직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 세포에서 특정 게놈 유전자좌의 공간 조직을 강력한 방식으로 조사하는 것입니다. 이는 먼저 형광 표지된 프로브를 생성하여 궁극적으로 관심 게놈 영역을 결합하고 강조함으로써 달성됩니다. 다음 단계는 프로브 접근을 허용하기 위해 슬라이드에 관심 세포를 부착, 고정 및 투과하는 것입니다.

그런 다음 프로브와 세포 DNA를 동시에 열 변성시킨 후 밤새 프로브 혼성화 세척 단계를 거쳐 비특이적으로 결합된 프로브를 제거하고 dpi로 서 있는 카운터를 제거합니다. 세포핵을 시각화하기 위해 형광 현미경 검사로 얻은 결과는 궁극적으로 특정 게놈 영역이 차지하는 핵 위치를 드러낼 것입니다. 이 방법은 유전자 간의 기능적 상호 작용 결정과 같은 핵 조직 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 특정 DNA FISH 프로토콜의 주요 장점은 빠르고 강력하며 다재다능하다는 것입니다. 우리는 E Es 세포를 사용하여 이 방법을 시연하지만, 100에서 250의 뒤쪽으로 만든 직접 표지된 프로브와 같은 수많은 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 킬로베이스는 더 작은 프로브가 필요한 경우 밝은 신호를 일관되게 생성합니다.

40 - 50 kilobase smid 또는 5 - 10 kilobase insert를 포함하는 plasmid를 사용합니다. 앙상블 또는 UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 특정 유전자에 해당하는 back 또는 smid 클론을 식별합니다. 고품질 back DNA를 준비하기 위해 반복 침전 또는 시판되는 키트를 사용하여 준비의 청결도는 필요한 프로브의 양에 비례합니다.

라벨링은 두 단계로 수행합니다. 먼저 NIC translation을 사용하여 아미노 대립유전자, DUTP를 도입합니다. 둘째, 화학적 커플링을 사용하여 AM 평균 반응성 염료를 부착합니다.

밝은 프로브는 강한 물고기 신호에 중요하므로 밝은 프로브를 만드는 데 시간을 투자할 가치가 있습니다. 이 절차는 세포 치료와 병행하여 수행할 수 있으며 하루를 시작할 때 수행할 필요가 없습니다. 먼저 10-20 나노그램의 직접 표지된 프로브를 6마이크로그램에 대해 6마이크로리터의 CO 1D NA와 혼합했습니다.

그런 다음 연어 고환에서 1마이크로리터의 단일 가닥 DNA를 9.7마이크로그램 동안 추가합니다. 물과 함께 혼합물의 부피를 100마이크로리터로 조정합니다. 다음으로, 10 마이크로 리터의 3 몰 아세트산 나트륨과 275 마이크로 리터의 에탄올을 넣고 볼텍싱으로 혼합합니다.

혼합물이 섭씨 영하 20도에서 최소 1시간 동안 침전되도록 합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 30분 동안 최대 속도로 마이크로 퍼지에서 침전물을 회전시킵니다. 그런 다음 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 섭씨 4도에서 5분 동안 다시 회전시킵니다.

다음으로 펠릿을 자연 건조시킵니다. 그런 다음 소생합니다. 5 마이크로 리터의 탈 이온화 된 형태로 현탁하십시오.

섭씨 37도에서 1000RPM으로 흔들면서 아미드하면 빛으로부터 보호하기 위해 호일이 발생합니다. 30분 후, 5마이크로리터의 덱스트린 설페이트 혼합물을 넣고 교반하면서 배양을 계속합니다. 10분 더 동안, 슬라이드에 달라붙는 세포 성향은 세포 유형에 따라 크게 다릅니다.

각 세포 유형에 대해 최적의 정착 시간과 세포 밀도를 경험적으로 결정합니다. 일관된 결과를 얻으려면 세포가 단일 세포 현탁액에 있어야 슬라이드에 마우스 ES 세포를 부착할 수 있습니다. 슬라이드에서 세포가 발견될 영역을 돌면서 시작합니다.

소수성 펜을 사용하여 일반 배양 배지에서 80-100 마이크로 리터 당 20-50, 000 세포의 현탁액을 준비하고 세포 현탁액을 원형에 첨가하고 세포가 가습 인큐베이터에서 약 3 시간 동안 부착 할 수 있도록합니다. 슬라이드 부착 후 슬라이드를 4% PFA에 10분 동안 부드럽게 담가 세포를 고정합니다. 슬라이드는 팁 상자와 같은 트레이에 평평해야 합니다.

coplan 항아리에 실온 시약을 사용합니다. 먼저 트리스 클로라이드로 세포를 10분 동안 담금질합니다. 둘째, 사핀과 트리톤 X 100 혼합물을 사용하여 10분 동안 세포를 투과시킵니다.

이제 세척 당 5 분 동안 PBS에서 세포를 두 번 세척하십시오. 세척 후 최소 20분 동안 20% 글리세롤로 세포를 배양합니다. 이 시점에서 슬라이드는 섭씨 영하 20도에서 몇 주 동안 50% 글리세롤에 보관할 수 있습니다.

하루 이상 보관하면 신호 강도가 증가합니다. 진행하기 전에 PBS에서 20% 글리세롤로 세포를 실온으로 평형을 이루어야 합니다. 이제 액체 질소를 사용하여 슬라이드를 세 번 동결 및 해동합니다.

딱딱거리는 소리가 멈출 때 한 번에 한 슬라이드씩. 몇 초 후 슬라이드를 종이 타월로 제거하여 해동하고 불투명 한 냉동 글리세롤이 사라질 때까지 기다렸다가 슬라이드를 다시 얼리기 전에 최대 15 슬라이드를 3 번의 동결 해동 주기 동안 회전하여 편안하게 수행할 수 있습니다. 이제 PBS에서 슬라이드를 두 번 세척할 때마다 5분 동안 세탁합니다.

그런 다음 슬라이드를 0.1 몰 염산에서 30 분 동안 배양합니다. 염산 처리를 따라 PBS에서 5분 더 세척합니다. 이제 더 강한 사핀과 트리톤 X 100 믹스로 세포를 다시 30 분 동안 혼합하여 슬라이드에서 계면 활성제를 씻어 내고 5 분 PBS 세척을 두 번 사용하십시오.

이제 슬라이드는 아미드를 50% 형태로 XSSC로 평형화할 준비가 되었습니다. 이 작업은 평형을 이루는 동안 최소 10분 동안 지속되어야 하며, 피펫으로 연결된 프로브를 몇 차례 위아래로 회수한 다음 세포 스폿당 10마이크로리터를 적절한 크기의 커버 슬립으로 이동해야 합니다. 형태 아미드에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 세포 주변의 과도한 액체를 말리되 세포 반점이 마르지 않도록 합니다.

이제 덮개를 뒤집습니다. 셀 위의 슬라이드에 미끄러집니다. 고무 시멘트로 커버 슬립을 슬라이드에 밀봉합니다.

시멘트가 완전히 건조되도록 하고 슬라이드를 빛으로부터 보호하십시오. 다음으로, 핫 플레이트에서 슬라이드를 섭씨 78도까지 정확히 2분 동안 가열합니다. 이는 제대로 수행하는 데 중요합니다.

덮개는 핵 형태를 가능한 한 많이 보존하기 위해 이 단계에서 빛으로부터 세포를 보호해야 합니다. 세포가 건조되지 않도록 하고 열 위치가 적절한 온도를 유지하는지 확인하는 것이 중요합니다. 그런 다음 습기가 있는 종이 타월과 함께 가볍고 밀폐된 상자에 슬라이드를 넣어 습도를 제공하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

커버 슬립 주변의 고무 시멘트를 벗겨내어 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 덮개가 미끄러지고 느슨해지고 미끄러질 때까지 각 슬라이드를 X 초과 SC에 놓습니다. 다음으로, 45 섭씨 온도에서 15 분 동안 2 x 과잉 SC에 50 % 형태의 아미드로 슬라이드를 세척합니다.

빛으로부터 보호하기 위해 수조의 뚜껑을 닫으십시오. 그런 다음 섭씨 63도에서 15분 동안 0.2 XSSC로 슬라이드를 세척합니다. 그런 다음 섭씨 45도에서 5분 동안 두 번의 XSSC를 투여하고 마지막으로 실온에서 5분 동안 초과 SE를 사용합니다.

나머지 단계는 모두 실온에서 진행되며, 5분 세척으로 시작하여 PBS는 이제 2분 동안 dappy로 슬라이드를 염색한 다음 5분 동안 PBS로 슬라이드를 고정합니다. 커버 슬립을 장착하려면 셀 스폿당 10마이크로리터의 장착 매체를 올바른 크기의 커버 슬립에 적용합니다. 그런 다음 세포가 건조되지 않도록 세포 반점 주변에서 여분의 PBS를 건조시킵니다.

덮개를 뒤집고 슬라이드에 밀어 넣고 어류 프로브 준비 프로토콜을 사용하여 네일 바니시로 밀봉합니다. NIC 번역 후 150에서 700 사이의 염기쌍을 실행하는 대량의 단편과 함께 DNA 번짐을 볼 수 있어야 합니다. 화학적 결합 후, 형광 염료의 혼입은 프로브 통과의 분광 분석으로 측정할 수 있습니다.

프로브 품질을 판단하기 위한 이러한 품질 관리 단계는 이러한 프로브를 사용하는 것이 중요합니다. epi 형광 현미경을 사용한 자동 이미징이 가능했습니다. 이를 위해서는 배경이 거의 없는 날카롭고 쉽게 식별할 수 있는 물고기 신호가 필요합니다.

이것은 원시 시야 이미지입니다. 다음 이미지는 자동으로 식별되고 분석된 핵을 나타냅니다. 다양한 inter allelic 및 inter locus 거리가 오른쪽 상단과 각 핵 아래 양쪽으로 표시됩니다.

이 확대에서 흰색 반점은 시야당 식별된 핵을 나타냅니다. 이 히스토그램은 위의 녹색 신호와 아래의 빨간색 신호 사이의 최대 대립형질 간 거리를 보여줍니다. 모든 데이터는 HBB 및 HBA 유전자와 히스톤 클러스터를 포함하는 서로 다른 염색체에 위치한 프로브가 있는 P 20 생식 세포에서 가져온 것입니다.

이는 mic과 KC 및 Q1 유전자를 덮고 있는 백 프로브로 염색된 태아 간 핵의 예입니다. 이 이미지에서 물고기 신호의 핵 좌표를 얻을 수 있고 게놈 영역의 공간 관계를 계산할 수 있습니다. Inter allelic distances는 핵 반경의 분율로 표시됩니다.

이 데이터에서 빨간색 프로브는 녹색 프로브보다 훨씬 더 가까웠습니다. 더 강렬한 신호가 필요한 컨포칼 현미경 검사도 실현 가능했습니다. 이미지 스택은 염색체 영역 내에서 물고기 신호의 3D 모델링에 사용되었습니다.

빨간색과 흰색으로 표시된 이 두 개의 프로브는 마우스 염색체 7개의 전체 염색체 페인트가 녹색으로 표시됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단일 세포에서 특정 게놈 자리의 공간적 위치를 조사하기 위해 DNA 물고기를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 처리가 핵 구조에 영향을 미칠 수 있음을 기억하는 것이 중요하며 이 절차에 따라 적절한 다음을 포함하는 것이 중요합니다.

유전자와 단백질 사이의 공간적 관계와 같은 추가 질문에 답하기 위해 면역 어류와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.