DNA 겔 전기 영동

DNA 젤 전기 포근은 크기에 따라 DNA 단편을 분리하고 식별하는 데 사용되는 기술입니다.

다양한 크기의 DNA 단편은 적조류에서 발견되는 탄수화물인 아가로즈로 만든 다공성 젤에 적재됩니다.

전기장이 적용되면 DNA 뉴클레오티드의 음전하 인산염 군 덕분에 단편이 젤을 통해 이동합니다.

DNA의 작은 조각은 젤 매트릭스를 통해 이동하는 더 어려운 시간이 큰 파편보다 젤을 통해 더 쉽게 마이그레이션됩니다.

젤 실행이 완료되면 DNA 샘플의 위치는 DNA 사다리라고 하는 알려진 크기의 일련의 단편 또는 밴드와 비교할 수 있습니다.

그런 다음 테스트 샘플의 상대위치를 사다리 의 조각과 비교하여 결정되는 크기에 따라 관심 있는 조각의 존재를 확인할 수 있습니다.

아가로즈 젤은 볼륨 백분율 용액에 비해 무게를 사용하여 제조됩니다. 그래서 버퍼 100 ml의 아가로즈 1 그램은 1 % 젤을 만들 것입니다. 낮은 퍼센트 젤은 더 큰 조각을 더 잘 해결하고 더 높은 퍼센트 젤은 더 작은 조각을 쉽게 식별할 수 있게 합니다. 젤 만들기 절차를 시작하려면 적절한 아가로즈 덩어리를 Erlenmeyer 플라스크로 계량하십시오.

버퍼 의 양이 플라스크 용량의 1/3보다 크지 않도록 플라스크에 실행 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 소용돌이를 섞습니다.

최대 전력으로 전자레인지에 가열하여 아가로즈/버퍼 혼합물을 녹입니다. 30초마다 플라스크를 제거하고 내용이 잘 섞이도록 소용돌이합니다. 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 반복합니다.

다음으로 에디듐 브로마이드를 0.5 mg/ml의 농도에 추가합니다. 에티듐 브로마이드는 DNA의 개별 기본 쌍 사이에 맞는 방향족 화합물, 또는 인터캐레이터, 그리고 DNA가 UV 빛 의 밑에 강렬한 오렌지 형광을 방출하는 원인이 됩니다. 에티듐 브로마이드는 발암 물질이므로 이 화합물을 함유한 젤을 취급할 때 장갑을 착용해야 합니다.

젤 트레이가 뒤틀림을 방지하기 위해 65ºC 수조에 배치하여 아가로즈를 시원하게 하십시오.

아가로즈가 냉각됨에 따라, 젤 트레이를 주조 장치에 배치하여 겔 몰드를 준비한다. 대안으로 테이프를 사용하여 젤 트레이의 열린 가장자리를 밀봉하여 금형을 만들 수 있습니다. 젤에 빗을 놓는 것은 DNA가적재되는 우물을 만듭니다. 빗이 DNA 샘플에 적합한 크기의 우물을 만들 지 확인하십시오.

용융 아가로즈를 젤 몰드에 붓고 실온에서 굳어둡시 합니다.

아가로즈가 굳어진 후 빗을 꺼내라. 젤을 즉시 사용하지 않을 경우 플라스틱 랩에 싸서 사용할 때까지 4ºC에 보관하십시오.

젤을 즉시 사용할 경우 젤 상자에 놓습니다.

이 절차를 시작하려면 분리될 DNA 샘플에 젤 로딩 염료를 추가합니다. 로딩 염료는 일반적으로 6X 농도로 만들어집니다. 염색을 로드하면 샘플을 유정에 시각화하고 로드하는 데 도움이 되며 실행 중에 샘플이 마이그레이션된 정도를 결정하는 데 도움이 됩니다.

전원 공급 장치를 원하는 전압으로 설정합니다.

이제 젤 상자에 충분한 실행 버퍼를 추가하여 젤 표면을 덮습니다. 젤을 준비하는 데 사용되는 버퍼와 동일한 실행 버퍼를 사용해야 합니다.

젤 박스의 리드를 전원 공급 장치에 연결하고 켭니다. DNA는 음전하이며 양극쪽으로 이동하여 긍정적이고 일반적으로 색이 적다는 것을 기억하십시오. 검은 색 리드 또는 음극을 젤 상자의 바닥에 연결하지 않도록 하십시오. 그래서 당신은 검은 고양이가 불운, 또는 부정적인 것을 명심, 잊지 마세요, 따라서 검은 CAThode는 부정적이다. 젤을 빨간색으로 실행하거나 양극을 실행합니다. 젤 박스와 전원 공급 장치가 모두 작동하는지 확인하려면; 전극에서 기포의 모양은 전류가 통과하고 있음을 나타냅니다.

젤 박스의 뚜껑을 제거합니다. DNA 샘플을 천천히 조심스럽게 젤에 적재합니다. 다시 말하지만, 샘플의 적재 염료는 샘플이 젤로 가라앉을 수 있게 하고 샘플이 얼마나 멀리 이동했는지 추적하는 데 도움이 될 것입니다. DNA 크기 마커 또는 사다리는 항상 실험 샘플과 함께 로드되어야 합니다.

뚜껑을 교체합니다. 전극이 전원 공급 장치의 올바른 슬롯에 연결되어 있는지 다시 확인합니다.

전원을 켭니다. 염료가 적절한 거리로 마이그레이션될 때까지 젤을 실행합니다.

전기 전도가 완료되면 전원 공급 장치를 끄고 젤 상자의 뚜껑을 제거하십시오.

젤 상자에서 젤을 제거하고 젤 표면에 과도한 버퍼를 배출합니다. 젤 트레이를 종이 타월에 놓아 남은 러닝 버퍼를 흡수합니다.

DNA 조각을 시각화하려면 젤 트레이에서 젤을 제거하고 젤을 자외선에 노출시하십시오.

DNA 단편은 주황색 형광 밴드로 나타나야 합니다. 젤 사진을 찍습니다.

실험이 끝나면 기관 규정에 따라 젤과 실행 버퍼를 적절히 폐기하십시오. 다시 말하지만, 항상 에디듐 브로마이드 노출을 피하기 위해 장갑으로 젤과 실행 버퍼를 처리해야합니다.

이제 DNA 젤 전기 전구를 수행하는 방법을 보았습니다. 이 매우 유용한 방법의 일부 다운스트림 응용 프로그램과 변형을 살펴보겠습니다.

여기서 PCR 제품을 분리한 후 아가로즈 젤 전기전도 결과를 볼 수 있습니다. 젤에 로드된 DNA 단편은 명확하게 정의된 밴드로 볼 수 있습니다. DNA 표준 또는 사다리는 샘플 밴드의 크기의 유용한 측정을 허용하는 정도로 분리되어야합니다. 이 예에서, 765개의 염기 쌍, 880개의 염기 쌍 및 1022개의 염기 쌍의 DNA 단편은 2-log DNA 사다리를 가진 1.5% 아가로즈 젤에 분리된다.

DNA 단편의 존재를 확인하는 것 외에도 DNA 겔 전기포고는 겔 정화 절차와 결합될 수 있다. 전형적으로 면도날은 관심 있는 DNA 단편을 잘라내어 수집될 수 있고 그 안에 있는 DNA 샘플을 회수하는 데 사용됩니다.

아가로즈 젤 전기전하증은 또한 전기전구분리 시료에서 방사성 프로브가 특정 DNA 또는 RNA 서열을 식별하는 데 사용될 수 있는 셀룰로오스 막으로 전송하는 DNA 또는 RNA를 허용하는 전이 블로팅과 결합될 수 있다.

표준 DNA 젤 전기포고는 게놈 DNA와 같은 크기가 15-20 kb보다 큰 고분자 DNA의 분리에 이상적이지 않다. 큰 DNA 샘플을 분리하기 위하여는, 펄스 필드 젤 전기포고가 이용되고, 이는 다른 방향으로, 변화하는, 또는 맥동, 전기장에 겔을 복종하는 관련시킵니다. 이 기술은 젤 주위의 다른 방향으로 배열된 전극 의 쌍을 가진 특화된 젤 실행 장치를 관련시킵니다. 이것은 다른 미생물 지역 사회에서 풀로 풀진 DNA 견본 같이 유기체의 인구 사이 게놈 크기에 있는 다름을 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다, 당신은 다른 호수 환경에서 취해지는 여기에서 볼 수 있습니다.

DNA 젤 전기 전구에 대한 소개를 방금 보았습니다. 우리는 당신에게 방법 뒤에 개념을 보여 주었다, 아가로즈 젤을 준비하는 방법, 샘플을로드하는 방법, 젤을 실행하는 방법, 그것을 분석하고 아가로즈 젤 전기 포거의 몇 가지 일반적인 응용 프로그램. 젤을 실행보고 행운을 주셔서 감사합니다.