형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

이 절차의 전반적인 목표는 쥐 타액선의 세포 내 구조를 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 침샘을 손상시키지 않고 수술로 노출시킴으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 마취된 동물을 현미경 스테이지에서 고정시킵니다.

다음으로, 침샘은 최종 단계에서 기능을 손상시키지 않도록 조심스럽게 배치됩니다. 마우스는 동물의 심장 박동이나 호흡으로 인한 모션 아티팩트를 최소화하기 위해 맞춤형 홀더로 안정화됩니다. 궁극적으로, 세포 내 구조의 역학은 생체 내 현미경으로 이미지화할 수 있습니다.

마취하기 전에 마우스의 무게를 측정하여 적절한 마취제 용량을 결정합니다. 다음으로, 불소 흡입으로 마취 전 유도합니다. 동물이 의식을 잃으면 15분마다 팝 핀치로 진정제를 확인하고 수술 기간 동안 쥐를 열 램프 아래에 두십시오.

직장 프로브 온도계로 동물의 체온을 모니터링하십시오. 이제 전기 이발기로 마우스의 목을 면도한 다음 에탄올을 적신 거즈 스폰지를 사용하여 목의 복부 쪽을 닦고 김 물티슈로 여분의 알코올을 건조시킵니다. 다음으로, 둔하고 구부러진 핀셋을 사용하여 여종근의 아래쪽 끝에 있는 작은 피부 조각을 들어 올리고 작게 절개합니다.

절개 부위에 가위를 삽입하고 끝을 피부 아래쪽을 향해 위쪽으로 향하게 하고 피부가 아래 조직에서 분리될 때까지 칼날을 여러 번 엽니다. 그런 다음 신경관과 혈관이 몸의 나머지 부분과 연결하는 침샘의 기저부 근처에서 시작합니다. 가위를 사용하여 폭 3mm, 길이 10mm의 느슨한 피부를 자릅니다.

상처 부위를 청소한 후 결과 개구부는 타원형이 되며 크기는 약 8 x 12mm입니다. 양쪽 침샘이 보일 것입니다. 주사기를 사용하여 광학 커플링 젤을 절단 부위 중간에 바른 다음 새 멸균 거즈 조각을 사용하여 혈액과 느슨한 머리카락이 모두 제거될 때까지 구멍 바깥쪽으로 젤을 닦습니다.

이제 7번 핀셋을 사용하여 오른쪽 침샘의 끝을 찾아 침샘 상단에서 몇 밀리미터 위에 있는 결합 조직을 잡습니다. 그런 다음 실질(parenchyma)을 손상시키지 않고 분비샘 주위의 결합 조직을 찢습니다. 분비샘이 노출되면 분비샘에서 결합 조직을 부드럽게 분리하여 식염수로 출혈을 씻어냅니다.

모든 결합 조직이 분리되어 있고 분비샘이 완전히 노출되어 있는지 확인하십시오. 동물을 현미경으로 데려오기 전에 두꺼운 거즈 조각과 히트 팩을 현미경 스테이지에 놓고 히트 팩 상단도 얇은 거즈 조각으로 덮습니다. 스테이지 중앙에 커버 슬립을 놓습니다.

그런 다음 마우스를 거즈 위의 오른쪽에 놓고 앞발 앞발의 복부 쪽에 마스킹 테이프를 붙이고 앞니 주위에 실크 봉합사를 걸어 동물을 고정합니다. 실과 발 사이에 약간의 장력을 만들고 무대에 부착하십시오. 마스킹 테이프가 더 많으면 침샘이 자연스럽게 쉬어야 합니다.

커버 슬립의 중간에. 현미경 스테이지에 연결된 플라스틱 쐐기를 사용하여 마우스의 머리와 흉부를 더욱 안정화합니다. 그런 다음 분비샘 위에 조직을 청소하는 작은 렌즈 조각을 놓습니다.

글랜드를 약간 확장하고 글랜드 위에 맞춤형 홀더를 놓습니다. 그런 다음 금속 클램프와 마스킹 테이프를 사용하여 안정 장치를 스테이지에 단단히 연결합니다. 거즈와 열 패드로 동물을 덮고 유연한 열 결합 프로브가 장착된 온도계로 노출된 땀샘 온도를 모니터링합니다.동물을 안정화한 직후 에피 형광 조명을 사용하여 땀샘 표면에 초점을 맞춥니다.

모세혈관의 혈류와 조직의 전반적인 형태를 평가합니다. GFP 유전자를 여기시키려면 488 나노미터 레이저를 사용하십시오. 탠덤 토마토 단백질의 광표백을 방지하기 위해 최대 출력을 0.5밀리와트로 설정하십시오.

561 나노미터 레이저를 사용하여 피크 출력을 1밀리와트로 설정합니다. 이제 선택한 영역을 사전 스캔하여 조직의 안정성을 평가합니다. 준비물이 안정적이지 않으면 적절한 초점면을 찾을 수 있도록 동물을 적절하게 조정하십시오.

사전 모드에서. aser 구조, 분비 과립 및 원형질막이 명확하게 보일 때까지 대물렌즈를 커버 슬립 쪽으로 점차적으로 움직입니다. 그런 다음 분비 과립의 역학을 이미지화하려면 프레임당 0.5-2초의 스캔 속도와 픽셀당 0.2마이크로미터의 공간 스케일로 256 x 256 픽셀을 사용합니다.

과립과 원형질막을 최적으로 시각화하려면 광학 두께를 0.9에서 1.2 마이크로미터 사이로 설정하십시오. 다음으로, 기준점으로 사용할 시야의 이미지를 기록합니다. 마지막으로, 새로 준비된 이소프로테레놀과 식염수를 킬로그램당 0.1mg씩 피하 주사하여 엑소사이토시스를 자극합니다.

주입 후 1분. 분비 과립과 원형질막의 융합은 과립 주위의 GFP 형광의 증가와 탠덤 토마토 펩타이드가 제한 막으로의 확산에 의해 감지됩니다. GFPM 토마토 마우스에서 아시닌은 파선으로 표시된 바와 같이 세포질 GFP와 막 표적 탠덤 토마토 펩타이드를 발현하는 명확하게 구별된 구조로 나타납니다.

개별 asinine에서 aser 세포는 화살표로 표시된 대로 탠덤 토마토 펩타이드에 의해 묘사됩니다. GFP는 aser 세포 내부에서 명확하게 볼 수 있는 핵에서도 검출됩니다. 화살촉으로 표시된 세포질 GFP는 직경이 약 1-1.5마이크로미터인 짙은 원형 소포로 나타나는 분비 과립에서 제외됩니다.

외생식물적 사건을 시각화하기 위해, 별표로 표시된 바와 같이 분비 과립이 풍부한 원형질막의 대표 영역이 isoproterenol 주입 후에 표시됩니다. 원형질막에 근접한 일부 분비 과립 주위의 녹색 화살표로 표시된 GFP 형광 수준의 증가를 관찰할 수 있습니다. 또한, 원형질막(plasma membrane)과 융합한 후, 탠덤 토마토 펩타이드는 빨간색 화살표로 강조 표시된 바와 같이 분비 과립의 제한막(limiting membrane)으로 확산됩니다.

30-40초 후에 비서 과립이 점차 무너지고 제한 막이 정점 원형질막에 통합됩니다. 여기에 제시된 접근 방식은 살아있는 쥐에서 특정 막 이동 과정의 역학을 이미징할 수 있게 한다는 점에서 세포 생물학의 주요 돌파구를 나타냅니다.