Name: 작은 분자 CLT1 펩타이드 표적 조영제와 전립선 암의 MR 분자 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 학습하세요 생쥐 전립선암의 분자 영상 기법으로 CLT1 펩타이드 표적 MRI 조영제를 활용하여 종양을 특이적으로 검출하는 방법입니다. 이 기술은 고해상도 영상으로 정확한 진단에 기여합니다.

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이 작품은 미국 심장 협회 (American Heart Association) GRA 봄 09 박사후 (09POST2250268)와 NIH R01 CA097465에 의해 부분적으로 지원됩니다. 우리는 매우 종양 주입에 그녀의 도움 박사 웬 리 박사 VIKAS Gulani MRI 프로토콜 테스트 및 설정, 그리고 양 이본 파커를 주셔서 감사합니다.

프로토콜은 이전의 연구 11에서 적응. 1. CLT1 펩타이드에 GD-DOTA의 활용 <ol><li> 표준 고상 펩티드 합성을 사용하여, 2 - 클로로 트라이 틸 클로라이드 수지 (1.0 밀리몰)를 고체상 합성에 보호 된 아미노산으로부터 CLT1 펩티드 (CGLIIQKNEC)를 합성한다. </li><li> 최종 아미노산을 추가 한 후, 2 시간 동안 0 ℃에서 DMF의 탈륨 (III) 트리 플루오로 아세테이트 (1.09 g, 2.0 밀리몰, 2 당량)와 온 - 수지 선형 펩타이드 (20 ㎖)을 고리 화. </li><li> 다음에, 공액 PEG와의 Fmoc-NH-PEG-COOH (3.0 밀리몰)를 고체상 합성리스 (의 Fmoc)-OH (3.0 mmol)을 순차적으로 반응시켜 수지에 CLT1 펩티드 (1.0 밀리몰)의 N-말단에 라이신 순차적 및 고체상 합성리스 (의 Fmoc)-OH (6 밀리몰)의 두 번째 배치. </li><li> 피 페리 딘과 고체상 합성을 제거합니다. DOTA - 트리스 (T-샘프) (4.58 g, 각 아미노기 8.0 밀리몰, 2 당량)를 2 시간 동안 수지에 라이신 덴드리머에서 4 개의 무료 아민과 반응을 추가합니다. </li><li> 마지막으로, 절단 및 탈 보호 제품트리 플루오로 아세트산, 물, 그리고 실온에서 8 시간 동안 triisobutylsilane (TIS) (20 ㎖, 95/2.5/2.5)의 칵테일로 처리하여 수지에서. 트리 플루오로 아세트산 (TFA)로 세척 한 다음 여과하여 수지를 제거한다. 결합 된 여과 액이 차가운 에틸 에테르 (200 ㎖), 원심 분리기에 적가 추가, 에틸 에테르 배, 세척. 무색 고체 (1.99 g, 수율 61 %)을 수득 진공 하에서 말린다. </li><li> 10 분 동안 용매에 20 분 및 40-90% 용매 B위한 0-40% 용매 B의 구배 용매에서 (아세토 니트릴 중 0.1 % TFA) (0.1 % TFA 수용액)을 사용하여 분 취용 HPLC로 조 생성물을 정제 . </li><li> CLT1-DL-(DOTA) DI 물에 4 (250 ㎎, 0.077 mmol)을 (15 ml)에 용해시키고, 1 M 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 6으로 조정합니다. 하나님 (OAC) 3 .4 H 2 O 추가 (472 밀리그램, 0.462 밀리몰, DOTA 모노 아미드 1.5 당량) 솔루션 부분에서, 1 M 수산화 나트륨을 사용하여 6시에 pH를 유지하면서. 48 시간 동안 RT에서 반응 용액을 교반 하였다. </li><li> 복잡한 전자와 잔류 하나님 (III)thylenediaminetetraacetic 아세트산 (EDTA) (90 ㎎, 0.31 밀리몰), 및 최종 생성물보기 CLT1-DL-(GD-DOTA) 4 (169 ㎎, 57 %)을 수득 크기 배제 컬럼으로 조질 생성물을 정제. </li></ol> 2. 대조 대리인의 특성 <ol><li> 유도 결합 플라즈마 광 방출 분광법 하나님 (III) 함량을 측정. </li><li> 매트릭스 2,5 - 디 히드 록시 산 (2,5-DHB)과 선형 모드에서 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 (MALDI-TOF) 질량 스펙트럼을 획득. </li><li> relaxometer로 CLT1-DL-(GD-DOTA) 4의 조영제 및 nontargeted 조절제 60 메가 헤르츠 (1.5 T)에서 서로 다른 농도를 가진 sCLT1-DL-(GD-DOTA) (4)의 수용액의 휴식 시간을 측정 37 ° C에서 이 T를 측정하기 위해 500 에코와 T (1) 및 카 - 퍼셀-카르 · 퍼 어셀 · 메이 붐 · 길 서열을 측정하기 위하여 반전 복구 펄스 시퀀스를 사용한다. T 1과 T에게 일의 2 relaxivities을 계산하나님의 농도에 비해 1 / T 1과 1 / T 2의 플롯의 슬로프에서 전자 에이전트. </li></ol> 3. 동소 PC3 전립선 종양을 가진 동물 모델의 세포 배양 및 개발 <ol><li> / μL PBS 2.5 × 10 4 세포의 밀도 5 % 소 태아 혈청 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 / fungizone, 트립신 처리하여 수확에 resuspend 보충 RPMI 배지에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 제정 식 문화 PC3 전립선 암 세포. </li><li> CWRU 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 동물의 프로토콜에 따라 무 흉선 동물 핵심 시설, 케이스 웨스턴 리저브 대학 (CWRU)에서 (4-5 주 이전) 남성 NIH 흉선 누드 마우스를 유지한다. </li><li> 수술 표면은 2 % 클로르헥시딘 용액을 분무 한 후 흡수성 커튼으로 덮여 있었다. 무균 수술 장갑이 절차를 수행하는 동안 착용했다. 동물 수술 전에 IP는 anesthetiz에 에버 틴 (250 ㎎ / ㎏)을 주입쥐를 전자. 대안 적으로, 케타민 / 자일 라진 / 아세 프로 마진은 50/5/1 ㎎ / kg의 농도로 사용될 수있다. 안과 용 연고 마취 중에 적절한 수분을 유지하는 마우스에 적용 하였다. </li><li> 멸균 메스를 사용하여 약 1 ㎝의 길이로 낮은 중간 선을 따라 피부와 복막을 통해 작은 절개를 절단하여 수술을 시작합니다. 무균 수술 드레이프가 생존 수술시 절개 주위에 덮여 있었다. </li><li> 조심스럽게 외면 화하다 전립선을 노출하는 전립선 등의 엽 (叶)을 안정화. 30 게이지 바늘을 전립선에 PBS (20 μL)에 PC3-GFP 세포의 현탁액을 주입한다. 마지막으로 12 autoclip 상처 절개를 닫습니다. </li><li> 시술 후 모니터링을 위해 1 주일 동안 하루에 두 번 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 질병의 증상은 식사의 부족, 요도 주위에 어두운 소변 수집 및 스테이플에서 방광의 감염이나 폐색을 나타낼 수 불안정한 보행이 (가) 있습니다. </li><li> 10 일 이후, t 제거그는 스테이플 스테이플 리무버를 사용. 종양의 크기와 체중 감소, 행동 편차, 모터 결함으로 고통의 증거를 평가하기 위해 매일 동물을 모니터링합니다. 종양 성장 동안 통증 윤리적으로 허용 한계를 초과하거나 증거 종양 크기를 보였다 동물을 안락사. </li></ol> 4. 형광 이미징 및 조직학을 가진 펩타이드의 종양 결합 특이성 확인 <ol><li> 종양 세포 접종 후, 종양 성장의 약 사주 촬상로 시작하기 전에 허용한다. 종래 펩티드 탐침 주사로 종양의 존재를 확인하기 위해 형광 이미 저에서 방송 쥐 GFP 형광 이미지를 획득. </li><li> IV 텍사스 레드가 10 nmol의 / 마우스의 복용량에서 마우스 베어링 종양에 펩티드를 표시 주입. </li><li> 자궁 전위에 의해 나중에 마우스 2 시간을 희생, 종양 및 주요 장기를 수집하고, 형광 이미 저에 즉시 이미지. GFP (여기에 녹색 빛을 필터를 사용 : 444-490 뉴 멕시코, 방출 : 515 nm의 긴 패스 필터, 인수 설정 : 500-720 10 nm의 단계)와 텍사스 레드 (여기에 대한 붉은 빛 필터 : 576-621 nm의; 방출 : 635 nm의 긴 패스 필터; 획득 설정 : 630-800 10 nm의 단계). GFP와 텍사스 레드 150 밀리 초 10 밀리 초 노출 시간. </li><li> 즉시 전체 조직의 형광을 측정 한 후, 종양 조직을 수집 포르말린으로 고정하고, 동결 절단 (Cryosections) 5 μm의 조각으로. </li><li> PBS로 세정 한 후, 즉시 공 초점 레이저 스캐닝 현미경에 4를 함유하는 장착 매체의 한 방울 &#39;,6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI), 화상 마운트. </li></ol> 5. 자기 공명 영상 (MRI) <ol><li> 약 사주 종양 세포 접종 후 종양이 직경 0.3 ~ 0.6 cm까지 자랄 수 있습니다. MRI 연구하기위한 음량 무선 주파수 (RF) 코일 (7) T MRI 스캐너를 사용한다. </li><li> 이소 플루 란 유도 챔버 내의 2 % 이소 플루 란 산소 혼합물로 마우스를 마취. OPHthalmic 연고 마취 중에 적절한 수분을 유지하는 마우스에 적용 하였다. </li><li> 헤파린 식염수로 채워진 1.0 m 길이의 튜브에 30 게이지 바늘을 삽입합니다. 마우스의 꼬리 정맥에 직접 만든 카테터를 놓습니다. </li><li> 자석에 마우스를 올려 놓고 코 콘을 통해 1.5 %의 이소 플루 란 산소와 흡입 마취 유지. </li><li> 속도와 호흡의 깊이를 모니터 할 수있는 복부의 모니터링 시스템에 연결된 호흡 센서를 놓습니다. 피드백 제어 시스템을 통하여 자석에 더운 공기를 불어 넣어 37 ° C에서 체온을 유지한다. </li><li> 종양의 위치 (TR / TE는 = 200/3.7 밀리 초, FOV를 = 식별하기 위해 지역화 시퀀스를 사용하여 시상 ​​부분 이미지로 시작하는 3.0 cm, 슬라이스 두께 = 2.2 mm, 슬라이스 번호 = 16, 평균 = 2, 플립 각도 = 45 °, 매트릭스 = 128 X 128). </li><li> CE-MRI (TR / TE = 151.2/1.9 밀리 초, FOV = 3.0 cm X 3.0 cm, 용 2D 축 이미지를 얻기위한 차원 T1 강조 그라데이션 지방 억제 시퀀스를 사용의이가 두께 = 1.2 mm, 슬라이스 번호 = 12, 평균 = 1, 플립 각도 = 80 °, 매트릭스 = 128 X 128). </li><li> 미리 주입 기준 MR 이미지 수집 한 후, 생리 식염수 200 μL로 세척하여 0.03 밀리몰 하나님 / kg의 투여 량에서 대상 에이전트 또는 제어 에이전트를 주입하기 시작한다. </li><li> 최대 30 분 동안 서로 다른 시간 지점에서 CE-MRI의 영상을 얻기 위해 계속합니다. </li></ol> 6. 이미지 처리 및 분석 <ol><li> 이미지 분석을 위해 이미징 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 두 차원 영상 평면에서 전체 종양에 관심 (로아)의 지역 및 신장을 그리고 평균 신호 강도를 측정한다. </li><li> (S 0 - ΔSNR = (S t / σ T) : CE-MRI 데이터를 정량화하기 위해, 다음과 같은 식을 이용하여 사전에 대비 SNR에 포스트 대비 SNR의 증가의 계산에 의한 종양 또는 신장 대비 향상 (ΔSNR)을 측정 / σ 0), S 0, S는 T 죽을 차례에 신호를 나타내는 곳또는 또는 신장 전과 대비, σ 0 및 σ의 t 후의 콘트라스트 전후 배경 공기로부터 측정 잡음의 표준 편차이다. </li><li> P &lt;0.05에서 통계적으로 유의 한 가정 학생의 양측 t-검정을 사용하여 P 값을 계산합니다. </li></ol>

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<li>Amirbekian, V., Aguinaldo, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+matrix+metalloproteinases%3A+experimental+molecular+MR+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and matrix metalloproteinases: experimental molecular MR imaging in vivo.</a> Radiology. 251, 429-438 (2009).</li>
<li>Overoye-Chan, K., Koerner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EP-2104R%3A+a+fibrin-specific+gadolinium-Based+MRI+contrast+agent+for+detection+of+thrombus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 6025-6039 (2008).</li>
<li>Pilch, J., Brown, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+selected+for+binding+to+clotted+plasma+accumulate+in+tumor+stroma+and+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2800-2804 (2006).</li>
<li>Rohrer, M., Bauer, H., Mintorovitch, J., Requardt, M., Weinmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+magnetic+properties+of+MRI+contrast+media+solutions+at+different+magnetic+field+strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of magnetic properties of MRI contrast media solutions at different magnetic field strengths.</a> Invest. Radiol. 40, 715-724 (2005).</li>
<li>Wu, X., Burden-Gulley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+a+peptide+targeted+small+molecular+Gd-DOTA+monoamide+conjugate+for+MR+molecular+imaging+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of a peptide targeted small molecular Gd-DOTA monoamide conjugate for MR molecular imaging of prostate cancer.</a> Bioconjugate Chem. 23, 1548-1556 (2012).</li>
<li>Burden-Gulley, S. M., Gates, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+molecular+diagnostic+of+glioblastomas%3A+detection+of+an+extracellular+fragment+of+protein+tyrosine+phosphatase+mu%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A novel molecular diagnostic of glioblastomas: detection of an extracellular fragment of protein tyrosine phosphatase mu.</a> Neoplasia. 12, 305-316 (2010).</li>
<li>McBride, J. 	D., Birgit, H., Leatherbarrow, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resin-coupled+cyclic+peptides+as+proteinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide%22%5BJournal%5D)">Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors.</a> Protein and Peptide. 3 (3), 193-198 (1996).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

중요한 단계 적절한 바이오 마커 및 작은 펩티드를 표적의 선택 성공적으로 작은 크기의 대상 조영제를 개발하기 위해, 두 가지 중요한 점은 고려 될 필요가있다. 첫째, 정상 조직에 약간의 존재와 병에 걸린 조직에 풍부하게 존재하는 적절한 분자 생체를 선택하는 것이 중요합니다. 우리의 선택 암 관련 바이오 마커, 응고 된 혈장 단백질은 이러한 요구 사항을 충족합니다. 충분한 대비 요원이 충분히 대비 향상의 결과로, 이러한 대상에 바인딩 할 수 있도록 두 번째로 선택한 대상 작은 분자 에이전트는 생체에 대한 높은 결합 친 화성이 있어야합니다. 이 연구에서, 우리는 종양 (11)의 응고 된 혈장 단백질에 결합하는 강한 별을 보여줍니다 응고 바인딩 펩타이드 CLT1을 선택했다. 에이전트 합성에게 대조 ...

암 관련 분자 표적의 유효 촬상 이전 암 탐지와 진단의 정확성을 향상시키기 위해 큰 의미이다. 자기 공명 영상 (MRI)은 높은 공간 해상도와 더 이온화 방사선 1 강력한 임상 영상 기법이다. 그러나, 대상 조영제 임상 MR 암 분자 영상에 사용할 수 없습니다. 대상으로 MRI 조영제의 혁신적인 디자인과 개발은 크게 MR 암 분자 영상의 응용 프로그램을 진행한다. 상당한 노력이 암 세포의 표면에 발현 생체 MR 이미징을위한 대상으로 조영제를 개발하는되었습니다. 때문에 MRI 이러한 바이오 마커의 낮은 농도의 상대적으로 낮은 감도, 그것은 작은 분자 표적 조영제 2,3를 사용하여 효과적인 MR 분자 영상에 대한 충분한 대비 향상을 생성하는 도전이다. 충분한 향상을 얻기 위해서는, 다양한 전달 시스템 suc에성체의 하나님 (III) 킬레이트의 높은 페이로드 리포좀, 나노 입자와 고분자 복합체로 H 대상 사이트 4,5에서 조영제의 국소 농도를 증가시키기 위해 작성되었습니다. 이러한 전달 시스템은 동물 모델에서 중요한 종양 강화를 생성 할 수 있었지만, 그들의 큰 크기는 심각한 안전 문제 6의 원인이 독성 하나님 (III) 이온의 오랜 축적의 결과로, 몸에서 느리고 불완전한 제거로 만들었습니다. 최근 일부 연구는 분자 영상을위한 MRI의 한계가 병변에서 높은 지역의 표현으로 적절한 분자 바이오 마커를 선택하고 쉽게 7,8를 배출 할 수있는 작은 분자 에이전트를 사용하여 극복 할 수있는 것으로 나타났습니다. 이 에이전트의 주요 특징은 정상 조직에 약간의 존재와 병에 걸린 조직에 풍부하게 존재하는 분자 마커를 대상으로하고 있다는 것입니다. 조영제의 높은 농도는 충분한, 그 결과, 이러한 대상에 바인딩 할 수 있습니다효과적인 MR 분자 영상에 대한 cient 대비 향상. 그들의 크기가 신장 여과 임계 값보다 작기 때문에, 언 바운드 조영제 좀처럼 감소 배경 잡음으로 신체로부터 배출 될 수있다. 우리는 풍부하게 종양의 기질에 존재하는 보편적 인 암 관련 바이오 마커, 응고 혈장 단백질을 선택하고, 정상 조직 9 드물게 존재했다. 우리는 강한 PC3 전립선 암 모델 (10)에 특이 적으로 결합, 4 GD-DOTA 모노 아미드 킬레이트를 보였다 작은 표적 펩타이드 CGLIIQKNEC (CLT1)를 포함하는 대상 조영제를 합성. 여기, 우리는 생쥐의 종양을 감지하는 MR 암 분자 이미징을위한 방법론을 제공한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Fmoc protected amino acids</td><td>EMD Chemicals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOTA-tris(t-Bu)</td><td>TCI America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyBOP, HOBt, HBTU</td><td>Nova Biochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red, succinimidyl ester, single isomer</td><td>Invitrogen</td><td>T20175</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENTS</td></tr><tr><td>Agilent 1100 HPLC 시스템</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICP-&#8211; S Optima 3100XL</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF 질량 분석기</td><td>Bruker</td><td>AutoflexTM Speed</td><td></td></tr><tr><td>Maestro FLEX In Vivo 이미징 시스템</td><td>Cambridge Research Instrumentation, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biospec 7T MRI 스캐너</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

작은 분자 clt1 펩타이드 표적 조영제와 전립선 암의 mr 분자 영상

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

종양 세포 외 기질 (extracellular matrix)은 암의 분자 이미징을위한 바이오 마커로 사용할 수 있습니다 암 관련 단백질의 풍부한 있습니다. 이 작품에서 우리는 종양의 기질에 응고 된 혈장 단백질에 특정 대상으로 MRI 조영제로 GD-DOTA 모노 아미드 복합 대상 작은 분자 펩타이드 효과적인 MR 암 분자 영상을 보여 주었다. 우리는 마우스 동소 PC-3 전립선 암 모델에서 MRI와 전립선 종양의 비 침습 검출 제의 효과를 평가하는 실험을 수행 하였다. 타겟 조영제 0.03 밀리몰 하나님 / kg의 낮은 투여 량으로 상당한 종양 콘트라스트 개선을 생산하는데 효과적이었다. MRI 조영제를 대상으로 펩타이드는 전립선 종양의 MR 분자 영상에 대한 약속한다.

도 1은 타겟 조영제 CLT1-DL-(GD-DOTA) 4 및 실험의 전반적인 구조의 합성을 도시한다. 임상 GD-DOTA (표 1)보다 CLT1-DL-(GD-DOTA) 4는 훨씬 더 완화도. 1.5 T에서 PBS에 CLT1-DL-(GD-DOTA) 4 (산도 7.4)의 가돌리늄 당 T 1 완화도는 GD-DOTA (10)보다 약 3 배 높은 수준이다. 비특이적이 (sCLT1-TR)는 (그림 2) 바인딩 아주 작은 종양을 보여줍니다 펩타이드 스크램블 동안 마에스트로 영상은, 레드 정상 장기와 조직에 작은 바인딩 종양에 CLT1 (CLT1-TR)로 표시 텍사스의 결합이 강한 특정을 확인합니다. 그림 3은 일반적인 사전을 보여주고 향상된 포스트 분사 대비 (CE) T 1 강조 영상. 대상 에이전트가 아닌 대상 스크램블 에이전트에 ...

쥐 전립선 암 모델에서 종양 침윤에 응고 된 혈장 단백질에 특정한 MRI 조영제를 대상으로 작은 펩티드와 암 MR 분자 이미징을 입증.

작은 분자 CLT1 펩타이드 표적 조영제와 전립선 암의 MR 분자 영상

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 안전하고 효과적인 펩타이드 조영제를 사용하여 자기공명영상(MR)으로 마우스 전립선암의 분자 영상을 촬영하는 것입니다. 우선, 전립선종양 마우스 모델에서 정위 전립선 종양의 성공적인 형성 및 적절한 크기를 확인합니다. 그다음, 마우스 정위 전립선암 모델에서 형광 영상 및 조직학적 분석을 통해 펩타이드의 종양 결합 특이성을 검증합니다.그 후, 사전 주입 기선 MR 영상 획득이 완료되면 표적 또는 대조제를 주입합니다. 마지막으로, 최대 30분 동안 서로 다른 시점에서 조영 증강 MR 영상을 획득합니다. 결과적으로, CLT one 펩타이드 표적 RI 조영제가 분자 MR 영상 기술을 통해 전립선 종양의 특이적 검출에 효과적일 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.표적 MI 조영제를 이용한 분자 MRI의 주요 장점은 임상 조영제를 사용한 기존의 MRI 및 PET-MRI 기술과 달리, 단일 영상 기법만으로 전립선 종양의 효과적이고 향상된 고해상도 영상을 제공할 수 있다는 점입니다. 이를 본 실험에서 입증하겠습니다. 종양 세포외 기질에 풍부한 바이오마커를 선택하고 저분자 표적 MI 조영제를 사용함으로써 전립선 종양의 효과적인 분자 MRI 영상을 얻을 수 있습니다. 또한, 종양의 고품질 MRR 영상을 얻기 위해서는 동물 취급 및 꼬리 캐뉼라 삽입, MRI 조작에 관한 숙련된 기술이 매우 중요합니다. 표준 고상 펩타이드 합성법을 사용하여, 여기에 표시된 것과 같이 GD DOTA 모노아미드 복합체를 합성하고 특성을 분석하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 PC 3G FP 전립선 종양 동물 모델을 제작한 후, 유도 챔버 내의 산소 및 2% isoflurine으로 마우스를 마취시키고 꼬리 집기(tail pinch)를 통해 진정 상태를 확인하십시오.그 다음, 형광 이미저를 사용하여 마우스 내 종양의 존재를 확인합니다. 종양이 형성된 마우스에 Texas red가 표지된 펩타이드를 마우스당 10 mol씩 주입합니다. 2시간 후, 경추 탈골법으로 마우스를 희생시킨 뒤 종양과 주요 장기를 적출하여 즉시 형광 이미저로 촬영합니다.다음으로, 종양 조직을 포르말린으로 고정하고 5 µm 두께로 동결 절편을 만든 후, DPI가 포함된 봉입제를 한 방울 사용하여 조직을 봉입합니다. 그런 다음 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscopy)을 사용하여 슬라이드를 촬영합니다. 접종 후 약 4주가 지나면 종양의 직경이 0.3 ~ 0.6 cm까지 성장해야 합니다. 유도 챔버에서 2% isoflurane/산소 혼합 가스로 마우스를 마취시킨 후, 안연고를 도포하여 마우스의 눈에 수분을 유지하고 꼬리 꼬집기 반응을 통해 진정 상태를 확인합니다.다음으로, 헤파린 처리된 식염수가 채워진 1m 길이의 튜브에 30 gauge 바늘을 삽입합니다. 그런 다음 볼륨 무선 주파수 코일이 장착된 70 MRI 스캐너를 사용하여 자체 제작한 카테터를 마우스 꼬리 정맥에 거치합니다. 마우스를 자석 내부에 위치시킨 후 노즈콘을 부착하고, 호흡 속도와 깊이를 모니터링하기 위해 산소에 1.5% isof fluorine을 혼합하여 투여합니다.모니터링 시스템에 연결된 호흡 센서를 동물의 복부에 부착하십시오. 마그넷 내부로 온풍을 지속적으로 공급하여 동물의 체온을 37 °C로 유지하십시오. 이제 동물을 MRI에 넣어 종양의 위치를 확인하십시오.국소화 시퀀스를 사용하여 시상면 단면 영상부터 시작합니다. 다음으로, 조영 증강(CE) MRI를 위해 2 DT 1 가중치 경사 지방 억제 시퀀스를 사용하여 2D 축상면 영상을 획득합니다. 종양의 기저 영상을 획득한 후, kg당 0.03 millimoles의 gadolinium 용량으로 표적 제제 또는 대조 제제를 주입하기 시작합니다.종양 전체를 완전히 포함하여 영상을 획득할 수 있도록 최대 30분 동안 서로 다른 시점에서 CE MRI 영상을 지속적으로 획득합니다. 영상 촬영이 완료된 후 12개의 슬라이스를 수집하고, 이산화탄소로 동물을 안락사시킨 후 여기에 제시된 텍스트 프로토콜에 따라 영상을 분석 및 처리합니다. Maestro 영상 촬영 결과, Texas red로 표지된 CLT one이 정상 장기 및 조직에는 거의 결합하지 않고 GFP PC three 종양에 강력하고 특이적으로 결합함을 확인하였습니다. 반면, 비특이적 scrambled 펩타이드는 종양 결합력이 매우 낮게 나타납니다.이 그림은 전형적인 주입 전 및 후의 조영 증강 T1 강조 영상을 보여줍니다. 표적 제제는 표적화되지 않은 스크램블 제제에 비해 종양 조직에서 더 강하고 오래 지속되는 조영 증강을 나타냅니다. 방광 내 조영 증강이 시간이 지남에 따라 점진적으로 증가하는 것은 조영제가 신 여과를 통해 배설되었음을 나타냅니다.정량적 신호 분석 결과, 표적 제제가 대조 제제보다 종양 조직에서 최대 30분까지 더 유의미한 신호 증강을 유도하는 것으로 나타났습니다. 생체 분포 연구 결과, 주입 2일 후 주요 장기와 조직에서 제제의 가돌리늄 잔류가 최소화됨을 확인하였습니다. 본 예비 연구는 CLT one 표적 MRI 조영제가 상대적으로 낮은 용량으로도 종양에 특이적으로 전달될 수 있음을 보여줍니다.네, 본 실험을 통해 종양 미세환경 내에 풍부하게 존재하는 적절한 바이오마커를 선택하고 저분자 표적 MRI 조영제를 사용함으로써 전립선암의 효과적인 분자 MRI 촬영이 가능하다는 것을 입증하였습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 표적 MRI 조영제를 이용하여 동물 모델의 작은 악성 종양에 대한 효과적인 분자 MRI 기법을 어떻게 개발하는지에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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