Name: 혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색 생체 내 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 배우세요 신생아 마우스 망막의 혈관신생을 연구하는 전체 마운트 면역형광 염색법을. 이 방법은 형광 염색과 공초점 현미경을 활용하여 망막 혈관망을 시각화하고, 혈관 발달 메커니즘 및 유전자·약물 효과를 분석하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 Wellcome 트러스트와 영국 심장 재단에 의해 후원되었다.

달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 상온에서 수행됩니다. 1. 출생 후의 눈의 안구 적출술 및 고정 <ol><li> 옆에 강아지 인도적 사망 마우스를 놓고 가위로 눈을 덮고있는 피부를 제거합니다. </li><li> 눈을 명백히 가위와 집게를 사용합니다. </li><li> 탈핵 눈 아래 장소 가위는 시신경과 주변 조직을 잘라 눈을 밖으로 들어 올립니다. 실온에서 2 배 PBS에서 만든 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 포함하는 24 - 웰 플레이트에 전송할 수 있습니다. </li><li> 각각의 눈은 10 수정 할 수 있습니다 - 10 분 - 15 분 후, 5 얼음 차가운 배 PBS로 전송할 수 있습니다. 그것은 고정의 정도가 각각의 눈에 대한 동일한지 확인 enucleations 및 후속 고정을 엇갈리게하는 것이 좋습니다. </li></ol> 2. 출생 쥐과 망막의 해부 <ol><li> 2X PBS를 포함하는 페트리 접시에 전송 눈들이 상자 아래에 구멍과 장소를 넓혀 절단 된 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여현미경을 cting. </li><li> 집게와 가위를 사용하여 눈 주위 모든 지방을 제거합니다. </li><li> 피어스 날카로운 가위로 각막의 가장자리와 각막과 홍채 및 폐기 주위를 잘라. </li><li> 망막과 공막 사이에 집게를 삽입하고 망막을 찢어지지 않도록주의하면서 공막를 제거합니다. 맥락막 층도 제거 할 수 있지만,이 단계에서 발생하는 망막 손상의 위험이있을 경우, 맥락막 층은 크게 면역 염색의 품질에 영향을 미치지 않아야로에 남아있을 수 있습니다. </li><li> 렌즈와 집게를 사용하여 유리체 유머를 제거합니다. </li><li> 미세 집게로 눈의 중앙에 그들을 함께 수집하여 hyaloids 혈관을 제거 후 신속하게 망막의 중심 (또는 미세 가위로 유리체 혈관의 기지에서 싹둑)에서 멀리 당기십시오. </li><li> 깨끗한 페트리 접시에서 PBS와 컵 모양의 망막을 씻어. </li><li> 봄 scisso를 사용하여 망막의 반지름의 약 2 / 3에 도달 4 ~ 5 방사상 절개를 만들기RS는 &#39;꽃잎&#39;모양을 만들 수 있습니다. </li><li> PBS는 망막을 평평하게 파스퇴르 피펫을 사용하고 흡수성 종이의 작은 조각으로 초과 PBS를 제거 꺼립니다. </li><li> 천천히 피펫 추위 (-20 ° C) 망막의 표면에 놓기로 메탄올 드롭 완전히 추가 메탄올로 다음 홍수 덮여 때까지. 이 망막을 고정하고 permeabilization을 용이하게하는 데 도움이됩니다. 망막은 흰색으로 바뀝니다. </li><li> 구멍을 넓혀 절단 된 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 2 ㎖ 튜브에 옮긴다. </li><li> 면역 염색을 진행하기 전에 적어도 20 분 동안 차가운 메탄올 망막을 남겨주세요. 여기에 사용 된 항체의 단지 VE-cadherin의 메탄올 고정 망막에서 성공적으로 사용할 수 없습니다. 이 경우 망막 9 단계 후 면역 염색으로 바로 진행해야합니다. </li><li> 필요한 경우 최대 전에 염색을 몇 개월에 대해, 망막은 -20 ° C에서 메탄올에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 면역 / 망막 Vascu의 isolectin 염색lature <ol><li> 조심스럽게 제거 / 메탄올을 넣어 부드럽게 (이 단계에서 망막 위의 단계 11에서 동일한 2 ㎖ 튜브에 아직도있다) PBS에서 간단히 망막을 씻어. </li><li> 파마 / 차단 솔루션을 100 μL와 PBS와 커버 망막을 제거 (PBS + 0.3 % 트리톤 + 0.2 % BSA) + 5 적절한 혈청 % (표 1 참조), 1 시간 동안 가볍게 흔 듭니다. </li><li> 부드러운 4에서 하룻밤 흔들어 ° C 100 선택한 기본 항체의 μL (표 1 참조) 및 / 또는 IsolectinB4, 파마 / 블록에 희석하여 준비 모두와 함께와 망막을 차단하고 배양 / 파마 제거합니다. </li><li> 항체 / isolectin를 제거하고 망막 4 씻어 PBS에서 x 10 분 + 0.3 % 트리톤 (PBSTX). </li><li> 어떤 경우에는, IsolectinB4-Alexa488 또는 직접 복합 일차 항체로 예를 들면 다음과 염색, 이차 항체는 필요하지 않습니다 및 망막 (7 단계)에 직접 장착 할 수 있습니다. 접합 일차 항체은 해당 플 루어 100 μL 다음 3 단계에서 사용되었을 때escent 이차 항체 (PBSTX에서 1 / 200 희석)을 첨가하고 4 ℃ 실온에서 4 시간 동안 밤새 품어 남아 있습니다. </li><li> 이차 항체를 제거하고 2 ㎖ PBSTX에서 망막 4 X 15 분 씻으십시오. </li><li> 넓은 구멍 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이드에 망막을 전송하고 흡수성 티슈로 여분의 PBSTX를 제거합니다. 50 μl를 추가하여 마운트 망막은 망막에 coverslip을 부드럽게 위치에 mountant을 연장. </li><li> 전송 그들은 연장 mountant 설정 할 수 있도록 평평하고 빛으로부터 보호 될 수 있도록, 4 ° C에서 하룻밤 냉장고에 슬라이드. </li><li> 이미지 망막 공 촛점 현미경 또는 epifluorescence에 현미경을 사용. </li></ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li>
<li>Staton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+assaying+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).</li>
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<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 제시된 방법은 혈관의 쉽게 정량화 및 생리학 관련 모델을 만들고, 신생아 마우스 망막의 스테인드 전체 마운트 준비의 이미지를 얻을 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 처음에는 마우스 아이는 작은 크기와 지구본 모양으로 인해 해부하는 것은 매우 어려울 수 있습니다, 연습과 좋은 해부 도구는 신뢰할 수있는 결과를 위해 필요하므로. 이 눈에서 물 손실 소량의 원인과 절개를 용이하게 내부 궤도 압력을 줄일 수 있기 때문에 PBS의 2 배 농도에서 제조 된 눈의 해부 중요하다. 망막의 좋은 준비는 여러 가지 이유로 중요합니다. 첫째는 혈관의 무결성을 유지합니다. 유리체의 혈관이 잘 제거되지 않은 경우 둘째, 배경의 높은 수준에 이르는, 항체 염색법의 효율성을 줄이고 해상도를 감소. 망막의 PFA 고정 시간이 너무 긴 경우이 문제가 발생할 수 있습니다. 하지만,이전의 염색에, -20 ° C의 냉동고에 메탄올 몇 개월 장기 저장을 위로 이전 isolectin 염색을 표 1에 항체 가장 적합합니...

혈관 신생은 기존의 혈관 네트워크에서 새로운 혈관의 형성에 의해 정의 된 여러 신호 전달 경로에 의해 조절되는 복잡한 발달 과정입니다. 이들 중 가장 눈에 띄는 VEGF 경로입니다. VEGF는 주변 혈관의 싹이 혈관의 개시에 허혈성 세포와 리드에 의해 발표된다. 새싹 새 혈관에서 선도적 인 내피 세포는 VEGF의 근원을 향해 밖으로 도달하는 filopodia를 생산하는 &#39;팁&#39;세포이며, &#39;줄기&#39;내피 세포 증식옵니다. 이러한 방법으로, 활성화 된 내피 세포는 마이그레이션하고 새로운 혈관 튜브를 형성하는 곳 무혈성 지역으로 확산. 혈액의 흐름을 지원하기 위해 이러한 튜브를 안정화하기 위해, 내피 세포는 혈관 주위 세포와 새로운 혈관 1 서라운드 평활근 세포와 상호 작용합니다. 혈관은 태아 성장 조직의 혈관을 위해 필수적이다. 그러나, 그것은 또한 많은 pathologi에 기여암과 같은 칼 장애, 혈관의 결함은 허혈성 질환과 관련된 반면. 질병을 치료하는 수단으로 혈관 신생을 조절하는 효과적인 약물 치료의 개발은 큰 관심을 따라서이다. 예를 들어, 효과적인 안티 - 혈관 요인은 암의 성장을 줄일 프로 혈관 전략 허혈성 질환을 치료하는 데 사용할 수있는 반면됩니다. 따라서, 혈관의 모델은 더 나은 새로운 혈관 형성과 혈관 성장을 강화하거나 줄일 수있는 새로운 치료 전략을 개발하기위한 규정을 이해하는 것이 필수적입니다. 혈관 연구의 기본적인 요소는 적절한 혈관 모델의 선택입니다. 체외 모델의 대부분은 이러한 내피 세포의 이동, 증식과 생존 2,3 등 혈관의 기본 단계를 재현하기 위해 설계되었습니다. 자주 생체 분석에 사용되는이 있지만 t, 리겔 행렬에 내피 세포의 분기 네트워크의 형성이다자신은 내피 세포의 특정 아니며, 일반적으로 혈관 주위 세포 나 평활근 세포의 지원을 통합 않습니다. 이러한 배아 신체 분석, 대동맥 링 분석 및 태아 중족골 분석으로 마우스 오르간 문화를 사용하여 전직 생체 돋아 혈관의 평가는 추가 지원 세포의 맥락에서 내피 세포의 혈관 신생의 분석을 할 수 있습니다. 그러나 이러한 분석의 주요 한계 분석을 위해 제한된 창을주고, 혈액 흐름의 부족으로 시간이 지남에 혈관의 회귀 (가) 있습니다. 따라서, 더 정확하게 혈관 신생의 조절을 이해하고, 생체 내 모델뿐만 아니라 뒷다리 허혈 모델로, 같은 피하 이식 스폰지 또는 Matrigel의 플러그를 사용하여 마우스를 개발 한 것과 필요합니다. 그러나 이러한 모델은 neovessels의 복잡한 3 차원 구조에 의한 분석하기 위해 도전하고 있습니다. 반면에, 제브라 피쉬 배아 전체에 시각화 혈관을위한 훌륭한 모델을 입증했다생물 4. 그러나 마우스는 마우스 많은 경우에 선호하는 모델을 만들고, 진화 훨씬 더 밀접하게 제브라보다 인간에 관한 것입니다. 따라서 출생 후 마우스 망막의 혈관은 혈관 연구를위한 선택의 잘 특성화 방법을 나타냅니다. 그것은 생리적 설정뿐만 아니라 쉽게 적절한 형광 얼룩을 사용하여 시각화 할 수있는 2D 혈관 얼기도 제공한다. 혈관 네트워크 내피 세포 증식, 발아​​, 혈관 주위 세포의 모집 및 혈관 리모델링의 구조는이 모든 기술을 사용하여 조사 할 수 있습니다. 신생아 마우스 망막, 망막 혈관의 발달은 출생 인생의 첫 주에 발생합니다. 마우스는 인간과는 달리, 블라인드 태어나 망막은 출생 후 혈관됩니다. 망막 혈관이 출생 후의 일 0 (P0)에서 시신경 망막 주변의 중앙에서 발생하고, 매우 조직 형성하는 혈관에 의해 개발약 P8 5에 의해 망막 주변부에 도달 D 혈관 신경 얼기. 혈관은 모세 혈관 따위가 점차 개입 모세관 네트워크 동맥과 정맥의 정기 교류 패턴을 생성하는 주변을 향해 광학 디스크에서 바깥쪽으로 성장 특성 방식으로 개발할 수 있습니다. 망막 혈관 따라서 비교적 쉽게 평면 마운트 준비 5 망막 혈관을 검사하고, 그들은 본질적으로 2D 평면 무엇에 성장 혈관이 쉽게 식별 할 수있는 혈관을 연구하는 이상적인 모델을 제공합니다. 몇 시간 전 생체에 내피 팁 세포 반응의 분석을 위해 마우스 신생아 망막을 분리하는 방법은 6보고되었습니다. 또한, 전체 망막 혈관과 관련 혈관 마커에 대한 자세한 조사 개발의 다른 단계에서 고정 망막 표본의 면역 염색이 필요합니다. 여기에 우리가 제공하는우리는 현미경으로 최종 이미지에 얼룩 프로토콜을 통해 (도 7 참조) 출생 후 아이의 초기 적출술에서 쥐 망막 혈관 신경 얼기의 전체 마운트 염색에 사용하는 신뢰할 수 있고 기술적으로 곧장 앞으로 방법에 대한 자세한 설명.

<table><tbody><tr><td colspan = "4 ">< 강한> 재질 < / 강></td></tr> <tr><td>플라스틱 피펫 3 ml</td><td>과학 실험실 용품</td><td>PIP4210</td><td>가위로 팁을 제거하여 넓은 구멍을 만듭니다</td></tr>. <tr><td>BD Falcon 24 웰 플레이트</td><td>과학 실험실 용품</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 TV 90mm</td><td>과학 실험실 용품</td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>Histobond 슬라이드</td><td>VWR</td><td>631-0624</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립 22 x 22 mm</td><td>VWR</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 핀셋 # 5</td><td>세계 정밀 기기</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위 길이 10.5cm, 직선 8mm 블레이드 세계</td><td>정밀 기기</td><td>501235</td><td>적출에 사용</td></tr><tr><td>Vannas 가위 길이 8.5cm, 직선 7mm 블레이드 및 0.025 x 0.015mm 극상 팁</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500086</td><td>8cm</td></tr><tr><td>길이의 직선 3mm 블레이드와 0.015 x 0.015 mm 극세 팁이 있는 초미세 반나 가위를</td> 해부하는 데 사용됩니다. <td>세계 정밀 기기</td><td>501778</td> 망막 크리스탈 클리어<td>를 해부하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>&#8217; 튜브 2 ml</td><td>Starlab</td><td>E1420-2000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Sodium phosphate 이염기성</td><td>시그마</td><td>S0876</td><td>PBS 시약</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td>성 <td>시그마</td><td>P5655</td><td>PBS 시약</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S9625</td><td>PBS 시약</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td>2x PBS로 구성하고 -20 &#176에서 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A7638</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 혈청</td><td>시그마</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>벡터</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 퇴색 방지 시약</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>장착 시약</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4-alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>사용 1:200 희석</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4-alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td>1:200 희석</td></tr><tr>에서 사용<td colspan="4">Primary Antibodies</td></tr><tr><td>Anti-NG2 (rabbit polyclonal)</td> <td>Millipore</td><td>AB5320</td><td>pericytes</td></tr><tr><td>Detection Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal)</td><td>Millipore</td><td>MAB360</td><td>Detect astrocytes</td></tr><tr><td>Anti-Desmin (clone Y66, </td><td>Millipore</td><td>04-585</td><td>주피세포 검출</td></tr><tr><td>Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal )</td><td>Chemicon</td><td>AB756P</td><td>혈관 기저막</td></tr><tr><td>검출 안티알파 평활근 actin-Cy3 (클론 1A4, 마우스 단클론)</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>혈관 평활근 세포를 검출합니다.</td></tr><tr><td>Anti-Endoglin (클론 MJ7/18, 쥐 단클론)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550546</td><td>내피 세포 검출</td></tr><tr><td>Anti-CD31 (클론 MEC13.3, 쥐 모노클론)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>내피 세포</td></tr><tr><td>검출 Anti-VE-Cadherin (클론 11D4.1, 쥐 모노클로날)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550548</td><td>내피 세포 접합</td></tr><tr><td>검출 Anti-Alk1 (염소 다클론)</td><td>R& D Systems</td><td>AF770</td><td>내피 세포</td></tr><tr> 검출<td colspan="4">Secondary Antibodies</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>모든 2차 항체는 도착 즉시 분주되어 -20 &#176;C에 보관됩니다.</td></tr><tr><td>Goat anti-rat-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>모든 2차 항체는 도착 즉시 분주되어 -20 &#176;C에 보관됩니다.</td></tr><tr><td>Goat anti-rat-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td>모든 2차 항체는 도착 즉시 분주되어 -20 &#176;C에 보관됩니다.</td></tr><tr><td>염소 안티-마우스-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>모든 2차 항체는 도착 즉시 분주되어 -20 &#176;C에 보관됩니다.</td></tr><tr><td>당나귀 anti-goat-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11058</td><td>모든 2차 항체는 도착 즉시 분주되어 -20 &#176;C에 보관됩니다.</td></tr><tr><td colspan = "4 ">< 강한> 현미경 </ 강></td></tr> <tr><td>해부 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam HRc</td><td>카메라 해부 현미경</td></tr><tr><td>용 Epifluorescent 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axioimager Apotome</td><td></td>카메라가있는 Zeiss</tr><tr><td></td><td></td><td>Axiocam HRm</td><td>카메라 Axioimager</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>니콘</td><td>A1R</td><td></td></tr></tbody></table>

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

혈관 신생은 기존의 혈관 네트워크에서 새로운 혈관의 발아에 의해 정의 된 새로운 혈관 형성의 복잡한 과정이다. 혈관 신생은 암, 실명 및 허혈성 질환 등의 혈관 형성 dysregulated되는 많은 질병, 또한뿐만 아니라 장기 및 조직의 정상적인 발달에 중요한 역할을하지만. 혈관 질병에 특히 새로운 혈관 형성을 시도하고 조절하는 새로운 약물 개발을위한 중요한 목표 그래서 성인 생활에, 혈관은 일반적으로 정지합니다. 더 나은 혈관을 이해하고이를 조절하는 적절한 전략을 개발하기 위해 모델은 정확하게 관련된 다른 생물학적 단계를 반영해야합니다. 동맥, 정맥 및 모세 혈관이 출생 후 첫 주 동안 혈관 신경 얼기를 형성하기 위해 개발 때문에 마우스 신생아 망막 혈관의 훌륭한 모델을 제공합니다. 또한이 모델은 두 디를 갖는 장점이있다mensional (2D) 구조는 다른 혈관 네트워크의 복잡한 3D 해부학에 비해 간단하게 분석을하고. 출생 후 다른 시간에 망막 혈관 신경 얼기를 분석하여, 그것은 현미경으로 혈관의 여러 단계를 관찰 할 수 있습니다. 이 문서 isolectin 혈관 특정 항체와 형광 염색법을 사용하여 마우스 망막의 혈관을 분석 간단한 절차를 보여줍니다.

절개 후 망막 평면 꽃 (그림 1)과 같다. 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 내피 세포는 안티 - 알파 평활근 액틴 (그림 2)를 사용하여 시각화하는 isolectin B4-Alexa488 염색을 사용하여 혈관 근육 세포를 지원 볼 수 있습니다. 그림 2에서 5 배 목표를 사용하여 저전력보기는 망막의 혈관 조직의 개요를 할 수 있습니다. 또한, 위의 프로토콜에 주어진 항체의 다른 조합을 사용하여, 내피 세포는 항-CD31 면역 염색 및 지원 혈관 주위 세포가 NG2 (그림 3) 또는 최근 desmin (그림 4)에 대한 항체를 사용하여 볼 수를 사용하여 볼 수 있습니다. 반대로 최근 desmin 염색은 혈관 주위 세포의 과정처럼 손가락을 시각화하고 밀접 내피 세포와 연결되어 있는지 여부를 확인하는 데 유용합니다. 반면에, 반대로 NG2 염색 할 때 유용합니다, 각 혈관 주위 ...

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을 제공합니다<em&gt; 생체 내</em&gt; 컨텍스트. 정확하게 혈관 신경 얼기를 시각화하는 면역 형광 염색 연구의 이러한 유형의 성공에 필수적이다.

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 신생 마우스 망막의 혈관 신생을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 생후 마우스의 안구를 적출하고 고정액을 처리함으로써 수행됩니다. 세 번째 단계는 생후 마우스 망막을 조심스럽게 꽃잎 모양으로 절개하는 것이며, 마지막 단계는 망막 혈관을 염색하는 것입니다. 최종적으로, 형광 염색과 공초점 현미경을 통해 마우스 망막 혈관의 시각화가 이루어집니다.본 절차의 시연은 제 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Simon Tlo와 이전 연구실 구성원이었던 Kathleen Allenson이 진행하겠습니다. 본 절차 전 과정에서 기본 온도는 상온입니다. 인도적인 방법으로 안락사시킨 생쥐 새끼를 가위와 함께 옆으로 눕히는 것으로 시작하십시오.눈을 덮고 있는 피부를 제거합니다. 다음으로, 가위를 눈 아래쪽에 위치시킨 후 시신경과 주변 조직을 절단하여 눈을 들어 올립니다. 적출된 눈을 고정액인 2배 농도의 4% PFA가 들어 있는 24-웰 플레이트로 옮깁니다.한쪽 눈이 고정액에 담겨 있는 동안 다음 눈의 해부를 진행하여 PBS 처리를 합니다. 두 눈의 해부 간격은 30초가 됩니다. 이는 숙련도에 따라 달라질 수 있습니다.각 안구를 10분에서 15분 동안 고정합니다. 그런 다음 얼음 위에 둔 차가운 2배 PBS로 옮겨 최소 5분에서 10분 동안 유지합니다. 망막을 분리하기 전, 입구 부분을 넓게 자른 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 원하는 만큼의 안구를 PBS로 수집합니다.해부 현미경 하에서 안구를 2배 PBS가 담긴 페트리 접시에 옮깁니다. 핀셋과 가위를 사용하여 안구 주변의 지방을 제거합니다. 날카로운 가위로 각막 가장자리를 뚫고 각막과 홍채 주변을 절개하여 해당 조직들을 폐기합니다.다음으로, 핀셋을 망막과 공막 사이에 삽입합니다. 망막이 찢어지지 않도록 주의하며 공막을 제거합니다. 망막을 손상시킬 위험이 없다면 맥락막 층 또한 제거할 수 있습니다.맥락막 층을 그대로 두어도 면역 염색의 품질에 큰 영향을 미치지는 않습니다. 이제 핀셋을 사용하여 수정체와 유리체를 제거하십시오. 이어서 맥락막 혈관을 제거합니다.미세 핀셋을 사용하여 그것들을 안구 중앙으로 모읍니다. 그런 다음 망막 중심에서 빠르게 끌어당겨 제거합니다. 노란색 가시(yellow thistle)가 남아 있으면 결과 확인을 방해할 수 있으므로, 이를 모두 제거하는 데 각별히 주의하십시오.컵 모양의 망막을 깨끗한 페트리 접시로 옮긴 후 PBS로 깨끗이 헹굽니다. 이제 망막의 중심부를 향해 약 3분의 2 지점까지 도달하도록 4~5개의 방사형 절개를 넣습니다.스프링 가위를 사용하여 페달 모양의 망막을 만듭니다. 이 단계는 숙달되기까지 인내심과 연습이 필요합니다. 이제 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS의 대부분을 뽑아냅니다.이렇게 하면 망막이 평평해집니다. 그다음 작은 흡수지 조각을 사용하여 과잉의 PBS를 제거합니다. 이어서 망막 표면에 -20 °C 메탄올을 한 방울씩 떨어뜨려 망막이 거의 잠길 때까지 적용한 후, 메탄올을 충분히 추가합니다.망막이 하얗게 변할 것입니다. 이 단계는 망막을 고정하는 데 도움이 되며 투과성을 높여줍니다. 차가운 메탄올에 담긴 망막을 작은 튜브로 옮기십시오.광구 플라스틱 피펫을 사용하십시오. 필요에 따라 차가운 메탄올에서 최소 20분 동안 배양하십시오. 망막은 -20 °C의 메탄올 내에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 여기서는 이 항체만을 사용합니다.모체 고정 망막에는 시네(cine) 촬영을 성공적으로 사용할 수 없습니다. 이 경우, 망막을 꽃잎 모양으로 평평하게 편 후 즉시 면역염색 단계로 진행해야 합니다. 먼저 망막에서 메탄올을 조심스럽게 피펫으로 제거하는 것으로 시작하십시오.그다음 1x PBS로 망막을 빠르고 부드럽게 헹굽니다. PBS를 제거하고 적절한 혈청이 5% 포함된 perm block 용액 100 µL를 망막에 처리합니다. 망막을 1시간 동안 부드럽게 흔들어 섞어줍니다.피펫을 사용하여 perm block 용액을 제거하고, 1차 항체 또는 is selectin이 포함된 perm block 용액 100 microliters로 교체합니다. 그 다음, 망막을 4 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 흔들어주며 배양한 뒤 다음 날 아침에 꺼냅니다. PBS TX로 10분씩 총 4회 망막을 세척합니다.모든 세척 단계 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 1차 항체가 비결합 상태인 경우, PBS tx에 1:200으로 희석한 적절한 형광 2차 항체 100 µL를 첨가합니다. 2차 항체가 결합될 수 있도록 망막 조직을 4 °C에서 하룻밤 동안 또는 상온에서 4시간 동안 부드럽게 교반하며 배양합니다.PBS TX에서 부드럽게 흔들어주며 회당 15분씩 총 4회 망막을 세척합니다. 이제 마운팅을 진행합니다. 광구 플라스틱 피펫을 사용하여 망막을 슬라이드로 옮기고, 조직지로 남은 PBS TX를 제거합니다.그런 다음 50 µL의 prolonged gold에 망막을 마운트하고 커버슬립으로 용액을 살짝 덮습니다. prolonged gold가 굳을 수 있도록 슬라이드를 4 °C에서 빛을 차단한 상태로 하룻밤 동안 냉장 보관하십시오. 다음 날, 해부 후 망막 이미징을 진행하십시오.ISO selectin B four Alexa 4 88을 사용했을 때 망막은 평평한 꽃 모양으로 보여야 합니다. 내피세포는 염색되어 녹색으로 나타납니다. 지지 혈관 근육 세포는 Antifa smooth muscle actin을 사용하여 시각화했습니다. 5배 대물렌즈를 이용한 저배율 관찰을 통해, 서로 다른 항체 조합을 사용하여 망막의 혈관 조직 구성에 대한 전반적인 모습을 확인했습니다.내피세포는 anti CD 31 면역 염색을 통해 확인할 수 있으며, 지지 기생충은 NG two에 대한 항체를 사용하여 시각화했습니다. 대안적으로, 지지 기생충을 anti desmin으로 염색했습니다. Anti desmin 염색은 기생충의 손가락 모양 돌기를 시각화하여, 이들이 내피세포와 밀접하게 연관되어 있는지 확인하는 데 도움이 됩니다.반대로, anti NG two 염색은 각 기생충의 핵을 윤곽선으로 표시하여 혈관 내 기생충 세포 수를 정량화할 때 유용합니다. 이 절차를 수행할 때, 해부 도구로 망막 표면을 건드리거나 손상시키지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 특정 세포의 증식을 조사하기 위해 BD 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina.  J. Vis. 특급 (2021). 이 동영상은 이광자 현미경을 사용한 in vivo 망막 이미징 기술을 보여줍니다. 마취된 마우스는 머리를 고정하고, 눈 윤활제를 바르고, 눈 위에 커버슬립을 놓아 이미징을 준비합니다. 형광 단백질을 발현하는 망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 정렬을 위해 상피형광(epifluorescence)을 사용하여 먼저 시각화됩니다. 마지막으로, 이광자 이미징이 사용되어 망막 신경절의 고해상도 시각화가 가능합니다.

마우스 망막의 Two-Photon In Vivo 이미징

출처: Bosco, A., et al. In vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma(신경 퇴행 중 망막 미세아교세포 활성화의 생체 내 역학: 마우스 녹내장의 컨포칼 안과 영상 및 세포 형태 측정).   J. Vis. 특급 (2015년) 이 비디오는 녹내장의 마우스 모델에서 망막 미세아교세포의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 형광 단백질 발현 망막 미세아교세포를 가진 형질전환 마우스가 검안경 아래에 위치합니다. 적외선 조명은 시신경두(ONH)를 찾는 데 사용되며, 초점면은 망막 혈관을 랜드마크로 사용하여 설정됩니다. 그런 다음 형광 미세아교세포를 시각화하기 위해 형광 이미징을 사용합니다. 세포체가 커지고 분지 복잡성이 감소하는 것을 특징으로 하는 활성화된 미세아교세포를...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

신생아 인간의 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV) 감염은 정신 지체의 중요한 원인을 나타내는, 아직 바이러스에 의한 발병으로 이어지는 분자 이벤트가 여전히 제대로 이해하고 있습니다. 뇌 감염의 역학을 조사하기 위해, 우리는 전체 - 동물의...

사용<em&gt; 생체 내</em&gt; 이미징 신생아의 실험 쥐 거대 세포 바이러스 감염의 진행 상황을 모니터링 할 수

쥐의 망막은 오랫동안 뇌에 접근 창으로 인정을 받고있다. 이 기술 문서에서 우리는 허혈성 손상 후 중추 신경계 내에서 혈관 재생의 실패로 이어질 메커니즘을 연구하는 산소에 의한 망막 병증의 마우스 모델을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 기술 시스템은 망막과 중추 신경계 내에서 기능 혈관의 재성장을 촉진하는 전략을 탐구하는 무력화 할 수 있습니다.

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

여기에서는 신생혈관 연령 관련 황반변성(AMD)의 혈관 특징을 재현하는 실험 모델인 마우스 레이저 유도 맥락막 신생혈관화(CNV) 프로토콜을 제시합니다. 일단 마스터하면 다양한 실험 측정을 테스트하기 위한 모델 시스템으로 CNV를 안정적이고 효과적으로 유도할 수 있습니다.

레이저에 의한 맥락막 신생 혈관에 대한 마우스 모델

여기, 선물이 쥐에서 안 neovascularization 레이저 유도의 형태학 변화의 후속에서 경도 vivo에서 화상의 유용성.

Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

이 프로토콜은 망막 플랫 마운트 마우스의 제조 및 면역형광 염색 및 분석을 위한 상세한 방법을 기술한다. 마우스 새끼를위한 fluorescein 안저 혈관 조영술 (FFA)의 사용 및 이미지 처리도 자세히 설명되어 있습니다.

산소 유발 망막병증 마우스 모델에서 망막 혈관의 동적 성장 모니터링

이 문서에서는 전체 마운트 망막 제제및 증식 및 비증식 망막병에서 자주 변경되는 혈관 매개 변수의 정량적 측정에 필요한 프로토콜에 대해 잘 확립되고 재현 가능한 렉틴 얼룩 분석법에 대해 설명합니다.

비증식 및 증식 망막증을 가진 마우스의 전체 산 망막에 있는 혈관 매개변수의 정량화

생쥐의 망막 혈관 구조는 혈관 패턴 형성의 메커니즘을 이해하는 데 특히 흥미롭습니다. 이 프로토콜은 광학 디스크에서 고정된 거리에서 형광 혈관 조영술 안저 영상에서 마우스 망막 혈관의 직경을 자동으로 측정합니다.

Mouse Fluorescent Angiography 이미지에서 망막 혈관 직경 측정

망막 혈관 구조의 주위 세포는 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주사 후 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β로 면역 형광 염색으로 검사했습니다. 표지된 망막은 조직 제거 방법으로 추가로 처리되었으며 컨포칼 현미경으로 망막 혈관 구조를 둘러싼 주위 세포의 3차원 보기를 시각화하기 위해 전체적으로 장착되었습니다.

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화 

배우세요 신생아 마우스 망막의 혈관신생을 연구하는 전체 마운트 면역형광 염색법을. 이 방법은 형광 염색과 공초점 현미경을 활용하여 망막 혈관망을 시각화하고, 혈관 발달 메커니즘 및 유전자·약물 효과를 분석하는 데 활용됩니다.

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색

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