마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

본 절차의 전반적인 목표는 반자동 마이크로플루이딕 기반 플랫폼을 구축 및 활용하여 소규모 세포군을 배양 및 자극하고, 분자 분석을 위한 세포 용해물을 회수하는 것입니다. 이는 먼저 세포 관류 챔버라고 불리는 피브로넥틴 코팅 마이크로 모세관 내에 마이크로 규모의 세포 배양을 확립함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 관류 챔버를 디지털 마이크로플루이딕스 또는 DMF 모듈에 연결하는 것이며, 이 모듈은 시약을 마이크로 규모의 세포 배양지로 보내고 다시 회수할 수 있는 유연한 수단을 제공합니다.

다음으로, DMF 모듈이 관심 자극을 관류 챔버로 전달하며, 세포는 정해진 노출 시간 동안 해당 자극과 함께 배양됩니다. 마지막으로, 화학적 방법으로 세포를 용해하고 용해물을 DMF 모듈로 회수하여 분자 분석을 수행합니다. 회수된 용해물은 정량적 R-T-P-C-R을 사용하여 분석함으로써 자극에 대한 세포 집단의 전사 반응을 특성화합니다.

기존의 세포 배양 방법과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은, 적은 양의 세포를 이용해 세포 자극 연구를 수행할 수 있으며 시약 또한 소량만 사용할 수 있다는 점입니다. 본 연구팀의 연구 결과, 마이크로 스케일에서 세포와 시약을 정밀하게 처리하는 이 플랫폼이 실험 간 변동성을 최소화한다는 것을 입증하였습니다. 또한, 이 플랫폼은 활용 범위가 매우 넓습니다.

디지털 미세유체 모듈은 세포와 시약을 관류 챔버로 유연하게 이동시킬 수 있어, 실험을 쉽고 빠르게 맞춤 설정하거나 재구성할 수 있습니다. 우선, 50 µg/mL 농도의 멸균 피브로넥틴 용액을 준비하고, 다포트 시린지 펌프를 사용하여 각 미세 모세관에 용액 30 µL를 흡입시켜 모세관 내벽의 코팅을 가속화합니다. 37 °C에서 2시간 동안 배양한 후, 피브로넥틴 용액을 회수하여 폐기하고 미세 모세관을 상온에서 6시간 동안 건조시킵니다.

다음으로, 파이버닌(fibronectin)이 코팅된 마이크로 모세관 또는 관류 챔버를 폴리카보네이트 튜브에 연결하고, 튜브를 캐필러리 피팅을 사용하여 시린지 펌프에 연결합니다. 여기에 제시된 설정은 6개의 관류 챔버를 지원하는 에이드포트(aid port) 시린지 펌프를 사용합니다. 테이프를 사용하여 각 관류 챔버의 본체를 히트 블록에 고정하고, 히트 블록의 온도를 37 °C로 설정합니다.

그 다음, 1ml당 100만 개의 세포 농도로 균일하게 분산되어 신선한 성장 배지에 부유된 세포가 담긴 저장조에 관류 챔버의 개방된 끝부분을 담급니다. 시린지 펌프를 조작하여 각 관류 챔버로 10µL의 세포 현탁액을 흡입합니다. 그런 다음 관류 챔버의 개방된 끝부분을 세포 현탁액에서 꺼내고, 시린지 펌프를 조작하여 액체 플러그가 히트 블록에 고정된 구역으로 이동할 수 있도록 충분한 양의 공기를 흡입합니다.

세포를 37 °C에서 1~2시간 동안 배양하여 perfusion chamber의 fibronectin 코팅된 내부 표면에 부착시킵니다. 그동안 perfusion chamber의 열린 끝부분을 신선한 성장 배지가 들어 있는 새 리저버로 옮깁니다. 부착 기간이 지나면, 시린지 펌프를 조작하여 액체 플러그를 폐기물 통으로 보내고, 각 perfusion chamber에 신선한 배지 10 µL를 끌어당긴 후, 부착된 세포 위에 신선한 배지가 위치하도록 적당량의 공기를 주입합니다.

세포를 37 °C에서 계속 배양하고, 배양액이 충분히 평형을 이루고 확장될 때까지 2시간마다 배지를 교체하십시오. 패턴. 46개의 인듐 주석 산화물 전극이 있는 DMF 모듈의 하단 플레이트입니다. 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 DMF 모듈의 하단 플레이트에 화학 기상 증착법으로 5 µm 두께의 Lene C를 코팅한 다음, 50 nm 두께의 Teflon af를 스핀 코팅하십시오.

다음으로, 상부 플레이트로 사용할 패턴이 없는 인듐 주석 산화물(indium tin oxide) 유리 기판에 50 nanometers 두께의 Teflon AF를 스핀 코팅합니다. 금속 압착 프레임을 사용하여 플레이트 사이의 간격이 400 micron으로 유지되는 홈이 있는 폴리머 캐스트에 플레이트를 고정합니다. 이 간격과 2.5 millimeters squared의 구동 전극 크기를 통해 전극당 액적 부피는 2.5 microliters로 정의됩니다.

그 다음, DMF 플레이트 사이의 공간에 테플론 코팅된 전송 마이크로 모세관을 삽입합니다. 각 모세관의 한쪽 끝은 해당 구동 전극의 가장자리에 닿게 하고, 반대쪽 끝에는 캡 피팅을 부착하여 배치합니다.

다음으로, Indium 10 산화물 전극에 전압을 공급하기 위해 전기 커넥터를 연결합니다. 전극 활성화 순서는 미리 설정된 스크립트를 실행하는 컴퓨터 제어 전자 인터페이스를 통해 자동화됩니다. 그런 다음 DMF 모듈의 온보드 저장소에 세포 자극, 세척 및 용해를 위한 적절한 시약을 채웁니다.

어떤 경우에는 온보드 저장소에 미리 적재해 두었다가 사용 직전 단계에서 자극제 자체를 로드하는 것이 가장 좋습니다. DMF 모듈 위에 마이크로 액적을 분주하십시오. DMF 모듈과 전송 마이크로 모세관 사이의 수송을 포함하여 마이크로 액적의 작동을 테스트하십시오. Blais. 먼저, 최종 농도가 100 µg/mL가 되도록 0.1%onic F1 27이 포함된 신선한 배지에 자극제를 준비하십시오.

그 다음, 80~100 µL의 자극제를 지정된 온보드 리저버에 채웁니다. 이어서, 배양액 리저버에서 퍼퓨전 챔버의 개방된 끝부분을 분리하여 전송 마이크로 모세관 끝에 부착된 커플링 피팅에 삽입한 후, 시린지 펌프를 작동시켜 퍼퓨전 챔버 내의 액체 플러그를 폐기물 컨테이너로 보냅니다. 다음으로, DMF 모듈이 10 µL의 자극제 액적을 생성하여 전송 마이크로 모세관을 통해 퍼퓨전 챔버로 전달하도록 설정합니다.

필요한 경우, 세포를 자극제와 함께 37 °C에서 1~4시간 동안 배양하십시오. 자극 기간 이후에는 정해진 간격으로 신선한 자극제로 교체하십시오. 시린지 펌프가 자극제를 폐기물 용기로 보내도록 설정하고, DMF 모듈이 각 관류 챔버에 10 µL의 세척 버퍼 방울을 전달하도록 설정하십시오.

세포를 세척 완충액과 함께 5분 동안 배양합니다. 그 후 세척 완충액을 10 µL의 용해 용액으로 교체하고 5분 더 배양합니다. 다음으로, 시린지 펌프를 조작하여 각 세포 용해물을 DMF 모듈로 보내도록 합니다.

액적 간의 교차 오염이 발생할 수 있으므로 상판을 옆으로 기울이지 않도록 주의하며 DMF 모듈의 상판을 제거합니다. 마지막으로, 다음 실험을 위해 플랫폼을 준비하기 위해 파이펫 맨을 사용하여 개방된 DMF 모듈에서 용해물을 수집하여 유전자 발현 분석, 정량적 R-T-P-C-R을 통한 프로파일링과 같은 오프-플랫폼 분석을 수행합니다. 먼저, 전송 마이크로 모세관, CAPITE 피팅 및 DMF 모듈 플레이트를 실온에서 10% 표백제에 10분 동안 담급니다. DMF 모듈 플레이트는 이소프로판올로 헹군 후 탈이온수로 헹구고 질소 가스를 사용하여 건조시킨 다음, 160 °C에서 10분 동안 베이킹합니다.

본 프로토콜에 기술된 파종 방법을 통해 관류 챔버당 약 500개의 miren 대식세포가 부착되었습니다. 37 °C의 성장 배지에서 16시간 동안 세포를 배양한 후, 세포 수는 관류 챔버당 약 1000개로 두 배 증가했습니다. 여기에는 박테리아에 대한 선천성 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 4개 유전자의 정량적 R-T-P-C-R 분석 결과가 제시되어 있습니다.

대식세포를 일반 배양 또는 마이크로스케일 배양으로 성장시킨 후, e coli 바이오 입자로 1시간 또는 4시간 동안 자극하였습니다. 파란색 막대는 일반 배양된 세포를 자극했을 때의 유전자 발현 평균 배수 증가량을 나타내며, 빨간색 막대는 성장 및 자극된 세포에서의 유도 발현량을 나타냅니다. 마이크로스케일 배양의 경우, 오차 막대는 3회의 독립적인 실험에서 얻은 생물학적 반복 시료 간의 표준 편차를 나타냅니다.

전통적인 배양 방식에서는 웰당 약 50,000개의 세포가 담긴 96-웰 플레이트를 사용한 반면, 마이크로 스케일 배양에서는 관류 챔버 실험당 약 1,000개의 세포가 포함된 마이크로 모세관을 사용했음에도 불구하고 유전자 발현 프로파일링 결과는 매우 유사했습니다. 실험 간 변동성은 마이크로 스케일 배양에서 더 짧은 오차 막대로 나타나듯이 최소한 대등하거나 종종 더 낮았습니다. 전통적인 실험과 비교했을 때 세포 소비량은 5배 감소했고, 시약 소비량은 3~50배 감소했습니다.

이 방법은 거의 모든 종류의 부착성 세포를 배양하는 데 사용될 수 있으며, 경우에 따라 다른 세포외 기질 성분이나 성장 배지를 사용할 수 있습니다. 비부착성 세포 유형은 까다로울 수 있으나, 유사한 상황에서 세포 테더링(cell tethering) 전략이 성공적인 것으로 나타났습니다. 여기서 설명하는 접근 방식은 최대 24시간 동안의 마이크로 스케일 배양을 지원합니다.

이 플랫폼은 장기 배양을 수행하는 데 필요한 모든 기능을 포함하고 있으나, 세포 계대 배양 프로토콜의 개발이 필요합니다. 추가 모듈은 마이크로 모세관 상호연결을 통해 디지털 미세유체 큐브에 통합될 수 있습니다. 이러한 방식으로 DMF는 복잡한 워크플로를 수행하기 위해 주변 모듈을 연결하는 중앙 허브 역할을 합니다.

우리는 주로 감염원에 대한 숙주의 전사 응답 특성을 규명하는 데 집중했지만, 이 플랫폼은 매우 다용도로 설계되었으므로 매우 다양한 연구 응용 분야를 지원할 수 있을 것입니다.