2.3: PCR: 중합 효소 연쇄 반응

중합효소 연쇄 반응 또는 PCR은 DNA 단편을 증폭하는 데 널리 사용되는 방법입니다. PCR는 변성, 어닐링 및 확장 또는 신장이라고 하는 세 가지 별개의 온도를 통해 반응의 반복적인 가열 및 냉각인 열순환을 사용합니다.

열순환 반응은 PCR 시약이 반응을 정밀하게 가열 및 냉각하도록 프로그래밍된 기계인 열순환기에 들어가면 시작됩니다.

PCR 주기는 변성으로 시작되며, 이는 95에서 20-30초 동안 발생합니까? C, DNA의 용융 온도보다 훨씬 높습니다. 용융 온도는 DNA의 절반이 이중 가닥 나선이고 다른 하나는 단일 가닥 무작위 코일인 상태입니다. 변성 온도는 용융 온도보다 훨씬 높으며, 이는 상보적 염기쌍 사이의 모든 수소 결합이 끊어져 단일 가닥 DNA만 생성되도록 하기 위함입니다. 쌍을 이루는 단일 가닥은 감지 및 안티센스 가닥이라고 합니다. 감각의 서열 또는 코딩 가닥은 mRNA의 서열과 동일하며, 이는 궁극적으로 단백질을 암호화합니다. 따라서 의미가 있습니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 읽으면 5로 시작합니까? 인산염으로 끝나고 3으로 끝납니까? 수산기. 안티센스 가닥은 상보적 가닥이라고도 하며 3? 하이드록실로 끝나고 5? 인산염은 왼쪽에서 오른쪽으로 읽을 때 사용됩니다.

두 번째 단계에서는 어닐링, 센스 또는 안티센스 가닥에 특이적인 프라이머라고 하는 짧은 DNA 조각이 수소 결합을 통해 결합합니다. 안티센스 가닥에 결합하고 감지 가닥과 동일한 서열을 갖는 프라이머는 순방향 또는 감지 프라이머입니다. 감지 가닥에 결합하고 감지 가닥과 반대이고 상보적인 서열을 갖는 프라이머가 리버스 또는 안티센스 프라이머입니다. 이용된 뇌관의 길이에 따라서 이 단계를 위한 어닐링 온도는 보통 3에서 5입니까? C가 두 프라이머의 낮은 용융 온도보다 낮습니다. 어닐링은 50에서 65 사이에서 발생하는 경향이 있습니까? C이며 20-40초 동안 지속됩니다.

일단 뇌관이 DNA에 결합하면 3? DNA를 복제하는 효소인 중합효소가 결합하는 하이드록실기 말단.

신장 또는 연장이라고 하는 다음 단계는 72에서 발생합니다. C는 중합효소 활성에 최적입니다. 일단 결합되면 중합효소는 5? 3으로? 이중 가닥 DNA를 만드는 방향.

연신율이 완료되면 다음 사이클이 시작됩니다. 다음 주기에서 프라이머는 이전 확장을 통해 형성된 단일 가닥 DNA에 결합합니다. 증폭하려는 짧은 단편인 앰플리콘은 궁극적으로 중합효소가 역방향 프라이머의 증폭에 의해 생성된 가닥의 정방향 프라이머에서 확장되거나 그 반대로 확장될 때 형성됩니다. 일단 생성되면 앰플리콘의 양은 후속 주기에서 기하급수적으로 증가합니다. 반응의 목표에 따라 20-40 사이클이 필요합니다.

긴 앰플리콘의 경우, 최종 연신율 단계는 일반적으로 72 ? 모든 DNA가 이중 가닥인지 확인하기 위해 C를 5-15분 동안 누릅니다. 일반적으로 4 ? C는 thermocycler에서 꺼낼 때까지 DNA가 안정되어 있는 체재된다는 것을 보증하기 위하여 예방 단계로 thermocycler로 프로그램됩니다.

PCR 반응에는 몇 가지 주요 시약이 필요합니다. 첫 번째는 DNA 템플릿으로, 이 DNA 샘플에서 단편이 증폭됩니다. 그런 다음 중합효소 반응을 프라이밍하는 DNA 또는 올리고뉴클레오티드의 짧은 조각인 프라이머가 있습니다.

프라이머를 선택할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 첫째, 그들은 5? 그리고 3? 증폭하려는 염기서열 측면에 있는 DNA 템플릿의 영역. 둘째, 길이는 15-30 염기쌍이어야 하며 약 50%의 구아닌과 시토신으로 구성되어야 합니다. 셋째, 두 프라이머의 용융 온도는 50 이상이어야 합니까? C와 서로 1-2도 이내이므로 동일한 어닐링 온도에서 효율적으로 결합할 수 있습니다. 넷째, 그들은 서로 보완적일 수 없으며 프라이머 이량체를 형성할 수 없습니다. 그리고 다섯째, 그들은 뇌관 중 하나 내에서 자체 어닐링에 의해 형성되는 2차 구조를 포함해서는 안 됩니다.

프라이머 및 DNA 템플릿 외에도 DNA 중합효소는 PCR 반응에 필수적입니다. PCR에서 통용되는 효소는 Taq 폴리메라이제인데, 이는 온천에 서식하는 박테리아 Thermus aquaticus에서 분리된 열안정성 효소입니다. Taq 중합효소는 90°C 이상의 온도를 견딜 수 있습니다.

dNTPs는 성장 가닥의 염기쌍을 구성하며 반응에 추가되어야 합니다. pH를 유지하고 망간, 마그네슘 및 칼륨과 같은 중요한 이온을 포함하는 반응 완충액은 반응을 안정화하고 중합효소에 중요한 보조 인자를 제공하는 데 필요한 반응 성분이기도 합니다. 모든 반응과 마찬가지로 PCR에는 용매가 필요하므로 반응을 억제할 수 있는 이온이 없는 PCR 등급의 물이 사용됩니다.

PCR을 시작하기 전에 오염을 방지하기 위해 작업 환경이 깨끗한지 확인하십시오. 장갑은 항상 착용해야 합니다.

당신이 필요로 할 각종 반응 성분을 추적하기 위하여 돕기 위하여. 대조군을 포함한 각 샘플에 대한 시약 부피 및 농도 표를 만드십시오. 부피 측면에서 일반적인 반응은 5? 10X 반응 버퍼의 L, 4? 25mM MgCl2의 L, 1? 10mM에서 dNTP의 L, 2? 50 ng/에 정방향 및 역방향 프라이머의 L? L 및 0.3? 5 U/?L.에 Taq 폴리메라이제의 L. 반응에 100ng가 존재하도록 충분한 템플릿을 추가하려고 합니다. 마지막으로, 대부분의 PCR 반응은 총 50μL의 부피로 수행됩니다. 따라서 총 부피가 실제로 50?L인지 확인하기 위해 PCR 등급의 물을 사용해야 합니다.

종이에 반응이 계획되면 얼음 위에서 시약을 조립하십시오.

다음으로, PCR 튜브에 시약을 추가합니다. 먼저 물을 넣은 다음 템플릿, 프라이머, 완충액, 염화마그네슘 및 dNTP를 넣고 마지막으로 Taq 중합효소를 넣고 철저히 혼합합니다.

반응이 설정된 후 샘플을 thermocycler에 넣고 PCR 프로그램을 시작하십시오. 간단히 말해서, 기계의 부품은 PCR 튜브 또는 플레이트가 삽입되고 정확한 온도 변화를 받는 열 블록으로 구성됩니다. 응결을 방지하여 샘플이 손실되지 않도록 하는 가열식 뚜껑과 PCR 온도 및 주기 기간을 프로그래밍하기 위한 디스플레이가 있는 인터페이스. 반응을 조립하기 전에 항상 프로그램을 설정하십시오.

일단 thermocycler가 그것의 일을 완료하면. 반응을 꺼내고 겔 전기영동으로 PCR 산물을 확인하십시오. PCR이 성공적이면 올바른 염기쌍 크기에서 앰플리콘을 볼 수 있습니다.

이제 PCR로 작업할 때 몇 가지 유용한 힌트를 제공합니다. 여러 다른 템플릿에서 동일한 PCR 산물을 증폭하려고 할 때 따라서 설정해야 할 반응이 많이 다릅니다. 마스터 믹스를 만들기 위해 반응을 확대하는 것이 유용합니다. PCR 마스터 믹스는 샘플과 공유되는 모든 시약의 대량 혼합물로, 나중에 여러 반응 튜브에 분배됩니다.

대부분의 PCR 반응은 95? C를 1분에서 9분 동안 누릅니다. 이 단계는 모든 템플릿이 첫 번째 증폭 주기 동안 단일 가닥이 되도록 합니다.

종종 샘플 오염 위험이 높은 경우 PCR 캐비닛을 사용하는 것이 바람직합니다. 당신의 반응에 있는 어떤 오염든지 검사하기 위하여 DNA 템플렛이 없고 당신의 DNA 젤에 있는 제품을 생성해서는 안 되는 부정적인 대조군을 설치하는 것이 유리하다.

PCR은 온도, 염화마그네슘 농도를 조정하거나 새로운 프라이머를 시도하여 최적화해야 하는 경우가 많습니다. PCR이 작동하면. 항상 제품을 생산할 것이라는 것을 알고 있는 positive control 템플릿을 실행하는 것이 좋습니다.

PCR의 많은 변이 그리고 응용은 다양한 목적을 위해 존재한다.

PCR의 한 변형인 핫 스타트 PCR은 첫 번째 변성 단계가 끝날 때까지 반응에서 중합효소를 보류하는 것을 포함하며, 이는 사이클링 전에 발생할 수 있는 비특이적 증폭을 방지합니다.

PCR은 또한 다중 PCR PCR 반응에서 여러 프라이머를 사용하여 여러 DNA 염기서열을 동시에 증폭하도록 수정할 수 있습니다.

형광성 oligonucleotide 조사와 조화하여, PCR는 실제로 유전자 표정의 관계되는 절대적인 수준 또는 유전자의 주어진 유전자 또는 그룹을 위해 얼마나 많은 mRNA가 생성되는지 측정할 수 있는 기술이 될 수 있습니다. 이 방법을 qPCR이라고 합니다.

PCR은 또한 유기체에서 특정 DNA 염기서열의 존재를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 유전형 분석(genotyping)이라고 합니다. 예를 들어, 유전형 분석은 샘플에 종 특이적 염기서열이 존재하는지 파악하여 물고기 샘플의 진위 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 유전형 분석은 범죄 현장에서 발견된 DNA가 용의자와 일치하는지 확인하기 위한 법의학 분석에도 사용됩니다.

당신은 방금 PCR에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 이 비디오에서 우리는 PCR이 무엇이며 어떻게 작동하는지, PCR 반응의 많은 구성 요소, PCR이 DNA를 증폭할 수 있는 메커니즘 및 이 매우 유용한 기술의 많은 변형 및 응용 프로그램을 검토했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!