광을 동시에 검출하도록 소프트웨어를 설정하십시오. 또한, 배경 보정을 위해 획득 빈도를 2 hertz의 프레임 속도로 설정하십시오. PMT와 페데스탈(pedestal)에서 발생하는 평균 열잡음을 측정하기 위해 레이저 셔터를 닫은 상태에서 다크 프레임을 획득하십시오.마지막으로, pH 의존적 형광 이미지를 획득하여 이후 분석을 위해 저장합니다. 이전과 동일하게 데이터를 분석하여 fluorescein 및 rumine의 in vitro 거동을 평가합니다. rimer에 로딩한 후, 형광 광도계를 사용하여 pH 적정을 수행하였습니다.이 그림은 pH 센서의 전형적인 적정 곡선을 보여줍니다. 플루오레세인(Fluorescein)과 루민(rumine)은 각각 488 nm와 550 nm에서 개별적으로 여기될 수 있으며, 이를 통해 두 채널 간의 상호 간섭(crosstalk)을 최소화할 수 있음이 명확히 나타납니다. 플루오레세인은 pH 의존적 거동을 보이는 반면, 루민 신호는 생리적 pH 범위 내에서 유의미하게 변화하지 않습니다.따라서 이 두 신호의 비율은 센서 농도에 의존하지 않고 오직 pH에 의해서만 결정됩니다. 지시약을 세포 내로 전달하기 위해 HeLa 세포에 dederer 센서를 전기천공법으로 도입하였으며, 본 영상에서 설명한 대로 공초점 이미징을 수행하였습니다. 이 공초점 이미지들은 왼쪽의 플루오레세인 채널, 중앙의 R domine 채널, 그리고 오른쪽의 pH 비율 측정 맵으로 표시된 세포의 모습을 보여줍니다.강한 fluorescein 및 rhodamine 신호가 관찰되며, 이들이 공국소화(co-localize)되는 것은 센서 구조의 무결성을 입증합니다. 두 이미지를 픽셀 단위로 나누어 ratiometric 맵을 재구성하고, 이를 의사 색상 척도로 나타냅니다. 세포 내 센서 반응을 보정하기 위해, 여기에서 보여주는 바와 같이 이온ophores를 이용한 pH 클램핑을 수행하였습니다.지시약은 녹색과 적색의 비율 변화를 통해 pH에 민감하게 반응합니다. 결과 데이터를 사용하여 정확한 pH 측정을 위한 검정 곡선을 생성하였습니다. 검정 곡선의 선형적 추세는 세포 환경의 방해 없이 pH에 반응하는 센서의 능력을 보여줍니다.덴드리 기반 센서를 생체 내(in vivo) 이미징에 어떻게 활용할 수 있는지 보여주기 위해, dendri를 주입한 마취 상태의 생쥐 뇌에서 pH 이미징을 수행하였습니다. 820 nm 여기 파장을 사용하여 플루오레세인(fluorescein)과 로다민(rhodamine) 신호를 동시에 얻었으며, 살아있는 세포 측정과 유사하게 픽셀 단위로 비율 맵(ratio map)을 작성하였습니다. 특히, 지시약은 세포 외 공간에 국한되며, 이미지에서 형광이 나타나지 않는 영역은 세포체나 미세 혈관으로, 이를 통해 pH에 대한 센서의 반응을 검증하였습니다.우리는 고탄산혈증(hypercapnea)을 이용하였습니다. 실제로 이산화탄소는 혈액과 조직 내 탄산염 완충제의 평형을 변화시켜 조직의 산성화를 유도하는 것으로 알려져 있습니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, 30% 이산화탄소를 흡입하는 것만으로도 센서의 강한 반응을 유도하기에 충분하며, 이는 마우스에 다시 환기를 실시했을 때 완전히 가역적으로 회복됩니다.이러한 결과는 살아있는 세포 및 생체 내(in vivo)에서 pH의 생리적 및 병리적 변화를 강조하는 데 있어 오퍼 기반 센서의 잠재력을 입증합니다. 또한, 본 절차는 전기생리학적 기록과 같은 다른 측정 방법과 호환됩니다. 이를 통해 진행 중인 생물학적 과정에 대한 상호 보완적인 정보를 동시에 얻을 수 있었습니다.이 방법은 개발 이후 세포 생물학 및 신경 생물학 연구자들이 배양 세포 및 생체 내에서 pH 조절 프로세스를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

우리는 인광 담금질 및 생물 학적 시스템에서 산소 이미징을위한 포르피린 기반 돌기 nanosensors의 검토 설계에 의해 산소 측정의 원칙을 제시.

생물 학적 시스템에서 산소 이미징에 대한 인광을 발하는 나노 프로브의 합성 및 교정

이 문서에서는 세부 멀티 플렉스 microneedle 기반 센서의 건설. 장치는 신속하고 선택적으로 여러 analytes의 현장 샘플링과 전기 화학 분석을 위해 개발되고있다. 우리는 임상 의학을 구상하고 생명 의학 연구는 이러한 microneedle 기반의 센서를 위해 사용합니다.

다중 Transdermal 전기 감지를위한 빈 Microneedle 기반 센서

생체의 pH 응답 졸 - 겔 나노 센서는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 지지체에 혼입 될 수있다. 생성 된 자기보고 지지체는 지지체에 세포를 배양하는 동안 미세 환경 조건 인 시츄 모니터링에 사용될 수있다. 3D 셀룰러 구조는 실험을 방해하지 않고 실시간으로 모니터링 할 수있는 이는 유익하다.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

페로센의 비대칭 종의 합성은 용액 기술을 사용하여 어렵습니다.  이 보고서는 고체상 합성을 통해 수행된 용이하고 깨끗한 반응을 사용하여 페로센-비오틴 생체접합체를 생성하기 위해 수행된 방법에 중점을 둡니다.  티올레이트 부분의 혼입은 금 표면에 고정화(immobilization)를 위한 능력을 부여하기 위해 보여진다.

고상 수지 기반의 방법론을 통해 비대칭 페로센 유래 바이오 복합체 시스템 용 합성 방법론

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준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자기 공명 영상에 대한 덴드리머 기반 대조 대리인의 특성

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받는 dendrimer 기반 고르지 nanopatterns 로컬 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD) 표면 밀도의 나노 제어를 허용 하는 방법은 설명 하 고 세포 접착 및 chondrogenic 분화의 연구에 대 한 적용.

로컬 컨트롤 표면 점착을 고르지 Nanopatterns Dendrimer 기반: Chondrogenic 차별화 하는 방법

여기, 선물이 커패시턴스 바이오 센서와 함께에서 각 인 분자를 사용 하 여 복잡 한 솔루션에서 검색 및 낮은 풍부한 분자의 정량화에 대 한 프로토콜.

분자 각 인을 사용 하 여 생체의 磁 검출 용량 성 바이오 센서 기반

DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸친 상대적 시냅스 (시냅스 전 및 시냅스 후 참여) 수의 변화를 측정하는 편향되지 않은 신속한 형광 분석법입니다. 이 기술은 배양된 뉴런 및 고정 조직 모두에서 사용될 수 있는 근접 라이게이션 기술을 이용한다.

DetectSyn: Synapse 밀도의 변화를 감지하는 빠르고 편향되지 않은 형광 방법

이 프로토콜은 종양 관련 단백질 분해 효소 활성의 생체 외 분석을 통해 현장 암 진단을 가능하게 하는 CRISPR-Cas 매개 다중 분석물 합성 소변 바이오마커 검사에 대해 설명합니다.

휴대용 진단을 위한 CRISPR-Cas 매개 다중분석물 합성 소변 바이오마커 검사

본 연구는 연구자들이 마이크로몰딩이라고도 불리는 용매 주조법을 사용해 자체 DMAP 장치를 준비하고 기본적인 특성 분석을 수행할 수 있도록 실용적인 가이드 역할을 하는 것을 목표로 합니다.

용매 주조 기법으로 제조된 용해형 마이크로니들 어레이 패치와 마이크로니들 기반 생체의학적 장치의 필수 특성 분석

배우세요 덴드리머 기반 형광 pH 센서 합성 및 세포 전달 방법을 통해 생체 내 pH 이미징을 수행하는 기술입니다. 이 방법은 신경과학 및 세포 생물학 연구에서 pH 변화를 정밀 측정하는 데 활용됩니다.

합성, 세포 전달 및

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