마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

이 절차의 전반적인 목표는 반자동 미세유체 기반 플랫폼을 조립 및 사용하여 작은 세포 집단을 배양 및 자극하고 분자 분석을 위해 세포 용해물을 복구하는 것입니다. 이는 먼저 세포 관류 챔버(cell perfusion chamber)라고 하는 피브로넥틴으로 코팅된 미세 모세혈관에서 미시적 세포 배양을 확립함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 관류 챔버를 디지털 미세유체역학 또는 DMF 모듈에 연결하는 것인데, 이는 시약이 미시적 세포 배양으로 또는 미시적 세포 배양으로 이동되는 유연한 수단을 제공합니다.

다음으로, DMF 모듈은 관심 자극을 관류 챔버에 전달하고 세포는 미리 결정된 노출 시간 동안 자극과 함께 배양됩니다. 마지막으로, 세포는 화학적 수단에 의해 용해되고 용해물은 분자 분석을 위해 DMF 모듈로 회수됩니다. 그런 다음 자극에 대한 세포 집단의 전사 반응을 특성화하기 위해 정량적 R-T-P-C-R을 사용하여 회수된 용해물을 분석합니다.

기존 세포 배양 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 소량의 세포를 사용하여 세포 자극 연구를 수행할 수 있고 소량의 시약도 사용할 수 있다는 것입니다. 우리의 연구는 플랫폼이 미시적으로 세포와 시약을 정밀하게 처리하면 실험에 대한 가변성을 최소화한다는 것을 보여주었습니다. 플랫폼은 매우 다재다능합니다.

디지털 마이크로플로우 모듈은 매우 유연하게 세포와 시약을 관류 챔버 안팎으로 라우팅할 수 있어 실험을 빠르고 쉽게 맞춤화하고 재구성할 수 있습니다. 먼저 밀리리터 피브로넥틴당 50마이크로그램의 멸균 용액을 준비하고 다중 포트 주사기 펌프를 사용하여 30마이크로리터의 용액을 각 마이크로 모세관으로 끌어들여 마이크로 모세관 내부 표면의 코팅을 가속화합니다. 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양한 다음 피브로넥틴 용액을 빼서 버리고 마이크로 모세혈관을 실온에서 6시간 동안 건조시킵니다.

다음으로, 섬유 닌 코팅된 마이크로 모세관 또는 관류 챔버를 폴리카보네이트 튜빙에 연결하고 캡파이트 피팅을 사용하여 튜브를 주사기 펌프에 연결합니다. 여기에 표시된 설정은 6개의 관류 챔버를 지지하는 보조 포트 주사기 펌프를 사용합니다. 테이프를 사용하여 각 관류 챔버의 본체를 열 블록에 고정하고 열 블록 온도를 섭씨 37도로 설정합니다.

그런 다음 관류 챔버의 열린 끝을 밀리리터당 100만 개의 세포 농도로 고르게 분산된 신선한 성장에 부유하는 세포를 포함하는 저장소에 담그십시오. 주사기 펌프에 10마이크로리터의 세포 현탁액을 각 관류 챔버로 끌어당기도록 지시합니다. 그런 다음 세포 현탁액에서 관류 챔버의 열린 끝을 제거하고 주사기 펌프에 액체 플러그를 열 블록에 고정된 부분으로 이동시킬 수 있을 만큼 충분한 공기를 끌어당기도록 지시합니다.

세포가 관류 챔버의 피브로넥틴 코팅된 내부 표면에 부착되도록 섭씨 37도에서 1-2시간 동안 배양합니다. 그 동안, 관류 챔버의 열린 끝을 신선한 성장 매체를 포함하는 새로운 저장소로 옮깁니다. 접착 기간이 끝나면 주사기 펌프에 액체 플러그를 낭비하도록 지시한 다음 10마이크로리터의 새 배지를 각 풍성 챔버로 끌어당긴 다음 접착된 세포 위에 새 배지를 배치할 수 있는 충분한 공기를 주입합니다.

섭씨 37도에서 세포를 계속 배양하고 배양물이 충분히 평형을 이루고 팽창할 때까지 2시간마다 배지를 교환합니다. 무늬. 46개의 인듐 주석 산화물 전극이 있는 DMF 모듈의 바닥 플레이트. 표준 사진 기술을 사용하여 화학 기상 증착을 통해 DMF 모듈의 바닥판을 5미크론의 Lene C로 코팅한 다음 50나노미터의 Teflon af로 스핀 코팅합니다.

다음 스핀 코트 및 un 패턴화 인듐 주석 산화물 유리 기판 50 나노 미터의 테프론 AF가 상판으로 사용됩니다. 금속 압축 프레임을 사용하여 플레이트 사이에 400미크론 간격을 유지하는 홈이 있는 폴리머 캐스트에 플레이트를 고정합니다. 2.5mm 제곱의 작동 전극 크기와 결합된 이 간격은 액적 부피를 전극당 2.5마이크로리터로 정의합니다.

그런 다음 테프론 코팅된 전사 마이크로 모세관을 DMF 플레이트 사이의 공간에 삽입합니다. 각 전달의 반대쪽 끝까지 동족 작동 전극의 가장자리까지 확장되도록 각각을 배치합니다. 마이크로 모세관은 캐 피트 피팅을 부착합니다.

다음으로, 전기 커넥터를 연결하여 인듐 10 산화물 전극에 전압을 공급합니다. 전극 활성화 시퀀스는 미리 결정된 스크립트를 실행하는 컴퓨터 제어 전자 인터페이스의 사용을 통해 자동화됩니다. 그런 다음 저장용기에 탑재된 DMF 모듈을 세포 자극, 세척 및 용해를 위한 적절한 시약으로 채웁니다.

어떤 경우에는 사용 직전 나중 단계에서 자극 자체를 로드하여 로드된 온보드 저장소에서 끌어와 DMF 모듈에 미세 방울을 분배하는 것이 가장 좋습니다. DMF 모듈과 전달 마이크로 모세관 사이의 이동을 포함한 미세 액적의 작동, 테스트. 블레즈. 먼저, 밀리리터당 100마이크로그램의 최종 농도에서 0.1%onic F1 27을 사용하여 신선한 배지에서 자극을 준비합니다.

그런 다음 80-100 마이크로 리터의 자극을 지정된 온보드 저장소에 적재합니다. 다음으로, 매체 저장소에서 관류 챔버의 열린 끝을 제거하고 전사 마이크로 모세관의 끝에 부착된 캐파이트 피팅에 삽입한 다음 주사기 펌프에 관류 챔버 내의 액체 플러그를 폐기물 용기로 보내도록 지시합니다. 다음으로, DMF 모듈에 10마이크로리터의 자극 방울을 생성하고 전달 마이크로 모세혈관을 통해 관류 챔버로 전달하도록 지시합니다.

필요한 경우 섭씨 37도에서 1-4시간 동안 자극으로 세포를 배양합니다. 자극 기간 이후 일정한 간격으로 새로운 자극으로 교환합니다. 주사기 펌프에 자극을 폐기물 용기로 보내도록 지시하고 DMF 모듈에 각 관류 챔버에 10마이크로리터의 세척 완충액 방울을 전달하도록 지시합니다.

세척 버퍼로 세포를 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 세척 버퍼를 10마이크로리터의 용해 용액으로 교체하고 추가로 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 주사기 펌프에 각 세포 용해물을 DMF 모듈로 보내도록 지시합니다.

DMF 모듈의 상판을 제거하고 물방울 사이에 교차 오염이 발생할 수 있으므로 플레이트를 옆으로 기울이지 않도록 주의하십시오. 마지막으로, 유전자 발현과 같은 오프 플랫폼 분석을 위해 피펫 맨을 사용하여 개방형 DMF 모듈에서 용해물을 수집하고, 정량적 R-T-P-C-R을 통해 프로파일링하여 다음 실험을 위한 플랫폼을 준비합니다. 먼저 전사 마이크로 모세관, CAPITE 피팅 및 DMF 모듈 플레이트를 10% 표백제에 실온에서 10분 동안 담그고 DMF 모듈 플레이트를 이소프로판올로 헹궈낸 후 탈이온수를 넣고 질소 가스를 사용하여 건조시킨 다음 섭씨 160도에서 10분 동안 굽습니다.

이 프로토콜에 설명된 시딩 방법은 관류 챔버당 약 500 미렌 대식세포를 부착하는 결과를 가져왔습니다. 섭씨 37도에서 16시간 동안 성장 배지로 세포를 배양한 후 집단 크기는 관류 챔버당 약 1000개의 세포로 두 배가 되었습니다. 다음은 박테리아에 대한 선천성 면역 반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 4가지 유전자에 대한 정량적 R-T-P-C-R 분석 결과입니다.

대식세포는 기존 또는 미시적 배양에서 성장시켰고 1시간 또는 4시간 동안 대장균 바이오 입자로 자극되었습니다. 파란색 막대는 기존 배양 세포의 자극 시 유전자 발현의 평균 폴드 증가를 나타내고, 빨간색 막대는 성장 및 자극된 세포에서 유도 발현을 나타냅니다. 마이크로 스케일 배양에서 오차 막대는 세 가지 독립적인 실험의 생물학적 복제물 간의 표준 편차를 나타냅니다.

유전자 발현 프로파일링 결과는 매우 유사했는데, 기존 배양은 웰 당 약 50, 000개의 세포가 있는 96개의 웰 플레이트를 사용한 반면, 마이크로 스케일의 배양은 관류 챔버 실험당 약 1000개의 세포가 있는 마이크로 모세관을 사용하여 가변성을 실험하기 위해 적어도 비슷했으며 마이크로 스케일에서 작동하는 더 짧은 오차 막대에서 알 수 있듯이 마이크로 배양에서 종종 감소했습니다. 세포 소비량을 5배 줄이고 시약 소비를 3배에서 50배까지 줄였습니다. 기존 실험과 비교됩니다.

이 방법은 거의 모든 부착 세포 유형을 배양하는 데 사용할 수 있으며, 경우에 따라 다른 세포 외 기질 구성 요소 또는 성장을 사용하여 사용할 수 있습니다. 중간 비부착 세포 유형은 까다로울 수 있지만, 세포 테더링 전략은 유사한 맥락에서 성공적인 것으로 나타났습니다. 여기에 설명된 접근 방식은 최대 24시간 동안 미시적 배양을 지원합니다.

이 플랫폼에는 장기 배양을 수행할 수 있는 모든 기능도 포함되어 있지만 세포 통과 프로토콜을 개발해야 합니다. 추가 모듈은 마이크로 모세관 인터커넥트를 통해 디지털 미세유체 cub에 통합될 수 있습니다. 이러한 방식으로 DMF는 복잡한 워크플로우를 수행하기 위해 주변 모듈을 연결하는 중앙 허브 역할을 합니다.

우리는 주로 감염원에 대한 숙주 전사 반응을 특성화하는 데 중점을 두었지만, 이 플랫폼은 매우 다재다능하게 설계되었으므로 다양한 연구 응용 분야를 지원할 것입니다.