유전 조작

본 절차의 전반적인 목표는 Toxoplasma gondii의 type one 및 type two delta 2 80 균주를 사용하여 효율적이고 신뢰할 수 있는 유전자 교체를 수행하는 것입니다. 이는 먼저 서로 다른 5' 및 3' 유전자 타겟팅 DNA 플랭크(flank) 사이에 HX GPRT 선택성 마커를 정방향으로 융합하여 타겟팅 DNA 분자를 구축함으로써 이루어집니다. 본 절차의 두 번째 단계는 구축된 타겟팅 DNA 분자를 type one 또는 type two Toxoplasma gondii 균주에 형질전환시키는 것입니다.

세 번째 단계는 이중 교차 상동 재조합 사건을 인내심 있게 선택하고 개별 클론을 분리하는 것입니다. 마지막 단계는 분리된 돌연변이 클론에서 유전자 표적화 사건의 발생 여부를 검증하는 것입니다. 궁극적으로, 이 절차의 결과는 다양한 하위 응용 분석을 통해 표적 유전자 녹아웃, 유전자 교체 및 태그 유전자를 분석함으로써 기생충 유전자의 기능을 보여줄 수 있습니다.

이 기술이 이 기생충의 야생형 균주를 사용하는 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 타입 1 및 타입 2 delta 2 80 기생충 배경을 통해 정밀하게 유전적으로 정의된 균주를 생성하기 위한 표적 이중 교차 상동 재조합 이벤트를 매우 신뢰성 있게 선택할 수 있게 되었다는 점입니다. 이 기술은 특히 toxodb.org의 온라인 유전체 자원과 결합하여, 항독소 혈장 약물 치료를 위한 새로운 표적 발굴과 안전하고 효과적인 약독화 백신 균주의 개발 속도를 크게 높여줄 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 표적 DNA 분자의 설계나 Toxoplasma gondii의 유전적 조작에 어려움을 겪을 수 있습니다.

하지만, 환자의 숙련도와 신뢰할 수 있는 표적 분자의 설계가 성공을 보장할 것입니다. 먼저, 유전체 DNA로부터 표적 유전자의 5' 및 3' 게놈 표적 플랭크를 PCR로 증폭하여 프로토콜을 시작하십시오. 그다음, HX GPRT cDNA 미니 유전자 카세트로부터 5' 및 3' DHFR 플랭크가 포함된 HX GPRT 선택 마커를 PCR로 증폭하십시오.

효모 재조합 또는 유사한 방법을 사용하여 3D NA 분자들을 plasmid PRS 416에 올바른 5'에서 3' 방향으로 융합함으로써, 표적 유전자의 결손을 유도할 plasmid p delta GOI를 생성합니다. 그다음, 합류(confluent)된 HFF 세포가 담긴 25 cm 플라스크에 접종한 후 68~72시간 뒤에 T gia에 transfection하기 위해, 선형화된 타겟팅 plasmid 15~30 µg을 포함하는 100 µL 샘플을 준비합니다. HFF 세포의 90~95%가 용해되었음을 시각적으로 확인하여 갓 용해된 기생충의 존재를 검증합니다. 생존 가능한 기생충은 유전자 타겟팅에 필수적입니다.

액체가 플라스크 뚜껑 안쪽이나 목 부분에 튀지 않도록 주의하며 폐쇄된 플라스크를 세게 흔들어 생존 가능한 기생충이 용액에 잘 섞이도록 교반합니다. 플라스크에서 기생충을 회수하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형질전환을 준비합니다. 타겟팅 플라스미드를 delta CO 80 톡소플라스마(toxoplasma) 균주에 전기천공법으로 도입합니다.

전기천공된 혼합물을 합류된 HFF 세포와 30 milliliters의 감염 배지가 들어 있는 150 centimeter 플라스크로 옮깁니다. 감염된 배양물을 37 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 배양하며, 이는 transfection 후 약 20 hours 정도입니다. 배지를 MPA plus X 선택 배지로 교체합니다.

이제 기생충을 37 °C에서 약 8일 동안 방해 없이 배양합니다. 플라크(plaque)가 보이면 플라스크를 흔들어 단층 세포로부터 세포 외 기생충을 분리하여 기생충 용액을 생성합니다. 이 기생충 용액 약 0.5 mL를 5 mL의 MPA plus X 선택 배지가 들어 있고 HFF 세포가 합류(confluent) 상태인 새로운 25 cm 플라스크로 옮깁니다.

약 3일 후에 이 배양물을 PAs one A로 지정하십시오. 원래 플라스크에서 기생충 용액 0.5 mL를 동일한 선택 배지가 포함된 다른 HFF 세포 플라스크로 옮기는 과정을 반복하십시오. 이후 5일 동안 이 배양물을 PAs one B로 지정하십시오.

pfu 확인을 위해 1차 계대 A와 B를 모니터링합니다. 감염 구역(zones of infection)의 수가 25개 이상으로 적절한 1차 계대 A 또는 B 중 하나를 선택하여 서브 클로닝을 진행합니다. 기생충이 HFF 세포를 용해시킬 때마다, 배양물을 합류(confluent) 상태의 HFF 세포가 담긴 새로운 25 centimeter 플라스크로 옮기고 선택 배지를 추가합니다. transfection 3주 후, 기생충을 MPA plus X 배지로 적절한 농도가 되도록 희석하여 서브 클론용 신선한 기생충을 준비하고, 이 기생충 용액을 합류 상태의 HFF 세포가 포함된 96 well 트레이에 균일하게 분배합니다.

웰당 기생충 1마리의 농도로 첫 번째 트레이를 준비하고, 웰당 기생충 2마리의 농도로 두 번째 트레이를 준비합니다. 원래의 transfection 날짜 이후, 두 트레이 모두 37 °C에서 배양합니다. 1형 기생충의 경우 20일 이전, 2형 기생충의 경우 25일 이전에 기생충을 서브클로닝하지 마십시오.

온라인 텍스트에 설명된 대로 녹아웃 균주가 검증될 때까지 25 centimeter 플라스크 계대를 매주 일정에 따라 계속 진행합니다. 약 일주일 후 40~60배 배율로 96 웰 플레이트를 판독합니다. 50 µL로 설정된 피펫을 사용하여 단일 감염 구역으로 확인된 단일 PFU가 포함된 웰만 선택합니다.

PFU 위로 액체 흐름을 유도하여 웰 내부의 기생충을 분산시킴으로써 해당 웰들의 내용물을 혼합합니다. 선택된 웰들을 혼합한 후 4~5일 뒤에, 세포 용해가 일어난 클론 12개를 선택합니다. 96웰 트레이에서 12개의 클론을 24웰 트레이의 12개 웰로 옮깁니다. 이때 피펫 팁으로 웰 바닥을 긁어 6 µL를 흡입하여 옮깁니다.

용액을 1 mL의 MPA plus X 선택 배지가 포함된 HFF 세포가 합류 성장한 24-웰 트레이의 웰로 옮깁니다. 24-웰 트레이를 37 °C에서 배양하며 HFF 세포의 용해 여부를 모니터링합니다. 24-웰 트레이에서 세포가 용해된 웰의 기생충을 매주 일정에 따라 계대 배양합니다.

스크래치 및 드로잉 기법을 사용하여 기생충 용액 2 µL를 MPA 및 X 선택 배지가 포함된 새 플레이트로 옮깁니다. 계대 배양 후, 원래의 24-웰 트레이에서 기생충을 수확하여 DNA 수집을 위해 작은 튜브로 옮깁니다.

마지막으로, PCR을 사용하여 표적 유전자의 결실 여부를 테스트함으로써 5' 및 3' 표적 플랭크의 통합을 확인하십시오. 또한 HX GPRT 선택 표지자의 존재 여부를 확인하십시오. 본 프로토콜은 조작된 delta Q 80 균주에서 HX GPRT 표지자를 제거하기 위한 것이며, 자세한 내용은 온라인 텍스트에 설명되어 있습니다.

P delta GOYC는 6가지 TX 배지를 이용한 음성 선택을 통해 기생충에서 HX GPRT를 제거하는 것을 목표로 합니다. 그 후 PCR을 사용하여 HX GPRT의 소실을 확인하며, 로커스에서 HX GPRT가 제거되지 않은 경우에는 1.2 Kilobase pair 밴드가 나타납니다. 제거된 경우에는 3.4 kilobase pair 밴드가 나타납니다.

이 프로토콜의 마지막 부분인 단백질의 C-말단 태깅(C terminal tagging) 또한 온라인 텍스트에 상세히 설명되어 있습니다. 표적 유전자 결손을 만들기 위한 개요 프로토콜을 수행한 후, 일반적으로 표적 지정이 어려운 부위인 type one R 18의 녹아웃(knockout) 결손 여부를 확인하기 위해 PCR을 사용하였습니다. PCR 1은 R 18 유전자 PCR 생성물이 없음을 보여줍니다.

PCR 2는 3' R 18 게놈 표적 플랭크의 존재를 보여줍니다. PCR 3과 PCR 4는 선택 마커가 5' 및 3' 게놈 표적 플랭크 사이에 적절히 통합되었음을 보여주며, 이는 R 18 결실이 이루어졌음을 정의합니다. 균주에서 후속 결실을 만들기 위해 선택 마커를 재사용하려면, 먼저 해당 유전자 좌위에서 기존의 HX GPRT를 제거해야 합니다. 설명된 프로토콜을 따른 후 다음과 같이 진행합니다.

균주 delta two 80 delta GRA two에서 HX GPRT가 삭제된 GRA two 두 locus로부터 제거되었습니다. 1.2 kb 밴드로 나타나는 HX GPRT의 소실을 확인하기 위해 HX GPRT-PCR을 사용하였습니다. HX GPRT가 제거되지 않았을 때는 3.4 kb 밴드가 나타났습니다. 초기 유전자 표적화 단계 이후, 동일한 type one 또는 type two 균주에서 다중 녹아웃을 구축하거나, "이 단백질은 세포 내 어디에 위치하는가?"와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 돌연변이 균주에 태그를 붙이거나 보충하는 추가적인 유전자 표적화 방법을 적용할 수 있습니다.

또는 이 단백질이나 경로의 생물학적 기능을 설명하는 핵심 도메인이나 활성은 무엇입니까? 이 기술은 해당 분야의 연구자들이 모델 AP 복합체 및 기생충 toxoplasma에서 기생충 유전자 기능에 대한 탐구를 확대할 수 있는 길을 열어줍니다. Gandhi eye.

Toxoplasma를 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 전체 과정 동안 모든 BSL 2 가이드라인을 준수하는 등의 예방 조치를 유지해야 함을 잊지 마십시오.