세포 및 분자 생물학의 기초 방법론

많은 생물 의학 실험은 정확하고 재현 가능하며 통계적으로 관련된 데이터를 달성하기 위해 알려진 양의 세포의 조작이 필요합니다. 따라서 세포를 계산하는 방법을 배우는 것은 성공적인 생물 의학 과학자에게 특히 필수적인 기술입니다. 세포를 계산하는 가장 일반적인 방법은 간단한 광 현미경으로 알리코세포의 열거에 도움이 되는 두 개의 레이저 에칭 그리드를 포함하는 기기인 대막계를 사용하는 것입니다. 이 데이터는 실험 적인 견본에 있는 세포의 수를 추정하기 위하여 그 때 사용될 수 있습니다. 이 비디오는 실험 샘플 농도를 조정하여 너무 많거나 너무 적은 세포를 계산하지 않도록 하는 방법을 보여줍니다. 세포의 작은 (~10 μl) 알리쿼트를 계산하기 위해 막질계를 사용하는 방법; 계수에 사용할 패키토미터 레이저 그리드의 사분면을 결정하는 방법; 실험 샘플의 총 셀 수를 계산하는 방법, 어떤 사분면이 사용되었는지에 따라; 그리고 trypan 블루 제외를 사용하여 실험 세포 집단의 생존가능성을...

세포주들은 실험 분석을 위해 세포 유형의 급속한 배양과 확장을 허용하기 때문에 생물 의학 실험에서 자주 사용됩니다. 세포주는 새로 고립된, 또는 1차 세포에 비교될 때 유사한 조건하에서 배양됩니다, 또는 1 차적인, 세포, 그러나 몇몇 기본적인 중요한 다름으로: (i) 세포주는 그들의 자신의 특정 성장 인자 칵테일을 요구하고 (ii) 그들의 성장은 1 차 세포 보다는 더 밀접하게 감시되어야 합니다, 그(것)들을 무기한으로 성장할 수 있는 돌연변이는 또한 빨리 그들의 과성장으로 이끌어 낼 수 있기 때문에. 따라서, 세포선이 배양 용기의 바닥 대부분을 커버하는 배양문화의 성장 지점에 도달하면, 또는 약 90% 수렴성,세포는 재장전, 세척, 실험적으로 사용, 나중에 사용하기 위해 동결, 또는 새로운 배양 용기의 추가 확장을 위해 재시드되어야 한다. 본 비디오는 미디어 지표를 사용하여 세포 배양 건강을 결정하는 방법을 시연할 것이며, 시약 및 장비는 배양으로부터 부착 된 세포줄을 안전하게...

폴리머라제 연쇄 반응 또는 PCR은 온도 가종은 고정 된 시간 간격으로 온도 변화인 열 순환을 통해 DNA를 증폭시키는 데 사용되는 기술입니다. 열안정 DNA 폴리머라아제를 사용하여 PCR은 dNTPs에게 불린 DNA 빌딩 블록에서 DNA의 수많은 사본을 만들 수 있습니다. PCR에는 데니션, 어닐링 및 신장의 세 가지 단계가 있습니다. 정립은 주기의 첫 번째 단계이며 단일 좌초 DNA의 결과로 기지 사이의 수소 결합을 방해하여 DNA가 녹아 발생시킵니다. Annealing은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 DNA 템플릿에 결합할 수 있을 만큼 온도를 낮춥춥습니다. 신장 단계 동안 DNA 폴리머라제는 새로운 이중 좌초 DNA를 합성합니다. 이 비디오는 PCR 절차에 대한 소개를 제공합니다. PCR의 기본 원칙은 일반화된 PCR 반응을 설정하기 위한 단계별 절차뿐만 아니라 설명됩니다. 이 비디오는 PCR 반응에 필요한 구성 요소를 보여 주며, 프라이머 설계에 대한 지침을 포함하며...

DNA 젤 전기전광은 DNA 분자의 검출 및 분리에 사용되는 기술이다. 전기장은 아가로즈로 구성된 젤 매트릭스에 적용되며, 겔 내에서 전하 입자가 이동하여 크기에 따라 분리됩니다. DNA 백본의 음전하 인산염은 DNA 파편이 양극을 향해 움직이게 합니다 - 양전하 전극. 이 비디오는 아가로즈 젤에서 DNA 단편이 해결되는 메커니즘을 설명하고, 아가로즈 젤을 준비하고 DNA 샘플을 적재하고 DNA 샘플을 적재하고 DNA 젤을 실행하고 DNA 단편을 시각화하고 실험이 끝난 후 젤과 실행 버퍼를 적절하게 처리하는 방법에 대한 단계별 일반화 절차를 제공합니다.

나트륨 도데딜 황파테 폴리 아크릴아미드 젤 전기 포근, 또는 SDS-PAGE, 그들의 크기와 다른 아무것도에 따라 단백질의 혼합물을 분리하기 위한 널리 사용되는 기술이다. 성안 세제인 SDS는 선형화된 단백질의 길이에 걸쳐 균일한 전하를 생성하는 데 사용됩니다. 먼저 폴리아크릴아미드로 만든 젤에 넣은 다음 젤에 전기장을 적용하면 SDS 코팅 단백질이 분리됩니다. 전기장은 구동력역할을 하며, SDS 코팅 단백질을 작은 단백질보다 더 느리게 움직이는 더 큰 단백질을 가진 양극쪽으로 그립니다. 크기별로 단백질을 식별하기 위해 알려진 크기의 단백질 표준은 샘플과 함께 로드되고 동일한 조건에서 실행됩니다. 이 비디오는 먼저 그 뒤에 이론을 설명하고 나중에 단계별 절차를 보여 줌으로써 SDS-PAGE에 대한 소개를 제공합니다. 겔에 적용된 폴리아크릴아미드 농도 및 전압과 같은 다양한 실험 파라미터가 논의된다. 쿠마시와 은 얼룩과 같은 다운스트림 염색 방법이 도입되고, 2D 젤 전기포고와 같은...

변혁은 세포가 주변에서 외국 DNA를 섭취할 때 발생하는 과정입니다. 변형은 박테리아의 특정 모형에서 자연에서 생길 수 있습니다. 분자 생물학에서, 변환은 세균성 세포막에 있는 모공의 생성을 통해 실험실에서 인위적으로 재현됩니다. 환경에서 DNA를 취할 수있는 세균 세포는 유능한 세포라고합니다. 실험실에서, 세균성 세포는 열 충격 방법에게 불린 절차에 의해 나중에 소개된 유능하고 DNA를 만들 수 있습니다. 열 충격 변환은 염화칼슘이 제공하는 칼슘이 풍부한 환경을 사용하여 플라스미드 DNA와 세균성 세포막 사이의 정전기 반발을 중화시킵니다. 온도의 급격한 증가는 박테리아의 혈장 막에 있는 모공을 생성하고 플라스미드 DNA가 세균성 세포를 입력하는 것을 허용합니다. 이 비디오는 화학적으로 유능한 박테리아를 만들고, 열 충격 변환을 수행하고, 변형 된 박테리아를 플레이트하고, 변환 효율을 계산하는 방법에 대한 단계별 절차를 거칩니다.

용어 "변환"은 외국 DNA의 세포 섭취를 말합니다. 자연에서, 변환 박테리아의 특정 유형에서 발생할 수 있습니다. 그러나 분자 생물학에서는 세균성 세포벽에서 모공 생성을 통해 인위적으로 변형이 유도된다. 환경에서 DNA를 취할 수있는 세균 세포는 유능한 세포라고합니다. 전기유능한 세포는 실험실에서 생성될 수 있고 이들 세포의 변형은 DNA가 통과할 수 있는 세포벽에 기공을 생성하는 전기장을 적용하여 달성될 수 있다. 비디오는 전기 포라기 및 전기 기공 큐벳과 같은 전기 포기에 사용되는 장비를 설명합니다. 비디오는 또한 전자 무능한 세포및 관심있는 전기 화 세포를 만드는 방법에 대한 단계별 절차를 거칩니다. 실험의 변화의 성공 예측은 시간 상수를 관찰하여, 또한 전극시 용액에서 소금을 제거하는 것의 중요성을 언급한다.

효소-연결된 면역흡소감 분석(ELISA)은 전형적으로 실험 샘플 내에서 관심있는 표적 단백질의 존재 및/또는 양을 검출하기 위해 수행됩니다. 표적 단백질의 검출은 ELISA를 면역 분석으로 만드는 항체에 의해 가능하게 된다. 일련의 인큐베이션 및 세척 단계를 통해, 자주 연결되거나 효소에 공주되는 이러한 항체는 마이크로티터 플레이트에 우물의 바닥을 코팅하는 단백질을 검출합니다. 기판에 노출되면, 항체 결합 효소는 색 변화를 일으켜 시료에 대한 관심 있는 단백질의 존재를 나타낸다. 이 비디오에서, ELISA작동 방법의 이론은 1 차 및 이차 항체 결합 둘 다의 토론 및 차단 단계의 중요성을 포함하여 설명됩니다. 비디오가 단계별 절차에 대한 설명으로 진행됨에 따라 이론은 연습에 뒤따릅니다. 마지막으로, 샌드위치와 경쟁적인 ELISA와 같은 표준 ELISA의 변형이 도입되고, 창구 판매 임신 검사와 같은 이 방법의 실제 응용 프로그램이 설명된다.

플라스미드 정제는 게놈 DNA, 단백질, 리보솜 및 세균세포벽으로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 정화하는 데 사용되는 기술입니다. 플라스미드는 특정 DNA 분자의 담체로 사용되는 작고 원형의 이중 좌초 DNA입니다. 변환을 통해 숙주 유기체로 도입될 때, 플라스미드가 복제되어 연구 하에 DNA 단편의 수많은 사본을 만듭니다. 이 비디오에서는 플라스미드 정화를 수행하는 방법에 대해 단계별 일반화 절차가 설명되어 있습니다. 플라스미드 정제에는 세균 배양의 성장, 박테리아의 수확 및 용해, 플라스미드 DNA의 정화 의 세 가지 기본 단계가 포함됩니다. 이 비디오에는 플라스미드가 프로토콜의 각 단계에서 발견될 수 있는 설명이 포함되어 있으며 분광계 및/또는 겔 전기포고증으로 플라스미드 DNA를 정량적으로 그리고 질적으로 분석할 수 있습니다. 원하는 수율, 플라스미드 카피 번호 및 세균 배양 부피를 대상으로 하는 다양한 유형의 플라스미드 정제 방법이 있습니다.

겔 정제는 전기 전구 분리 후 DNA 단편을 복구하는 데 사용됩니다. 아가로즈 젤에서 DNA 회복은 실리카 컬럼에서 결합, 세척 및 용례의 세 가지 기본 단계를 포함한다. DNA는 소금 다리를 통해 높은 소금의 존재에 실리카에 결합하는 것으로 추정된다. 결합 다음, DNA는 불순물의 세척이 상호 작용을 방해 낮은 소금 조건하에서 용출된다. 이 비디오는 젤에서 밴드를 절단하기위한 단계별 일반화 절차를 거치며, 젤 용해화, 실리카 기둥에 결합을 통한 정제 및 정제 된 DNA의 용출을 통해 전달됩니다. 또한, 프리젠 테이션은 알려진 크기의 DNA가마커 또는 사다리와 아가로즈 젤을 실행하는 중요성을 포함하여 성공적인 젤 정화를 보장하기위한 몇 가지 팁을 논의한다.

웨스턴 블로팅은 전기전구분리 시료에서 특정 단백질의 존재를 식별하는 데 사용됩니다. 나트륨 도데딜 황산염 폴리아크라이글라미드 젤 전기포고증 또는 SDS-PAGE로 알려진 기술에 의한 분리에 따라, 서부 전달은 폴리아크릴아미드 젤에서 단백질을 각 위치에서 단백질을 트랩하는 막 조각으로 이동시키는 데 사용된다. 다음으로, 막은 면역제팅에게 불린 프로세스에 있는 항체로 조사됩니다. 면역블로팅은 특정 인식 부위를 통해 항체 단백질 및 항체 결합을 사용하며 단일 단백질을 식별하는 데 필요한 높은 특이성을 제공합니다. 항체의 검출은 효소의 사용을 포함하는 기자 시스템을 사용하여 일어난다. 효소는 항체의 끝에 부착하고 색상이나 빛의 변화를 생성하기 위해 기판과 반응할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 신호는 밀도라는 프로세스를 사용하여 이미지를 만들고 정량화할 수 있습니다. 이 비디오 기사는 서부 전세, 항체 검출 의 사용 및 이미지 분석을 설명하여 서양 얼룩 기술에 대한 개요를...

형질전환은 DNA 및 이중 좌초 RNA와 같은 유전 물질을 포유류 세포에 삽입하는 과정입니다. 세포내 DNA를 삽입하면 세포소유의 기계를 사용하는 단백질의 발현 또는 생산이 가능하지만, RNA를 세포로 삽입하는 것은 번역을 중단함으로써 특정 단백질의 생산을 다운조절하는 데 사용된다. 트랜스페드 RNA를 위한 작용의 사이트는 세포질인 동안, DNA는 효과적인 transfection를 위해 핵으로 수송되어야 합니다. 그곳에서 DNA는 단기간 동안 일시적으로 발현되거나, 갈라질 때 세포에서 세포로 전환되는 게놈 DNA에 통합될 수 있다. 이 비디오는 화학 매개 트랜스페션의 기본을 설명하고 충전된 지질, 폴리머 및 칼슘 인산염을 포함하여 가장 일반적으로 사용되는 시약의 일부를 소개합니다. 각 단계는 경질 효율의 분석을 통해 형질 전달을 위한 세포의 준비에서 기술됩니다. 추가적으로, 이 비디오 기사의 응용 단면도는 포유류 세포로 핵산을 소개하기 위한 대체 방법으로 전기기와 생물권 형...

분자 생물학에서, 결찰은 인포디스터 결합의 형성을 통해 2개의 DNA 단편의 결합을 말합니다. 리구아제로 알려진 효소는 결찰 반응을 촉매한다. 세포에서, 리갈은 DNA 복제 도중 생기는 단 하나 및 이중 가닥 나누기를 복구합니다. 실험실에서 DNA 리구슬은 분자 복제 중에 벡터와 삽입의 DNA 단편을 결합하는 데 사용됩니다 - 숙주 유기체에서 표적 단편을 복제할 담체 DNA 분자. 이 비디오는 DNA 결찰에 대한 소개를 제공합니다. 결찰의 기본 원리는 일반화된 결찰 반응을 설정하기 위한 단계별 절차뿐만 아니라 설명된다. 결찰 반응의 중요한 양상은 끈적끈적한 말돌출의 길이가 반응 온도에 어떻게 영향을 미치는지, DNA 삽입의 비율이 벡터에 대한 비율을 어떻게 조정해야 하는지와 같이 논의된다. 클레나우 단편 및 새우 알칼리인스파타제(SAP)와 같은 결찰을 지원하는 분자 도구가 언급되고, 근접 결찰 및 시퀀싱을 위한 조각에 링커를 추가하는 등의 응용 분야도 제시된다.

제한 효소 또는 엔도누리스는 특정 서열에서 DNA를 인식하고 절단합니다. 이 효소는 박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지에 대한 방어로 박테리아에서 자연적으로 발생합니다. 세균 제한 효소는 메틸 그룹의 첨가로 인해 세균성 게놈 DNA를 손상시키지 않고 침입하는 박테리오파지 DNA를 절단합니다. 이 비디오는 제한 효소의 명명 방법과 인식 사이트 및 존재하는 오버행의 유형을 포함하여 제한 효소의 기본 원리를 설명합니다. 또한 필요한 구성 요소, 혼합물을 조립해야 하는 순서 및 전형적인 배양 온도 및 시간을 포함하여 제한 다이제스트를 설정하는 방법에 대한 단계별 일반화 절차가 제공됩니다. 스타 활성을 방지하기 위해 제한 효소를 비활성화하는 것이 중요하다는 것이 언급된다. 소화 반응에 있는 다중 효소를 능력을 발휘하고 대조군을 사용하기 위한 팁도 제공됩니다.

분자 복제는 재조합 DNA를 벡터에 삽입하는 데 사용되는 일련의 방법입니다 - 숙주 유기체에서 재조합 DNA 단편을 복제할 DNA 분자의 담체. 유전자일 지도 모르다 DNA 단편은, 대핵계 또는 진핵 시편에서 분리될 수 있습니다. 관심 있는 단편을 분리한 후, 또는 삽입, 벡터와 삽입모두 제한 효소로 절단하고 정제되어야 한다. 정제 된 조각은 결찰이라는 기술을 가지고 결합됩니다. 결찰 반응을 촉매하는 효소는 리게아제라고 합니다. 이 비디오는 전체 분자 복제 절차를 구성하기 위해 결합되는 주요 방법을 함께 설명합니다. 분자 복제의 중요한 양상은 분자 복제 전략의 필요성과 변형 된 박테리아 식민지를 추적하는 방법과 같이 논의됩니다. 인서트가 있는 경우 소화 및 시퀀싱이 제한되는 것을 확인하는 것과 같은 검증 단계도 언급된다.