혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색 생체 내

이 절차의 전반적인 목표는 신생아 마우스 망막의 혈관 신생을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 산후 안구의 핵을 형성한 다음 산후 망막을 조심스럽게 꽃잎 모양으로 해부하는 세 번째 단계의 고정제를 바르고, 마지막 단계는 망막 혈관 구조를 염색하는 것입니다. 궁극적으로, 마우스 망막 혈관 구조의 시각화는 형광 염색과 컨포칼 현미경을 통해 이루어집니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Simon Tlo 박사와 제 연구실의 이전 구성원인 Kathleen Allenson입니다. 이 절차에서 기본 온도는 실온입니다. 인도적으로 죽인 새끼 쥐를 가위로 옆으로 눕히는 것으로 시작합니다.

눈을 덮고 있는 피부를 제거합니다. 그런 다음 가위를 눈 아래에 놓고 시신경과 주변 조직을 자르고 눈을 들어 올립니다. 적출된 눈을 2회 만에 4%PFA인 고정액이 포함된 24웰 플레이트로 옮깁니다.

PBS는 한쪽 눈이 고정제에 있는 동안 다음 쪽 눈을 해부합니다. 두 눈 절개 사이의 비틀거림은 30분입니다. 연습을 통해.

각 눈이 10-15분 동안 고정되도록 합니다. 그런 다음 최소 5분에서 10분 동안 얼음 위에서 PBS를 두 번 차갑게 옮깁니다. 망막을 분리하기 전에 멧돼지를 넓히기 위해 자른 플라스틱 목초지 피펫을 사용하여 원하는 만큼 PBS에 눈을 모으십시오.

해부 현미경으로 PBS의 2배가 들어 있는 페트리 접시에 눈을 옮깁니다. 집게와 가위를 사용하여 눈 주위의 지방을 제거합니다. 날카로운 가위로 각막의 가장자리를 뚫고 각막과 홍채 주위를 자르고 이러한 조직을 버리십시오.

그런 다음 망막과 공막 사이에 집게를 삽입합니다. 공막이 찢어지지 않도록 주의하면서 공막을 제거합니다. 맥락막층은 망막을 손상시킬 위험이 없는 한 제거할 수도 있습니다.

맥락막층을 켜둔 상태로 두는 것은 면역 염색의 품질에 큰 영향을 미치지 않아야 합니다. 이제 집게를 사용하여 수정체와 유리체액을 제거합니다. 그런 다음 알로이드 혈관을 제거합니다.

가는 집게를 사용하여 눈 중앙에 모읍니다. 그런 다음 망막 중심에서 빠르게 당겨 빼냅니다. 노란 엉겅퀴를 모두 제거하는 데 각별히 주의하십시오

컵 모양의 망막은 이제 깨끗한 페트리 접시로 옮기고 PBS로 깨끗하게 헹궈야 합니다. 이제 망막으로 들어가 보겠습니다. 중앙을 향해 약 2/3에 이르는 4-5개의 방사상 절개를 만듭니다.

스프링 가위를 사용하여 이 페달 모양의 망막을 만듭니다. 이 단계를 완벽하게 하려면 인내와 연습이 필요합니다. 이제 목초지 피펫을 사용하여 대부분의 PBS를 뽑습니다.

이렇게 하면 망막이 평평해집니다. 그런 다음 작은 흡수성 종이로 여분의 PBS를 제거합니다. 다음으로, 마이너스 20도의 메탄올을 망막 표면에 거의 잠길 때까지 한 방울씩 바른 다음 메탄올을 넉넉히 첨가합니다.

망막이 하얗게 변합니다. 이 단계는 망막을 고정하는 데 도움이 되며 투과를 촉진합니다. 차가운 메탄올의 망막을 작은 튜브로 옮깁니다.

넓은 구멍의 플라스틱 피펫을 사용합니다. 필요한 경우 최소 20분 동안 차가운 메탄올에서 배양하도록 하면 망막이 영하 20도의 메탄올에 몇 달 동안 머물 수 있습니다. 항체는 여기에서만 사용됩니다.

이 cine은 산모의 고정 망막에 성공적으로 사용할 수 없습니다. 이 경우 망막은 꽃잎 모양으로 평평하게 만든 후 바로 면역염색을 진행해야 합니다. 먼저 망막에서 메탄올을 조심스럽게 피펫으로 떼어냅니다.

그런 다음 PBS로 망막을 빠르고 부드럽게 헹굽니다. PBS를 제거하고 100마이크로리터의 파마 차단 용액과 5%의 적절한 혈청으로 망막을 덮습니다. 한 시간 후에 망막이 부드럽게 흔들리도록 설정합니다.

피펫으로 펌 블록 용액을 제거하고 1차 항체를 함유하거나 이전에 셀렉틴된 100마이크로리터의 펌 블록 용액으로 교체하십시오. 그런 다음 망막이 섭씨 4도에서 밤새 잠복하고 다음날 아침에 흔들리도록 설정합니다. PBS TX에서 한 번 씻을 때마다 10분 동안 망막을 네 번 씻습니다.

모든 세척 단계에서 부드럽게 흔들어주세요. 1차 항체가 접합되지 않은 경우, PBS tx에 1 - 200으로 희석된 적절한 형광 2차 항체 100마이크로리터를 추가합니다. 망막을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하거나 실온에서 4시간 동안 부드럽게 교반하여 2차 항체를 제거합니다.

PBS TX에서 15분 동안 부드럽게 흔들면서 망막을 4번 씻습니다. 이제 마운트를 진행합니다. 광역 플라스틱 피펫을 사용하여 망막을 슬라이드로 옮기고 티슈로 여분의 P-B-S-T-X를 제거합니다.

그런 다음 50마이크로리터의 연장된 금에 망막을 장착하고 커버 슬립으로 용액을 부드럽게 덮습니다. 오래 허용하려면 금 de 세트 슬라이드를 섭씨 4도에서 밤새 냉장 보관하고 다음 날 빛으로부터 보호하십시오. 해부 후 망막 이미징을 진행합니다.

망막은 ISO selectin B four Alexa 4 88을 사용하여 평평한 꽃처럼 보여야 합니다. 내피 세포는 염색되어 녹색으로 나타납니다. 지지하는 혈관 근육 세포는 Antifa 평활근을 사용하여 시각화하고, 5배 대물렌즈를 사용하여 저출력 보기를 활성화하고, 다른 항체 조합을 사용하여 망막의 혈관 조직을 개괄적으로 볼 수 있었습니다.

내피 세포는 항 CD 31 면역 염색을 사용하여 볼 수 있으며, NG 2에 대한 항체를 사용하여 시각화 된 기생충을 지원합니다. 대안적으로, 지원 기생충은 anti desmin으로 염색되었습니다. Anti desmin staining은 기생충의 손가락과 같은 과정을 시각화하고 기생충이 내피 세포와 밀접하게 관련되어 있는지 여부를 결정하는 데 도움이 됩니다.

대조적으로, anti NG two staining은 각 기생충의 핵을 간략하게 설명하며, 이는 혈관 구조에 있는 기생충 세포의 수를 정량화할 때 유용합니다. 이 절차를 시도하는 동안 박리 도구로 망막 표면을 만지거나 손상시키지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 특정 세포의 증식을 조사하기 위해 BD 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.