Name: 직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 학습하세요 3D DNA FISH 프로토콜을 사용하여 단일 세포에서 특정 게놈 위치의 공간적 조직을 분석하는 방법을 배우세요. 직접 형광 표지된 프로브를 활용하여 핵 아키텍처를 시각화하고 유전자 상호작용을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 BBSRC와 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)에 의해 투자되었다. 우리는 생물 정보학 분석과 도움을 영상과 펠릭스 크루거에 대한 지원은 사이먼 워커에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 닉 번역에 의해 직접 레이블 DNA 프로브를 생성 참고 : 세기관지에게서 직접 표시된 프로브 (100-250킬로바이트)는 일관되게 밝은 신호를 생성한다. 작은 프로브가 필요한 경우 5-10의 KB 삽입을 포함 fosmids (40-50킬로바이트) 또는 플라스미드를 사용합니다. BAC 또는 앙상블이나 UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 특정 유전자에 해당하는 fosmid 클론을 식별합니다. 반복 침전 고품질 BAC DNA를 준비하거나 시판 키트를 사용합니다. 이하는 준비가 세균의 게놈 DNA로 오염을 덜 프로브는 슬라이드 당 필요합니다. 두 단계 라벨링 수행 닉 번역 aminoallyl-dUTP와 아민 반응성 염료의 화학 결합을 소개합니다. 1.1. 닉 번역 닉 번역하는 동안, DNase의 I는 단일 가닥 나누기를 만드는 데 사용됩니다. DNA 중합 효소 나는 새, T로 기존의 세포핵을 대체 흠 &#39;이의 끝&#39;3 길게한다<html> 이에 &#39;번역&#39;닉 따라서 레이블이 세포핵을 통합 할 수있는 기회를 제공한다. Aminoallyl-dUTP는 DNA 중합 효소에 의해 때문에 효율적인 정관의 선택 I과 아민 반응성 염료 또는 haptens 나중에 화학 결합에 대한 가능성. 그것은 DNase의 I의 새김 및 DNA 중합 효소 I은 번역 사이의 올바른 균형을 유지하는 것이 중요합니다, 너무 DNase의 I도 약간의 번역을 시작하는 효소에 대한 충분한 흠을 생산하지 않습니다, 낮은 수율과 짧은 조각의 크기를주는 과도한 DNA 소화가 발생합니다 큰 조각 크기와 aminoallyl-dUTP 가난한 결합을 제공. 다음 프로토콜은 잘 작동하지만 다른 배치하거나 서로 다른 제조 업체에서 DNase의 I 적정 할 필요가있다. <ol><li> 16에서 2 시간 동안 얼음과 부화에 반응 라벨 ° C. 설정 이 0.5 μg 닉 번역 된의 DNA를 생성해야하며 최대 확장 할 수 있습니다. DNase의 I 버퍼에 DNase의 I 1시 반 (즉, 0.3 U / μL)을 희석. </li></ol>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 주식의 농도 </td><td> 볼륨이나 용량 </td></tr><tr><td> BAC DNA </td><td></td><td> 5-10 μg </td></tr><tr><td> NTB 버퍼 </td><td> 배 </td><td> 5 μL </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0.1 M </td><td> 5 μL </td></tr><tr><td> dNTP 혼합 </td><td> 배 </td><td> 5 μL </td></tr><tr><td> Aminoallyl-dUTP </td><td> 0.5 mM의 </td><td> 6 μL </td></tr><tr><td> DNA 중합 효소 I </td><td> 10 U / μL </td><td> 1 μL </td></tr><tr><td> DNase의 I </td><td> 10 U / μL </td><td> 1 μL (1시 반 희석) </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td></td><td> 50 μL에 </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> 라벨 조각의 크기를 확인하기 위해 2 % 아가로 오스 겔 1 μl를 실행합니다. 당신은 젤을 실행하는 동안 얼음에 반응을 유지합니다. 성공 닉 translati에는 1 ~ KB (: 대표 결과를 참조 중요한 단계)에서 몇 가지 큰 조각과 150 BP 700 BP 사이에 실행되는 조각의 부피와 얼룩의 원인이됩니다. 필요한 경우, 15-30 분 동안 16에서 신선한 1시 반 DNase의 I 희석과 부화의 또 다른 1 μL ° C를 추가합니다. 배양 시간은 BAC DNA의 양과 질에 따라 달라집니다. </li><li> 10 분 동안 ° C 75 가열 DNase의 I을 비활성화. </li><li> PCR 정제 키트를 사용하여 청소 아민 수정 DNA. 100 μL H 2 O에서 용출 </li><li> 10 μl의 3 M NaOAc (산도 5.2) 275 μL 에탄올을 추가하여 에탄올 침전 DNA. 적어도 1 시간 또는 하룻​​밤 -20 ° C에 남겨주세요. 4에서 30 분 동안 최대 속도로 회전 ° C. 500 μL 70 % 에탄올로 펠렛을 씻고 건조 공기 수 있습니다. 이 단계는 라벨 반응을 방해 추적 아민을 제거합니다. 1X 초기 반응 당 6 μL H 2 O의 펠렛을 Resuspend. </li><li> 아민 수정 된 DNA의 농도를 결정하기 위해 1 μL를 사용하여microvolume UV 분광 있습니다. </li></ol> 1.2. 형광 염료의 결합 프로브의 형광 라벨링 염료의 화학 결합에 의해 이루어진다. 알렉사 플 루어 석신 에스테르 염료하여 직접 레이블 프로브를 생산, 공유 결합을 형성하는 아미노 allyldUTP 수정 된 DNA의 아민과 반응. 알렉사 플 루어 488, 555, 및 647 염료는이 과정에 대한 성공했다. <ol><li> 5 μL의 볼륨 아미노 알릴 수정 된 DNA의 4 μg을 조정, 95 열 ° C 5 분, 얼음 멋진 스냅 0.2 M NaHCO3를 3 μl를 추가합니다. </li><li> 상온에서 2 μL 무수 DMSO에 아민 반응성 염료의 하나의 나누어지는을 녹입니다. NaHCO3를, 소용돌이, 1 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 펄스 스핀과 부화로 8 μL 수정 된 DNA를 추가합니다. </li></ol> 참고 : 아민 반응성 염료는 다음과 같은 방식에 따라 하나 이상의 프로브 레이블을 사용할 수 있습니다. 오 전프로브의 NLY 10-20 NG가 슬라이드 라벨마다 사용되며, 1 μg은 50 ~ 100 슬라이드에 대한 충분한 조사를 제공합니다. 그것은 -20 ° C.에서 미래의 라벨 반응 아민 수정 DNA를 저장하는 것도 가능합니다 <table border="1"><tbody><tr><td> DNA 양 </td><td> DNA 양 </td><td> 0.2 M NaHCO3를 </td><td> 염료의 양 </td><td> 합계 </td><td> 충분한위한 </td></tr><tr><td> 4 x 1 μg </td><td> 1.25 μl를 각 </td><td> 825 μl를 각 </td><td> 0.5 μl를 각 </td><td> 2.5 μL (1 / 4) </td><td> 50-100 슬라이드 각 </td></tr><tr><td> 3 × 1.35 μg </td><td> 1.67 μl를 각 </td><td> 1 μl를 각 </td><td> 0.67 μl를 각 </td><td> 3.34 μL (1 / 3) </td><td> 65-130 슬라이드 각 </td></tr><tr><td> 2 × 2 μg </td><td> 2.5 μl를 각 </td><td> 1.5 μl를 각 </td><td> 1 μl를 각 </td><td> 5 μL (1 / 2) </td><td> 100-200각 슬라이드 </td></tr><tr><td> 1 × 4 μg </td><td> 5 μL </td><td> 3 μL </td><td> 2 μL </td><td> 10 μL (전체) </td><td> 200-400 슬라이드 </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 90 μL H 2 O와 PCR 정제 키트를 사용하여 정화 표시된 프로브를 추가합니다. 100 μL 10 mMTris-CL (산도 8.5)에서 용출. </li><li> 맥주 램버트 방정식 (지침은 알렉사 플 루어 반응성 염료를 동반하거나 온라인으로 찾을 수 데이터 시트에 나와있다)를 사용하여 microvolume 전체 스펙트럼 분광기 (그림 2 참조) 프로브 농도와 라벨의 효율성을 결정합니다. 100 bp의 당 3-6 염료를 포함하는 프로브는 잘 작동합니다. 법인의 낮은 학위를 가진 프로브는 약한 물고기 신호를 제공 할 수 있습니다. 또한, DNA하지 않고 2 % 아가로 오스 겔에 5 μL를 실행 얼룩 phosphoimager를 사용하여 형광 염료의 결합을 확인합니다. ethidium의 브로마이드 또는 DNA 염색 대안 젤을 게시 얼룩 총 DNA에 표지 DNA를 비교합니다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. DNA 물고기 다음 단계를 통해, 그 세포를 슬라이드에 고정 투과된다. 세포의 DNA에 직접 표시된 프로브는 다음 핫 플레이트에 함께 변성과 빛을 꽉 가습 챔버에 하룻밤 교배 있습니다. 2.1. 1 일 <ol><li> 프로브 강수량 주 : 1 일 동안 어떤 시점에서 침전물 프로브. 이 편안 세포의 치료를 병렬로 수행 할 수 있으며, 하루의 시작에서 수행 할 필요가 없습니다. <ol><li> 10-20 NG 직접 레이블 프로브, 6 μL C 0t-1 DNA (6 μg), 연어 정소에서 1 μL 단일 가닥 DNA (9.7 μg)를 혼합하고 물 100 μL로 볼륨을 조절하십시오. </li><li> 소용돌이로 교반하여 10 μl의 3 M NaOAc 275 ㎕의 에탄올과 혼합을 추가합니다. -20 ℃에서 최소 1 시간 동안 침전 </li><li> 4시 30 분 최대 속도의 microfuge에 스핀 ° C. 70 % 에탄올로 펠렛을 씻고 다시 회전. 건조 펠렛5 μL 탈 아미드에 resuspend을. 빛으로부터 보호 1000 RPM (thermomixer에 자리 호일)에 떨고있는 동안 37 ° C에서 30 분간 resuspend을. </li><li> 37 덱스 트란 황산염 혼합 5 μl를 추가하고 추가로 10 분 동안 흔들어 ° C 다시 빛으로부터 보호됩니다. 단지 coverslip을에 피펫 전에 아래 피펫. 참고 : BAC 프로브, 편리한 옵션이 사용 준비 하이브리드 믹스에서 제공되는 모든 염색체 페인팅 프로브와 함께 염색체 페인팅하십시오. 를 Resuspend는 BAC 프로브를 침전 (C 0와 연어 정소에서 T1 DNA와 단일 가닥 DNA)를 피펫 아래로 10 ㎕의 염색체 페인트 혼합합니다. 10 분간 300 ~ 500 rpm으로 흔들어 37 ° C에서 알을 품다. 염색체 페인트 / 현장 당 BAC 프로브 믹스의 10 μl를 사용합니다. </li></ol></li><li> 슬라이드에 세포를 부착 참고 : 슬라이드에 부착하는 세포 성향은 크게 세포의 유형에 따라 다릅니다. 각 세포 유형에 대해를 결정최적의 경험적 시간과 세포 밀도를 정착. 일관된 결과, 세포는 단일 세포 현탁액에 있어야합니다. PBS에 재 부유 셀이 반드시 필요한 것은 아니지만 사용하는 원형의 용이성을 위해 세포 영역은 소수성 펜에서 발견됩니다. 소수성 장벽, 슬라이드에 확산 중단을 방지 슬라이드 잘 구분에 세 샘플까지 유지하고 면역 물고기 항체 솔루션의 아주 작은 볼륨을 사용할 수 있습니다. 세포의 숫자가 낮은 경우에도, 안보 영역은 최소로 유지 될 수 있습니다. </li><li> 마우스 태아 간 세포 <ol><li> 그리고 위아래로 pipetting하여 PBS와를 Resuspend의 약 1.5 ㎖에 각 E13.5 마우스 태아 간을 수집합니다. 2 분 동안 3,000 rpm에서의 microfuge에 스핀. 반복을 세 번 씻어. 70 μm의 체를 통해 최종 세척, 변형 세포에서. 160 μl의 PBS에서 하나의 간에서 세포를 resuspend을하고 자리 당 50 μ를 사용합니다. 상온에서 2 분 동안 정착 세포를 둡니다. </li></ol></li><li> 엠여러개 ES 세포 1. 마우스 ES 세포는 슬라이드에 쉽게 붙어 있지 않습니다. 슬라이드에 원이 영역은 세포 소수성 펜에서 발견됩니다. 원형으로 보통 배지, 피펫에 80-100 μL 당 20,000-50,000 세포 현탁액을 준비하고 가습 배양기 주 약 3 시간 동안 부착 둡니다. 또한, ES 세포를 슬라이드에 배양 할 수 있지만, 그 형성 자동화 된 영상을 방해 할 수 식민지. </li><li> 고정 셀 1. 일부 실험은 그 자체로 슬라이드에 부착하지 않는 고정 된 세포의 사용을 필요로합니다. cytocentrifuge를 사용하여 3 분 동안 300 rpm에서 부드러운 회전은 세포의 입체 구조를 유지하고 세포가 떨어지지 않도록합니다. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 세포 유형 </td><td> 의 서스펜션 </td><td> 안정 시간 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> 마우스태아 간 </td><td> PBS </td><td> 2 분 </td><td> 벤치에 </td></tr><tr><td> 마우스 ES </td><td> 보충과 DMEM </td><td> 4 시간 </td><td> 가습 배양기에서 37 ° C </td></tr><tr><td> 마우스 림프구 </td><td> PBS </td><td> 2 분 </td><td> 벤치에 </td></tr><tr><td> 마우스 P20 생식 세포 </td><td> 솔루션 수정 </td><td> Cytospin </td><td> 벤치에 </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 10 분 : 셀, 4 % PFA에 부드럽게 잠수함 슬라이드 (흄 후드에서 수행주의) 수정합니다. . 세포의 최고의 유지 (팁 상자의 뚜껑을 예를 들면 50 ML 4 % PFA)에 대한 트레이 평면 슬라이드 노트로 세포를 고정 :이 단계는 슬라이드에 첨부하기 전에 고정 셀에 적용되지 않습니다. </li></ol> 모든 후속 단계, 50 ML, 100 ML 플린 항아리를 사용합니다. 단지 사이에 슬라이드를 이동할 때 세포를 긁어하지 않도록주의하십시오. <ol start="4"><li> 0.1 M 트리스-C로 해소L, RT에서 10 분 산도 7.4. </li><li> 0.1 %의 셀을 Permeabilize saponin/0.1 % 트리톤 실온에서 10 분 동안 PBS에서 X - 100. </li><li> RT에서 5 분 PBS로 두 번 씻으십시오. </li><li> . 20 % 글리세롤 / RT에서 PBS 참고 적어도 20 분 동안 품어 :이 시점에서, 슬라이드는 적어도 몇 주 동안 -20 ° C에서 50 % 글리세롤 / PBS에 저장할 수 있습니다. 그것은 신호 강도 9의 증가에 적어도 하루에 결과가 저장 관찰되었다. . 참고 진행하기 전에 실내 온도 20 % 글리세롤 / PBS에 재 보정 :이 프로브 (2.1.1 참조) 침전를 시작하는 편리한 포인트입니다. </li><li> 배 동결 / 액체 질소에 해동. 작은 듀어를 사용하여 액체 질소에 한 번 잠수 한 슬라이드. 몇 초 특성 터지는 소리 후 철회 및 해동에 종이 타월에 장소. 다시 동결 후 사라 불투명 냉동 글리세롤 기다립니다. 최대 15 슬라이드 세 가지 동결 / 해동 사이클의 회전 편안하게 수행 할 수 있습니다. </li><li> WRT에서 5 분 두 번 PBS 화산재. </li><li> RT에서 30 분 동안 0.1 M 염산에 품어. </li><li> RT에서 5 분 PBS로 세척 할 것. </li><li> RT에서 30 분 동안 0.5 % saponin/0.5 %의 트리톤 X-100/PBS에 Permeabilize. </li><li> RT에서 5 분 PBS로 두 번 씻으십시오. </li><li> RT 적어도 10 분 동안 50 %의 formamide/2x SSC의 평형. </li><li> coverslip을 위에 피펫 프로브. 항아리에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 셀 스팟 (들)의 주위에 초과 액체를 건조. 포름 아미드 빠르게 건조로, 세포를 건조하지 않도록주의하십시오. 두 개 또는 세 개의 셀 반점 슬라이드의 경우 슬라이드의 위치를​​ 탐지하는 X 50mm의 coverslip에 해당하는 22mm에 자리 당 프로브의 10 μl를 적용합니다. 스팟 (들)을 통해 슬라이드에 coverslip을 반전. 고무 시멘트로 밀봉이 완전히 건조 할 수 있습니다. 이후의 모든 단계에서 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 78 열 슬라이드 ° C 뜨거운 접시에 정확히 2 분 (거꾸로 가열 블록 중요한 단계를 예 : 토론 참조). 커버 (판지 상자 또는 SIM을 배치<html> 핫 플레이트에 ILAR)는 변성 동안 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 빛을 꽉 가습 챔버에 37 ° C에서 밤새 품어. , 축축하게 빛 단단한 상자에 종이 타월을 놓고 물을 저해 할 수 있습니다. </li></ol> 2.2 2 일 <ol><li> 다음 세척 단계에 적합한 온도에서 솔루션 플린 항아리를 준비합니다. 이후의 모든 단계에서 가능한 한 많은 빛으로부터 슬라이드를 보호합니다. 커피 플린 단지에 대한 좋은 빛 단단한 덮개하게 할 수 있습니다. </li><li> 고무 시멘트와 2X SSC에서 개최 슬라이드 벗겨 coverslips는이 느슨하게 밀어 때까지. </li><li> 45 ℃에서 15 분 동안 50 %의 formamide/2x SSC로 세척 수조에 장소 뚜껑은 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 63시 15 분 0.2X SSC에 씻어 ° C. </li><li> 45 ℃에서 5 분 2X SSC로 세척 </li><li> RT에서 5 분 2X SSC로 세척 할 것. </li><li> RT에서 5 분 PBS로 세척 할 것. </li><li> RT에서 플린 항아리에 2 분 DAPI (5 ㎍ / 2X SSC의 ML)와 얼룩. </li></ol>내용 &quot;&gt; 참고 : DAPI 용액을 4에 저장할 수 있습니다 ℃에서 2 개월 동안 어둠 속에서 C. <ol start="9"><li> RT에서 5 분 PBS에 Destain. </li><li> 커버 슬립을 마운트하려면, 피펫 커버 슬립에 매체를 장착. 한 자리, 그리고 22mm 2-3 반점 X 50mm coverslips를위한 22mm X 22mm의 coverslips를 사용하여, 세포 장소 당 10 μl를 사용합니다. 세포 현장 최대한의 주위에 PBS를 건조하지만, 세포를 건조하지 않도록주의. 슬라이드에 coverslip을하고 손톱 광택과 도장을 반전. </li></ol>

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3D DNA 물고기 핵에 공간 배열을 분석 할 수있는 널리 인정 도구가되고있다. 물고기와 같은 모든 기술로, 시각 및 직접 결과를 제공하지만, 하나는 그 한계를 인식해야합니다. DNA 물고기는 상대적으로 가혹한 치료가 궁극적으로 분석하는 핵 구조 매우 일을 방해 FISH 프로브에 대한 염색질에 액세스 할 수 있도록하는 데 필요한 것을 고유의 문제에 직면 해있다. 몇 가지 전략은 접근성과 구조 보존을 저글링을 추구하고 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜에서 염색체 DNA는 프로브 하이브 리다이 제이션 이전 셀과 열 변성의 동결 - 해동 permeabilization에 의해 접속이 가능합니다. Solovei, 외., (2002)과 유사한 치료 후 구조 변화를 분석하고 염색질 영역의 평균 변위 게놈 8 대략 1 메가 지역에 구조 해석의 해상도를 제한 300 나노 것으로 나타났습니다. 이 고해상도하지 않지만,핵의 위치를​​ 분석하기위한 적절한 규모이다. FISH 분석을위한보다 실용적인 고려 사항은 해당 이미지 수집 및 원자력 거리의 측정 분석 할 수있는 핵의 수를 제한 시간이 많이 소요되는 프로세스입니다 수 있습니다. 우리는 높은 처리량 자동화 이미징을 수행 할 목적으로 간헐적 이벤트를 연구하기 위하여. 그런 장소에 적절한 컨트롤, 충분한 숫자는 공간 관계의 강력한 통계 분석을 할 수 있도록 비교할 수 있습니다. 우리는 일상적으로 우리가 핵 볼륨 내의 모든 FISH 신호의 3D 좌표를 결정하는 데이터 포인트 당 600 핵을 분석합니다. 이러한 데이터는 매우 적은 저장 공간을 필요로 간 및 내부 대립 유전자 거리, 및 모든 상위 지점에서 반경 위치의 분석을 할 수 있습니다. 또한, 자동화 된 처리가 매우 무의식적 편견의 가능성을 감소 연구원 블라인드 방식으로 수행 할 수 있습니다. 높은 처리량 분석가의이 종류를 설정하려면우리의 목표는 DNA 물고기를 수행하는 빠르고 효율적인 방법을 확립하는 것이었다됩니다. 우리는 프로토콜이 지속적으로 낮은 배경으로 밝은 신호를 생산하는 매우 강력한 것으로 여기에 설명하였습니다. 그것은 우리가 슬라이드에 세포를 부착하는 단계를 맞게 제공하려고 모든 세포 유형했다. 또한, 한 가지 예외를 제외하고, 우리가 사용하는 모든 세기관지는 밝은 프로브로 전환 할 수 있습니다. 우리는 또한 성공적으로 DNA 물고기 후 항체 염색 핵 단백질의 숫자를 발견했다. 이 잘 작동 몇 가지 단백질 동안, 우리는 IF 및 DNA 면역 물고기 (11 비교) 사이의 항체 염색 패턴의 일관성을 유지하기 위해 기존의 면역 (IF)와 비교를 추천합니다. 일반적으로, 우리는 서로 다른 색으로 표시된 프로브는 동일한 결과를 생산 것을 발견했다. 라벨 염료를 선택할 때 단, 다음과 같은 측면이 고려되어야한다. 첫째, 형광의 색깔은 현미경 U에 의해 잘 감지해야SED. 둘째, 형광에 의해 방출되는 빛의 파장은 다른 채널로 통해 출혈을 피하기 위해 충분히 달라야합니다. 이 현미경의 필터에 따라 달라집니다. 셋째, 적어도 우리 손에, 약간 색이 더 일관되게 다른 사람보다 밝은 신호를 생성한다. 우리는 항상 프로브를 라벨링 좋은 선택을 알렉사 플 루어 555 (빨강), 488 (녹색)를 만드는 counterstain으로 DAPI를 (파란색)를 사용하고, 647 (먼 빨간) 있습니다. 우리의 영상 시스템으로, 우리는 알렉사 플 루어 488 (녹색) 다음에 밝은 신호를 생성하는 알렉사 플 루어 555 (빨강)를 발견했다. 알렉사 플 루어 647 (지금까지 적색)은 인간의 눈으로 감지 할 수없고 현미경을 찾을 때 따라서 신호가 볼 수없는 것이 단점이있다. 두 가지 색 물고기를하는 경우 따라서, 우리는 빨간색과 녹색 염료의 조합을 추천합니다. 두 가지 주요 문제가 발생할 수 있습니다 : 셀 슬라이드 약한 신호를 씻어. 또한 세포가 슬라이드에 부착하는 방법은 상당히 변수 betw입니다een과 세포 유형, 세포가 결정해야 / 씨앗을 해결하는 최선의 프로토콜입니다. 우리는 성공적으로 사용하고 하나 양전하 또는 폴리-L-라이신 코팅 슬라이드 (사용할 준비가 구입 한), 그러나 세포는 일반적으로 폴리-L-라이신 코팅 된 슬라이드에 잘 부착하였습니다. 우리는 또한 세포가 자동으로 영상을 방해 한 반면 너무 조밀 전체 영역, 시트로 벗겨 것 하였을 때 세포가 너무 부족한한다면 것으로 나타났습니다. 샘플이 너무 귀중하지 않은 경우, 따라서 다른 세포 수는 이상적인 밀도를 결정하기 위해 시드해야합니다. 세포가 씻어 특히 경향이있는 경우, 소수성 장벽 펜을 사용할 수 있습니다, 그리고 물고기 단계를주의 깊게 슬라이드에 직접 솔루션을 pipetting하여 수행 할 수 있습니다. 피펫은 크게 필요한 시약의 양을 줄일 수 있지만, 여러 슬라이드를 할 때 상당히 오래 걸립니다. 약한 신호는 일반적으로 가난한 프로브로 인해, 그리고 그것은 좋은 사람을 만들기에 시간을 투자 할 가치입니다. 청소 BAC DNA 사용되어야한다반복 침전 또는 시판 키트에 의해 얻을 수있는 재료를 시작으로 라. 세균의 게놈 DNA의 오염에 부정적인 세포 용해 동안 프로브의 품질과 취급에주의에 영향을 미치는 세포 lysate를 필터링은 최소로 유지하기 위해 필요합니다. 이 크게 수율을 감소시키기 때문에 그것은, 그러나, 선형 DNA를 소화하는 exonuclease 단계를 사용할 필요가 없습니다. 프로브의 효율 라벨이 매우 중요합니다. 이 단계에서 가장 중요한 품질 관리 (대표 결과를 참조) 닉 번역 후 단편 크기를 확인합니다. &#39;좋은&#39;얼룩은 거의 항상 밝은 색깔의 프로브가 발생합니다. 그러나, 우리는 때때로 특정 BAC가 좋은 프로브로 처리하고 다른 BAC를 선택해야 할 수 없다는 것을 발견했다. 또 다른 중요한 단계는 열 변성이다. 온도가 너무 낮 으면, DNA는 부분적으로 변성되며 프로브 하이브 리다이 제이션이 손상됩니다. 온도가 너무 높은 경우, 핵 구조 위스콘신필요 이상을 교란 할 것이다. 우리 손에, 거꾸로 핫 블록에 78 ° C는 이상적인 타협이다, 그러나 이것은 사용 된 각각의 핫 블록에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 Vectashield 설치 매체를 사용하여 좋은 결과를했지만, SlowFade 골드가 적은 배경을 가지고 있으며, 이상에 대한 형광 신호를 보존 것으로 나타났습니다. 우리는이 차원 구조에 영향을 미치는 시간이 지남에 공기 방울을 형성하는 발견으로 우리는 열심히 세트 설치 매체의 사용을 권장하지 않습니다. 결론적으로, 여기에 설명 된 DNA 물고기 프로토콜과 함께 밝은 형광 직접 레이블이 프로브는 생물 학적 질문의 다양한 적용됩니다 핵 아키텍처의 강력하고 신속한 분석을위한 효율적인 솔루션을 제공합니다.

제자리 교잡에있는 DNA 형광 (DNA 물고기)는 세포주기의 모든 단계에서 각각의 유전자 좌위, subchromosomal 도메인, 심지어 전체 염색체의 3 차원 시각화 할 수 있습니다. 3D 물고기 광범위 계면 동안 게놈과 그 기능의 공간적 조직 (내부 1,2 참조) 사이의 관계를 조사하기 위해 사용하고있는 동안 2D FISH는 중기 연구에 사용됩니다. 역사적으로, 공동 협회 연구는 FISH에 의한 개별 유전자좌의 수백 수만을 조사하여 수행되었다. 이러한 4C와 Hi-C와 같은보다 최근 강력한 높은 처리량 3C-기반 기술은 서로 다른 유전자 좌의 수천 분자 사이 크로스 토크의 조사를 허용, 3 개발되었습니다. 3C 기반 기술과 DNA 물고기 보완 방법이 될 수 있지만, 그들은 반드시 같은 질문에 대답하지 않습니다. 3C 기반 방법은 능성이 결과, 혼합 세포 인구의 앙상블 판독을 제공합니다공동 연관들에 대한 ITY. 대조적으로, 처리량이 낮은 반면, 생선, 기반 기술은 발달이나 세포주기 단계에 따라 각각의 세포에있는 유전자 좌 또는 염색체의 공간 배열을 분석 할 수있는 가능성을 제공합니다. 따라서, 생선, 핵 구조 기능 관계를 프로빙을위한 중요한 도구가 될 것입니다. 성공적인 3D FISH 실험을 수행하는 두 가지 주요 고려 사항이 있습니다. 이들은, 1. 최적 표시된 프로브 및 2를 획득. 고정, 사전 및 사후 하이브리드 단계, 프로브 하이브 리다이 제이션에 대한 충분한 접근 DNA를하는 동안 최대한의 핵 형태를 보존하는 등 세포 치료의 선택. 효율적인 프로브 레이블은 물고기 매우 중요합니다. 전통적으로, 닉 - 번역 hapten 또는 형광 - 복합 뉴클레오티드 4 중 하나를 소개하는 데 사용되었습니다. 마찬가지로, 상업 흠 변환 키트는 직접 hapten 또는 형광 법인, 부 사용할 수 있습니다T는 또한 두 단계 라벨링 aminoallyl 세포핵과 아민 반응성 염료를 사용하여. 후자는 DNA 중합 효소에게 작업 할 적은 부피가 큰 분자를 제공하여보다 효율적인 염료 법인을 렌더링합니다. 최근에는 DNA의 비 효소 라벨링 키트는 핵산에 백금 배위 결합을 악용하는 개발되었다. FISH 프로브는도 이미 5 표시 구입할 수 있습니다. 키트 및 상업적으로 제조 된 프로브 의심의 여지가 사용 편의성을 제공하지만, 그들은 상당히 사내 프로브를 개별 구성 요소를 구입하고 생산보다 더 비싸다. 우리가 직접 여러 색상의 다양한 BAC 프로브 레이블을하기 위해 저렴한 비용으로 닉 번역 프로토콜을 최적화. 우리는 고순도의 BAC의 DNA를 얻는 것은 10에 비해, FISH 슬라이드 당 프로브의 10-20 NG에 대한 요구 사항에 중요하고 결과임을 발견 - 20 배 더 불순한 템플릿 DNA를 사용하는 경우, 주요 결과 비용과 시간 비용 절감. 아미노 allyldUTP의 사용은 유연하게 표시 할 수 있습니다가능 아민 반응성 염료 (예 : 알렉사 플 루어 나 사이프러스 염료) 또는 haptens (예 : 비오틴, digoxigenin)를 검색합니다. Hapten - 라벨 프로브는 신호를 증폭하고 시각화하는 형광 - 복합 항체 또는 스트렙 타비 딘에 의해 감지됩니다. 밝은 직접적으로 표시된 프로브는 일반적으로 적은 배경 염색을 표시하고 따라서 핵 현지화 및 궤적 형태의보다 정확한 표현의 결과로, 신호에 증폭을 피할 수 있습니다. NaOH를 변성, 염산 변성과 포름 알데히드 고정과 글루 타르 알데하이드 고정, 열 변성과 포름 알데히드 고정 6-9 : 다른 고정액 사전 처리 및 사후 하이브리드 세척을 사용할 수는 있지만 일반적으로 다음과 같은 범주에 속하는 여러 가지 FISH 기법이 있습니다 . 이러한 각각의 장점과 단점이 있습니다. 글루 타르 알데하이드 고정 좋은 핵 구조 보존 결과,하지만 최소화하기 위해 환원제 치료를 필요로그 결과자가 형광과 NaOH를 처리 신중하게 충분한 DNA 변성 및 핵 구조 6 잠재적 인 손상의 균형을 조절해야합니다. 포름 알데히드 고정 핵 구조의 교란의 증가 가능성을주고, 덜 강력한뿐만 아니라, 일반적으로보다 강력하고 안정적인 신호와 9자가 형광 낮은 제공. 염산 처리는 프로브 DNA에 좋은 액세스를 제공, 단백질 아웃 DNA 및 스트립을 depurinates뿐만 아니라, DNA 나누기를 소개 할 수 있습니다. 난방 물리적으로 좋은 대상 하이브리드 및 강한 신호의 결과 두 DNA 가닥을 분리하지만, 핵 구조 8 일부 교란을 일으킬 수 있습니다. 이러한 기술 각각의 단백질 항원에 미치는 영향의 정도는 실험적으로 각 단백질의 면역 FISH 실험에 사용할 최적의 프로토콜을 결정하기 위해 요구 사항의 결과로 널리 6,9 다릅니다. 더 &#39;완벽한&#39;DNA FISH 테는 없지만잘 조절하면 chnique, 그들은 모두 유용 할 수 있습니다. 우리의 목표는 가장 안정적인 신호 가열 방법에 초점을 맞추고, 세포 유형 10의 다양한 여러 유전자좌의 공간적 위치를 조사하기 위해 강력하고 재현 DNA 물고기에 대한 프로토콜을 최적화 할 수 있었다. 이것과 자동화 영상 시스템의 사용으로 우리는 핵 협정의 단일 세포 분석을위한 처리량을 증가 목표.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>NTB buffer</td><td></td><td></td><td>Step 1.1.1 (아래 'FISH 완충액 및 반응 혼합물' 목록 참조)</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>D-1532</td><td>Step 1.1.1</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td>Step 1.1.1 (아래 'FISH 완충액 및 반응 혼합물' 목록 참조)</td></tr><tr><td>Aminoallyl-dUTP</td><td>Ambion</td><td>AM8439</td><td>단계 1.1.1</td></tr><tr><td>DNA 중합효소 I</td><td>New England Biolabs</td><td>M02095</td><td>단계 1.1.1</td></tr><tr><td>DNase I 재조합 RNase free</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>단계 1.1.1</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>단계 1.1.4, 1.2.3</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>VWR</td><td>27653</td><td>단계 1.1.5, 단계 2.1.1.2</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>시그마</td><td>S5761</td><td>단계 1.2.1</td></tr><tr><td>마이크로어레이 응용 분야를 위한 Alexa Fluor 반응성 염료 데카팩</td><td>(분자 프로브)</td><td>A32750, A32756, A32757</td><td>단계 1.2.2</td></tr><tr><td>DMSO(무수) </td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>단계 1.2.2</td></tr><tr><td>SYBR 안전 DNA 겔 염색</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>단계 1.2.4(브롬화 에티듐 대체)</td></tr><tr><td>Cot-1 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td>Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA는 대량으로 집에서 만들 수 있으며 잘 작동)</td></tr><tr><td>연어 고환의 단일 가닥 DNA </td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td>단계 2.1.1.1</td></tr><tr><td>탈 이온화 포름 아미드</td><td>Sigma</td><td>F-9037</td><td>단계 2.1.1.3 (건강 위험)</td></tr> <tr><td>덱스트란 황산염</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8906</td><td>2.1.1.4 단계 (아래 'FISH 버퍼 및 반응 혼합물' 목록 참조)</td></tr><tr><td>XMP 페인팅 프로브</td><td>MetaSystems</td><td>000000-0528-837</td><td>단계 2.1.1.4 </td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 코팅 슬라이드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0425</td><td>단계 2.1.2 단계 2.1.2</td></tr><tr><td>소수성 펜(ImmEdge)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>단계 2.1.2</td></tr><tr><td>70 &mu; m sieve (마우스 f&#8211; tal liver cells only)</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td>Step 2.1.2.1</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Step 2.1.3 (가연성, 부식성, 급성 독성, 건강 위험) (아래 'FISH 완충액 및 반응 혼합물' 목록 참조)</td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td></td><td></td><td>Step 2.1.3 (아래 'FISH 완충액 및 반응 혼합물' 목록 참조)</td></tr><tr><td>Quillaja 껍질의 사포닌</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td>Step 2.1.4, 2.1.11 (급성 독성), (아래 'FISH 완충액 및 반응 혼합물' 목록 참조)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Step 2.1.4, 2.1.11 (급성 독성, 환경 유해성)</td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Life Technologies (GIBCO)</td><td>70011-036</td><td>Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650</td><td>Step 2.1.6</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20252</td><td>단계 2.1.9 (급성 독성, 부식성)</td></tr><tr><td>포름 아미드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>47670</td><td>단계 2.1.14, 2.2.3 (건강 위험)</td></tr><tr><td>SSC</td><td></td><td></td><td>단계 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (아래 'FISH 버퍼 및 반응 혼합물' 목록 참조)</td></tr><tr><td>커버슬립 22 x 22</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022022A1</td><td>단계 2.1.15</td></tr><tr><td>커버슬립 22 x 50</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td>단계 2.1.15</td></tr><tr><td>고무 시멘트</td><td>Marabu</td><td>2901 (10 000)</td><td>단계 2.1.15 (가연성, 건강 위험, 환경 위험)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen Molecular Probes</td><td>D3571</td><td>단계 2.2.8 단계 (건강 위험)</td></tr><tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td>단계 2.2.10 (장착 매체)</td></tr><tr><td>투명 매니큐어</td><td>모든 공급 업체</td><td></td><td>단계 2.2.10</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</</td></tr><tr><td>strong>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 phosphoimager</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td>Step 1.2.4</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)</td><td>Step 2.1.3 이후</td></tr><tr><td>액체 질소 듀어 </td><td>모든 공급업체</td><td></td><td>단계 2.1.7</td></tr><tr><td>검은색 뚜껑이 있는 베이스(광밀폐 챔버)</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>단계 2.1.17</td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>단계 2.2.3 (또는 37°C에서 쉐이커 사용; C room)</td></tr><tr><td colspan="4">이미징 및 이미지 처리</td></tr><tr><td>Metafer - 이미징 자동화 플랫폼</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>자동화 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>MetaCyte - 자동화된 간기 FISH 분석</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>자동화 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Axio Imager Z2 upright</td><td>Zeiss</td><td></td><td>epifluorescence microscope with automated imaging</td></tr><tr><td>IX81 컨포칼 현미경 (FV1000)</td><td>Olympus</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>Bitplane, 버전 7.3</td><td>Imaris</td><td></td><td>이미지 분석 및 3D 모델링 소프트웨어</td></tr><tr><td>Scientific volume Imaging, 버전 4.1</td><td>Huygens</td><td></td><td>이미지 분석 및 디콘볼루션 소프트웨어</td></tr><tr><td colspan="4"> FISH 버퍼 및 반응 믹스 <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Name</td> <td>Composition</td> <td>Comments</td> </tr> <tr> <td> 10 x NTB 완충액</td> <td>0.5 M Tris-HCl, pH 7.5</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.05 M MgCl2</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.5 mg/ml BSA</td> <td></td> </tr> <tr> <td>dNTP 믹스</td> <td>0.5 mM dGTP</td> <td>스토어 50 &mu; l -20에서 부분 표본 &deg; C</td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.5 mM dATP</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.5 mM dCTP</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.125 mM dTTP</td> <td></td> </tr> <td> <td>4 % PFA</td> <td>PBS에 4 g/100 ml PFA의 무게를 달고 62 &deg;C.로 가열합니다. NaOH로 pH를 7.0으로 조정하여 잔여 PFA.</td> <td> -20°C에서 50ml 분취량을 저장합니다. C, 재동결하지 마십시오 < / td > < / tr> <tr> <td > 2 % 사포닌 용액 < / td > <td > 100ml PBS 당 2g 사포닌을 장기간 교반하여 용해합니다. NaOH로 pH를 용해하고 7.0으로 조정합니다. ddH20과 오토클레이브를 1리터로 가져오십시오. </td> <td>-20°C에서 5ml 분취량을 보관하십시오. C</td> </tr> <tr> <td>20 x SSC</td> <td>무게 175.3g, 구연산나트륨 88.2g을 넣고 80ml ddH20에 넣습니다. NaOH로 pH를 용해하고 7.0으로 조정합니다. ddH20 및 autoclave.</td> <td></td> </tr> <tr> <td>덱스트란 황산염 혼합물</td> <td>20% 덱스트란 황산염을 2 x SSC 완충액에 넣어 1l로 만듭니다. 와류 용액과 하룻밤 사이에 로커에 믹스합니다.</td> <td>Store 500 &mu; l -20에서 부분 표본 &deg; C</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3d dna 물고기

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA 물고기 핵의 3 차원 조직을 분석하는 중요한 도구가되고 있으며, 기술의 여러 가지 변화는 출판되었습니다. 이 문서에서 우리는 견고성, 재현성, 사용의 용이성을 위해 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 밝은 형광 직접 레이블이 프로브는 염료의 화학 결합에 의해 다음 아미노 allyldUTP 닉 - 번역에 의해 생성됩니다. 3 차원 DNA 물고기는 세포 permeabilization에 대한 동결 융해 단계 및 프로브와 핵 DNA의 동시 변성 가열 단계를 사용하여 수행됩니다. 프로토콜은 세포 유형의 범위 및 프로브의 다양한 (세기관지, 플라스미드, fosmids, 또는 전체 염색체 페인트)에 적용하고 높은 처리량 자동으로 이미징 할 수 있습니다. 이 방법으로 우리는 정기적으로 세 염색체 지역 최대의 핵 지방화를 조사합니다.

프로토콜은 여기에 설명 (개요 그림 1) 게놈 조직의 분석을위한 높은 처리량 이미지 캡처와 DNA 물고기를 결합하여 큰 효과 사용되었습니다. 좋은 품질의 프로브 세대 (토론 참조)의 성공에 매우 중요합니다. 그림 2는 FISH 프로브에 대한 두 가지 중요한 품질 컨트롤을 보여줍니다. 흠 번역 한 후, DNA의 얼룩은 150 사이 700 BP (그림 2A)를 실행하는 조각의 대부분과 함께 볼 수 있어야합니다. 화학 결합하면 형광 염료의 결합은 프로브의 분광 분석 (그림 2B)에 의해 계측 할 수 있습니다. 좋은 프로브를 사용할 때, DNA 물고기 프로토콜에 따라 일반적으로 낮은 배경에 밝은 DNA 물고기 신호에 발생합니다. 우리는 성공적으로 다른 세포 유형의 다양한이 프로토콜을 사용하고, 에피 형광 또는 공 촛점 현미경 하나와 함께했다. 에피 fluorescenc를 사용하여 자동 영상공 초점 현미경은 더 강렬한 신호를 필요로하면서 전자 현미경, 약간의 배경 (그림 3) 날카로운, 쉽게 식별 FISH 신호가 필요합니다. 그림 4A 대표적인 처리 된 이미지를 보여줍니다. FISH 신호의 핵 좌표를 얻을 수 있으며, 게놈 지역의 공간적 관계는 (예를 들어, 그림 4b 참조) 계산 할 수 있습니다. 우리는 또한 염색체 지역에서 FISH 신호의 3D 모델링 (동영상 1)에 대한 공 촛점 현미경으로 얻은 이미지 스택을 사용했습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> 그림 1. 프로브 라벨 및 DNA 물고기 워크 플로. 프로브 준비가 파란색으로 표시됩니다. DNA 물고기 절차는 녹색 세부 설명과 검은 색으로 표시됩니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> 그림 2. 흠 번역 및 라벨 프로브의 품질 관리에 의해 프로브를 라벨. DNA 사다리, 차선 2와 3 : 흠 변환 후 세기관지)) 젤 DNase의 I (레인 1을 비활성화하기 위해 가열하기 전에 최적의 얼룩을 표시합니다. 파편 150-700 bp의 범위에 있어야합니다. ~ 1킬로바이트에 추가 세포진 검사는 자주 성공적인 흠 번역 반응을 관찰합니다. 표시된 프로브 B) Microvolume 전체 스펙트럼 분석. 알렉사 플 루어 488 : 495 nm의, 알렉사 형석 555 : 555 nm의, 알렉사 형석 647 : 650 nm의 260 nm에서 DNA 피크는 프로브가 표시되어 형광의 흡수 파장에 해당하는 두 번째 피크로 관찰된다. 같이 좋은 법인 세 프로브 위치 : 형광 흡광도 피크는 비슷한 높이 또는 DNA 피크보다 높은 수 있습니다. 알렉사 플 루어 647은 일반적으로 높은 흡광도가다시 알렉사 플 루어 488보다 높은 흡광도가 알렉사 플 루어 555보다. 알렉사 플 루어 488도 따라서이 조사의 첫 번째 피크가 다른 사람보다 높은 260 nm에서 약간의 빛을 흡수한다. 가난한 법인 쇼 형광 흡광도와 프로브 DNA 흡광도보다 낮은 2-3 배. DNA 피크보다 2 배 높은 형광 피크보다 더와 프로브는 일반적으로 물고기의 배경이 발생할 수 있습니다 접합 염료를 포함합니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> 그림 3. 일반적인 세 가지 색 물고기 실험을 보여주는 MetaCyte 3D 피쉬 이미징 소프트웨어의 스크린 샷은. 화면을 여러 부분으로 나누어 져 있습니다. Metafer / MetaCyte 슬라이드 스캔 시스템에 의해 캡처) 생 시야 (FOV) 이미지. B) 갤러리가 유엔이 확인 된 핵의 이미지어 신호 dergone 이미지 처리 및 분할. 다양한 유형의 데이터는 각각의 갤러리 이미지를 표시 할 수 있습니다. 에서 스캔 영역 슬라이드의 분석. D에서 확인 된 핵의 수와이 예제 세포 수의 다양한 interallelic 및 interlocus 거리는 오른쪽 상단에 각 이미지 아래 양쪽에 왼쪽에 표시됩니다. C)는 슬라이드 이름) 묘사 스캔 영역의 시스템입니다. E)의 확대. 흰 반점은 FOV마다 확인 된 핵을 나타냅니다. F) 처리 된 데이터를. 이 예에서는 녹색 신호 (위)과 빨간색 신호 (아래) 사이의 최대 interallelic 거리가 표시됩니다. 데이터가 표시 마우스 P20 배아 세포에서이다. 프로브는 HBB 및 HBA의 유전자와 히스톤 클러스터를 포함하는 서로 다른 염색체에 위치하고 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together. 내 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> 그림 4. 처리 이미지와 파생 된 위치 데이터의 예. Myc를하고 Kcnq1 유전자 (각각 MYC와 KvDMR, 색, 녹색, 빨강,라고) interallelic 거리를 나타내는. B) Tukey의 상자 수염 플롯을 다루는 서로 다른 염색체에있는 BAC 프로브로 염색 E13.5 마우스 태아 간 세포) 가공 이미지 600 핵에서 동일한 궤적에 대한 유통. Interallelic 거리가 핵의 크기 변동을 고려하기 위해 핵 &#39;반경 (거리 / 반지름)의 분수로 나타내었다. ES 세포의 핵 주위에 5 ㎛의 반경. (: p &lt;0.01, 짝 t-test를 ***) 빨간색 프로브는 녹색 프로브보다 가까이 크게합니다. 10의 데이터. 영화 1. 그들의 염색체 t에서 두 유전자좌의 3D 모델링erritory. 마우스 염색체 7의 한쪽 끝 부근에있는 두 개의 BAC 프로브는 표시 (빨간색과 멀리 빨간, (의사 색 흰색))와 마우스 ES 세포에 전체 염색체 페인트 (녹색)와 함께 교배 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

우리가 직접 라벨 형광 프로브를 사용하여 3D DNA 물고기에 의해 핵 구조를 분석하기위한 강력하고 다양한 프로토콜을 설명합니다.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 세포 내 특정 게놈 궤적의 공간적 조직을 견고한 방식으로 조사하는 것입니다. 이는 먼저 형광 표지 프로브를 제작하여 최종적으로 관심 게놈 영역에 결합시키고 이를 강조함으로써 달성됩니다. 다음 단계는 프로브가 접근할 수 있도록 슬라이드 위에 관심 세포를 부착, 고정 및 투과시키는 것입니다.그 다음 프로브와 세포 DNA를 동시에 열변성시킨 후, 비특이적으로 결합된 프로브를 제거하기 위해 하룻밤 동안 프로브 하이브리드화 세척 단계를 거치고 dpi로 대조 염색을 수행합니다. 세포핵을 시각화하기 위해 형광 현미경으로 얻은 결과는 궁극적으로 특정 게놈 영역이 차지하는 핵 내 위치를 밝혀낼 것입니다. 이 방법은 유전자 간의 기능적 상호작용을 결정하는 것과 같이 핵 구조 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 특정 DNA FISH 프로토콜의 주요 장점은 속도가 빠르고 견고하며 다용도로 활용 가능하다는 점입니다. 본 연구에서는 E Es 세포를 사용하여 이 방법을 시연하였으나, 다른 수많은 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 100~250 Kilobases 크기의 백본으로 제작된 직접 표지 프로브는 일관되게 밝은 신호를 생성하며, 더 작은 프로브가 필요한 경우에도 적용 가능합니다.40에서 50 kb 크기의 smid 또는 5에서 10 kb의 삽입물(insert)을 포함하는 플라스미드를 사용하십시오. Ensemble 또는 UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 특정 유전자에 해당하는 BAC 또는 smid 클론을 식별하십시오. 고품질의 BAC DNA를 준비하려면 반복 침전법이나 시판 키트를 사용하십시오. 준비물의 청결도는 필요한 프로브의 부피와 비례합니다.표지를 두 단계로 진행합니다. 먼저, NIC 번역을 사용하여 아미노 대립유전자-DUTP를 도입합니다. 그다음, 화학적 결합을 통해 AM 평균 반응성 염료를 부착합니다.강한 FISH 신호를 얻기 위해서는 밝은 프로브를 제작하는 데 시간을 투자할 가치가 있습니다. 이 과정은 세포 처리와 병행하여 수행할 수 있으며, 반드시 하루의 시작 단계에서 완료할 필요는 없습니다. 먼저, 6 µg의 DNA를 위해 직접 라벨링된 프로브 10~20 ng을 6 µL의 CO 1D NA와 혼합하십시오.그 다음, 9.7 µg에 해당하는 연어 정소 유래 단일 가닥 DNA 1 µL를 첨가합니다. 멸균수로 혼합물의 부피를 100 µL로 맞춥니다. 이어서 3 M 아세트산 나트륨 10 µL와 에탄올 275 µL를 첨가하고 볼텍싱하여 섞습니다.혼합물을 -20 °C에서 최소 1시간 동안 침전시킵니다. 다음으로, 침전물을 마이크로 원심분리기에서 4 °C로 30분 동안 최대 속도로 회전시킵니다. 그런 다음 70% ethanol로 펠릿을 세척하고 4 °C에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.다음으로 펠렛을 공기 중에서 건조하십시오. 그런 다음 다시 현탁합니다. 탈이온수에 5 µL 분량으로 현탁하십시오.1000 RPM으로 흔들어 주면서 37 °C에서 반응시키며, 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감쌉니다. 30분 후, 5 µL의 dextrin sulfate 혼합물을 첨가하고 교반하며 배양을 계속합니다. 10분 더 진행합니다. 세포가 슬라이드에 부착되는 성향은 세포 유형에 따라 매우 다양합니다.각 세포 유형에 대해 최적의 침강 시간과 세포 밀도를 경험적으로 결정하십시오. 일관된 결과를 얻으려면 세포가 단일 세포 현탁액 상태여야 합니다. 마우스 ES 세포를 슬라이드에 부착시키려면, 먼저 세포를 점적할 슬라이드 상의 영역에 원을 그려 표시하는 것으로 시작하십시오.소수성 펜을 사용하여 원을 그린 후, 일반 배양액에 80~100 µL당 20~50,000개의 세포가 포함된 현탁액을 준비하십시오. 이 세포 현탁액을 원 안에 넣고 가습 인큐베이터에서 약 3시간 동안 세포를 부착시킵니다. 슬라이드에 세포가 부착되면, 슬라이드를 4% PFA에 10분 동안 조심스럽게 담가 세포를 고정합니다. 이때 슬라이드는 팁 박스와 같은 트레이에 평평하게 놓여 있어야 합니다.상온의 시약을 Coplan jar에 넣어 사용합니다. 먼저 tris chloride로 10분 동안 세포를 퀀칭(quench)합니다. 둘째로, saponin과 Triton X-100 혼합물을 사용하여 10분 동안 세포를 투과화(permease)합니다.이제 PBS로 세포를 2회 세척하며, 세척당 5분 동안 진행합니다. 세척 후 세포를 20% glycerol에 최소 20분 동안 배양합니다. 이 단계에서 슬라이드를 50% glycerol에 넣어 -20 °C에서 수 주간 보관할 수 있습니다.하루 이상 보관하면 신호 강도가 증가합니다. 진행하기 전에 20% glycerol-PBS에서 세포를 실온으로 평형화하십시오. 이제 액체 질소를 사용하여 슬라이드를 세 번 동결 및 해동하십시오.탁탁거리는 소리가 멈추면 슬라이드를 한 장씩 꺼냅니다. 몇 초 후 슬라이드를 페이퍼 타월로 옮겨 해동시키며, 불투명하게 얼어붙은 glycerol이 사라질 때까지 기다린 후 슬라이드를 다시 동결시킵니다. 이 과정은 최대 15장의 슬라이드까지 세 번의 동결-해동 주기 동안 순환하며 원활하게 수행할 수 있습니다. 이제 슬라이드를 PBS로 5분씩 2회 세척합니다.그 다음 슬라이드를 0.1 molar 염산에서 30분 동안 배양합니다. 염산 처리 후 PBS로 5분간 다시 세척합니다. 이제 더 강한 sapin 및 Triton X 100 혼합액으로 세포를 30분 동안 다시 투과화합니다. 슬라이드에서 계면활성제를 제거하기 위해 5분간의 PBS 세척을 두 번 실시합니다.이제 슬라이드를 50% formamide가 포함된 XSSC에서 평형화할 준비가 되었습니다. 이 과정은 최소 10분 동안 지속되어야 하며, 평형화하는 동안 프로브를 몇 번 피펫팅하여 섞어준 다음, 각 세포 지점당 10 µL를 적절한 크기의 커버슬립으로 옮깁니다. formamide에서 슬라이드를 꺼내고 종이 타월로 세포 주변의 과잉 액체를 닦아내되, 세포 지점이 마르지 않도록 주의하십시오.이제 커버 글라스를 뒤집습니다. 세포가 있는 슬라이드 위로 커버 글라스를 덮습니다. 고무 시멘트를 사용하여 커버 글라스를 슬라이드에 밀봉합니다.시멘트를 완전히 건조시키고 슬라이드를 차광 상태로 유지하십시오. 다음으로, 핫플레이트에서 슬라이드를 정확히 2분 동안 78 °C로 가열하십시오. 이 단계는 정확하게 수행하는 것이 매우 중요합니다.이 단계에서 핵의 형태를 최대한 보존하기 위해 커버로 세포를 빛으로부터 보호해야 합니다. 세포가 건조되지 않도록 하는 것과 히트 블록(heat block)의 온도가 적절한지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, 습도를 유지할 수 있도록 젖은 종이 타월과 함께 슬라이드를 빛이 차단된 상자에 넣고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.커버슬립 주변의 고무 시멘트를 벗겨내는 것으로 이 절차를 시작합니다. 그 다음, 커버슬립이 헐거워져 미끄러질 때까지 각 슬라이드를 X excess SC에 담급니다. 이어서, 45 °C에서 15분 동안 50% form amide가 포함된 two x excess SC로 슬라이드를 세척합니다.빛으로부터 보호하기 위해 워터 배스의 뚜껑을 닫아둡니다. 그다음 63 °C에서 15분 동안 0.2 XSSC로 슬라이드를 세척합니다. 이어 45 °C에서 5분 동안 2 XSSC로 세척하고, 마지막으로 실온에서 5분 동안 충분한 양의 SE로 세척합니다.남은 단계는 모두 상온에서 진행하며, 먼저 5분 동안 PBS로 세척합니다. 이제 슬라이드를 DAPI로 2분 동안 염색한 후, PBS로 5분 동안 탈염색합니다. 커버슬립을 덮기 위해, 적절한 크기의 커버슬립 위에 세포 스폿당 10 µL의 마운팅 용액을 도포합니다. 그다음 세포가 마르지 않도록 주의하면서 세포 스폿 주변의 과잉 PBS를 닦아냅니다.커버 글라스를 뒤집어 슬라이드 위에 얹고, fish 프로브 준비 프로토콜에 따라 매니큐어로 밀봉합니다. NIC 번역 후에는 DNA 도말 상태가 확인되어야 하며, 대부분의 단편은 150에서 700 base pair 사이로 나타나야 합니다. 화학적 결합 후에는 프로브 통과 시의 분광 분석을 통해 형광 염료의 결합 여부를 측정할 수 있습니다.이러한 프로브를 사용할 때 프로브의 품질을 판단하기 위한 이러한 품질 관리 단계는 매우 중요합니다. 에피 형광 현미경을 이용한 자동 이미징이 가능했습니다. 이를 위해서는 배경 신호가 적으면서 식별이 용이하고 뚜렷한 FISH 신호가 필요합니다.이것은 처리되지 않은 시야 이미지입니다. 다음 이미지들은 자동으로 식별 및 분석된 핵들을 나타냅니다. 다양한 대립유전자 간 거리 및 유전자좌 간 거리가 각 핵의 우측 상단과 양측 하단에 표시되어 있습니다.이 확대 이미지에서 흰색 점은 시야당 확인된 핵을 나타냅니다. 이 히스토그램들은 상단의 녹색 신호와 하단의 적색 신호 사이의 최대 대립유전자 간 거리를 보여줍니다. 모든 데이터는 HBB 및 HBA 유전자와 히스톤 클러스터를 포함하며 서로 다른 염색체에 위치한 프로브를 사용한 P 20 생식 세포에서 얻은 것입니다.이것은 mic, KC 및 Q1 유전자를 포함하는 백 프로브(back probes)로 염색된 태아 간 핵의 예시입니다. 이 이미지들을 통해 물고기 신호의 핵 좌표를 얻을 수 있으며, 게놈 영역의 공간적 관계를 계산할 수 있습니다. 대립유전자 간 거리는 핵 반지름의 비율로 도식화하였습니다.이 데이터에서 빨간색 프로브는 초록색 프로브보다 서로 훨씬 더 가깝게 위치했습니다. 더 강한 신호가 필요한 공초점 현미경 관찰 또한 가능했습니다. 이미지 스택은 염색체 영역 내의 물고기 신호를 3D 모델링하는 데 사용되었습니다.빨간색과 흰색으로 표시된 이 두 프로브는 마우스 7번 염색체의 양 끝단에 가깝게 위치하며, 전체 염색체 페인팅은 녹색으로 표시되어 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 단일 세포 내 특정 게놈 궤적의 공간적 배치를 조사하기 위한 DNA FISH 수행 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도할 때, 모든 처리가 핵 구조에 영향을 줄 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요하며, 이에 따른 적절한 대조군을 포함하는 것이 중요합니다.유전자와 단백질 사이의 공간적 관계와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 immuno fish와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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