Name: 유전 조작 Δku80 균주 톡소 포자충 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 Toxoplasma gondii의 Δku80 균주를 이용한 유전자 표적 교체 방법입니다. HXGPRT 선택 마커와 동원 재조합을 활용하여 정확한 유전자 결실 및 태깅을 수행하고 기생충 유전체 기능 연구를 가속화하세요.

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이 작품은 DJB에 NIH에서 교부금 (AI041930, AI073142, AI075931, 및 AI091461)에 의해 지원되었다.

<ol><li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li>
<li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li>
<li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5%27-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li>
<li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li>
<li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+the+model+apicomplexan%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li>
<li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToxoDB%3A+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+research%22%5BJournal%5D)">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li>
<li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma%3A+the+next+100+years%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection+%2F+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li>
<li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236(2011).</li>
<li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3%2C+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li>
<li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li>
<li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li>
<li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Pathog%22%5BJournal%5D)">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007(2011).</li>
<li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li>
<li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+tagging%2C+cloning%2C+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li>
<li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii%3A+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li>
<li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li>
<li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li>
<li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li>
<li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+%27intracellular%27+buffer+increases+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902(1992).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li>
<li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+%28TgAMA1%29+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에서 우리는 대상 유전자 삭제, 유전자 대체, 그리고 / 또는 태그 유전자를 가지고 유전자 조작 자손의 효율적인 복구를 가능하게 Δ ku80 기생충 변종 대상으로 효율적인 유전자에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 방법의 순차적 인 실행은 1-3 단일 또는 여러 대상으로 유전자 조작을 포함하는 기생충 돌연변이 체의 분리에 대한 안정적인 접근 방식을 제공합니다. 대상 삭제의 생성이 여러 요인에 따라 다르지만, 제시된 전략 및 프로토콜 Δ ku80 변형의 사용은 크게 T.를 정확히 정의 된 돌연변이 균주를 제작의 효율성과 편의성을 향상 기능 게놈 연구를위한 gondii의. T.의 게놈 무성 생식 단계에서 gondii의이 반수체 있습니다. 따라서 유전자를 삭제할 계획 할 때 만들 수있는 고려 사항은 유전자가 생체에 필수적인해서는 안 것입니다. 그럼에도 불구하고, 타지의 효율성Δ ku80 변종 팅 유전자 녹아웃은 매우 높고, 이는 크게 손상 복제 속도로 돌연변이 균주의 분리 할 수 있습니다. 대상 유전자가 중요한 경우, 기생충은 종종 선택하는 동안 복제를 중단. 타겟 유전자 조작의 또 다른 중요한 요인은 유전 표적 측면의 적어도 620 BP가 검출 대상 통합 2를 얻기 위해 필요로 완벽한 동성이다. 동성 이상 지역 타겟팅 약 1,000 BP의 DNA의 측면을 대상으로하는 1-4 안정적이고 효율적인 방법입니다 사용하여 높은 효율을 생산하고 있습니다. 이러한 이유로 게놈 대상 측면은 T.의 동일한 균주에서 생성하는 것이 중요합니다 유전자 조작되고 변형 등 포자충 (RH, 저기,). 충분한 유사성의 부족은 종종 하나의 게놈 대상 측면의 대상으로 통합 될,하지만 다른 할 수 없습니다. 완전 통합 또는 녹아웃 엄마를 얻기 위해 실패Y는 에피 솜 지속성으로 인해합니다. 즉시 형질 전환 후, 표적 분자의 모든 episomes를 통합되지 않은 있으며, 때로는 표적 분자는 여러 세대 episomes로 유지할 수 있습니다. 1 ~ KBP 목표 DNA의 측면을 사용하기 전에 다시 서브 클로닝을 선택에서 기생충을 전달하기 위해 계속하는 것은 자주 에피 솜 지속성과 관련된 문제를 해결합니다. 한방의 유효성을 검사하고 HXGPRT 마커가 제거되면, 유전자 표적 전략은 1-3 단일 기생충 긴장에서 여러 유전자의 삭제를 생성하는 두 번째 GOI에 반복 할 수 있습니다. 삭제, 교체 또는 태그 유전자의 생성은 또한 다른 선택 마커 (블레오 마이신, CAT, pyrimethamine 저항 DHFR 등)를 사용하여 수행 할 수 있습니다. CAT 선택 마커가 현재 유형 II Δ ku80 저기, 게놈 1에 존재하지만,이 마커는 HXGPRT를 사용하여 제거 할 수 있습니다 </방명록&gt; 선택 프로토콜은 여기에 설명. 우리 손에, HXGPRT 선택이 단일 복사본을 대상으로 삽입 MPA + X 중간. HXGPRT의 강력한 선택에 대한 충분한 곳 가장 높은 대상으로 효율성을 가장 안전하고 가장 효율적인 마커도의 타겟 삭제 현재 유일하게 유용한 방법을 제공합니다 6 thioxanthine (6TX) 선택 2,3를 사용하여 선택 마커 (그림 3). 따라서이 프로토콜은 여러 타겟 유전자 조작으로 정의 된 돌연변이 균주 개발을위한 현재의 유일한 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 톡소 포자충의 Δ ku80 변종 타겟 유전자 조작을위한 귀중하고 효율적인 방법을 제공하며, 하나의 유전자, 유전자의 가족, 또는 게놈 전체의 기능 게놈 연구의 분석에 적용 할 수 있습니다. 이전 Δ ku80 변종 1,2의 가용성에, 이러한 방식은 오프라인으로 인해 널리 실현되지 않았다이러한 방법 fficiency. 따라서,이 프로토콜은 톡소 포자충의 타겟 유전자 조작 광범위하게 적용하고 기생충 생물학, 호스트 응답 및 기능 유전체학에 대한 질문의 범위를 주소에 관심있는 모든 연구자에 액세스 할 수 있습니다.

톡소 포자충은 종종 일반적인 의무 세포 내 원생 기생충이며, 만성적으로 동물과 인간 5의 넓은 범위를 감염. 그것은이 병원균에 의해 10 억 이상의 인류가 현재 추정하고 만성 감염됩니다. T.에 의한 질병의 중요성에 추가 체외 성장과 우수한 마우스 모델에서 T. 만든의 gondii의 감염, 실험 도구, 강력한 게놈 자원 6의 증가 가용성, 편의성 gondii의 세포 진핵 병원체 및 말라리아 (Plasmodium의 SP에.) 및 크립토스포리디움 (Cryptosporidium의) 5,7과 같은 치명적인 질병을 일으키는 원인이 다른 중요한 apicomplexan 기생충의 광범위한 연구를위한 선도적 인 모델 시스템. 모델 생물로 톡소 포자충의 중요한 한계는 유전자 조작을 대상으로 나른다 자손의 비효율적 복구되었습니다. 이 proble 나유전자 타겟팅의 M은 T의 야생형 균주의 동종 재조합의 매우 높은 주파수를 기준으로 상동 재조합의 낮은 주파수로 인해 광범위한 DNA 상 동성이 유전자 연구 2에 사용되는 DNA의 표적 분자에 제공되는 gondii의 경우에도. 우리는 최근 유전자 타입 동종 재조합의 주요 통로를 차단 KU80 단백질 1,2 인코딩 유전자를 삭제하여 I 및 유형 II 톡소 포자충의 변종. I 및 유형 II Δ ku80 변종 정상적인 성장 속도, 크기 및 in vitro와 in vivo에서 체외 tachyzoite 및 bradyzoite 단계에서 생체의 두 동작을 결과 형식은, 그러나, 이러한 변형은 기본적으로 100 % 상동 재조합의 빈도와이 전시 표현형은 몇 칸토에 수백의 표적 유전자 조작으로 빠르게 분리 원하는 자손의 가능성을 증가USand에서 배 1,2,4. 최근 사회 전반 I 및 유형 II Δ ku80 긴장이 속도까지 크게 램핑이 유형의 사용, 다양한뿐만 아니라, T.의 표적 유전자 접근 방법의 성공률 gondii의 1-4,8-13. 여기에서 우리는 T.의 Δ ku80 변종 대상으로 유전자 삭제, 유전자 교체, 유전자 태그에 대한 포괄적 인 프로토콜을 설명 gondii의. 우리는 디자인하고 안정적으로 톡소 포자충의 Δ ku80 균주의 특정 유전자 또는 유전자 좌위에 유전자 조작을 대상으로하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Overlap Primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td></tr><tr><td>Validation Primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>100 nmole DNA Oligo</td></tr><tr><td>Yeast Strain #90845</td><td>ATCC</td><td></td><td>Designation FY834</td></tr><tr><td>Shuttle Vector pRS416</td><td>ATCC</td><td>87521</td><td></td></tr><tr><td>DH10B E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>12033-015</td><td>E. coli</td></tr><tr><td>Resuspension Buffer</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit Miniprep Kit</td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td></td></tr><tr><td>Glass Beads</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-BG05</td><td>0.5mm 산 세척</td></tr><tr><td>Qiacube 자동 로봇 워크 스테이션</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvette</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td>2mm-gap</td></tr><tr><td>BTX600 electroporator</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td></tr><tr><td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td><td>Corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td><td>Corning</td><td>430823</td><td></td></tr><tr><td>인간 포피 섬유아세포(HFF) 세포</td><td>ATCC</td><td>SCRC1041</td><td></td></tr><tr><td>Swin-lok 필터 홀더</td><td>Whatman</td><td>420200</td><td>25mm</td></tr><tr><td>직경</td><td>멤브레인 Whatman</td><td>110612</td><td>Nucleopore 트랙 에칭 멤브레인 3mm 기공 크기, 25mm</td></tr><tr><td>직경 마이코페놀산(MPA)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>크산틴(X)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96웰 조직 배양 트레이</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24웰 조직 배양 트레이</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Eagle Media</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>12-611F</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제(항안티)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>스핀 컬럼</td><td>프림 Labs</td><td>PAE-100</td><td>Easy Clean DNA 추출 스핀 키트</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-thioxanthine</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue DNA Minikit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>QIAamp DNA 혈액 미니 키트</td></tr><tr><td>세포 배양 동결/회수 매체</td><td>Gibco</td><td>126-48-010</td><td></td></tr><tr><td>Buffered</td><td>Saline Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>- 칼슘, - 마그네슘</td></tr></tbody></table>

유전 조작<em&gt; Δku80</em의 기능 게놈 분석을위한&gt; 균주<em&gt; 톡소 포자충</em

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

상동 재조합을 사용하여 대상 유전자 조작 유전자 기능과 표현형 (들)의 상세보기를 얻을 수있는 기능 게놈 분석을 위해 선택의 방법입니다. 표적 유전자의 삭제, 대상 돌연변이 보완 유전자 기능 및 / 또는 태그 유전자 돌연변이 균주의 개발은 이러한 유전자 조작을 효율적으로 이중으로 통합 중재를 사용하여 그 유전자 현장을 대상으로 할 수있는 경우, 특히 유전자 기능을 해결하기 위해 강력한 전략을 제공합니다 상동 재조합을 통해 교차합니다. 톡소 포자충의 동종 재조합, 기능 게놈 분석의 매우 높은 속도로 인해 이전에 특정 유전자 좌위에 유전자 삭제 및 유전자 교체 대상에 대한 효율적인 방법의 부재로 제한되었습니다. 최근에, 우리는 유형 I 및 유형 II T의 변종 동종 재조합의 주요 통로를 폐지 유전자 encodin을 삭제하여 gondii의G KU80 단백질 1,2. Δku80 균주 tachyzoite (급성) 및 in vitro와 in vivo에서 bradyzoite (만성) 단계에서 일반적으로 행동과 상동 재조합 본질적으로 100 %의 빈도를 나타냅니다. Δ ku80 균주는 단일 유전자뿐만 아니라 게놈 규모의 1-4 페이지의 기능 게놈 연구는 가능합니다. 여기, 우리는 I 및 유형 II Δku80Δhxgprt 균주는 T.의 유전자 타겟팅 방식을 사전에 유형을 사용하는 방법을보고 gondii의. 우리는 산틴 - 크 산틴-구아닌의 phosphoribosyltransferase (HXGPRT) 선택 마커의 대상 삽입 또는 삭제에 의해 유전자 삭제, 유전자 교체 및 태그 유전자를 생성하기위한 효율적인 방법을 설명합니다. 프로토콜을 대상으로 설명하는 유전자는 기생충 게놈의 기능 분석을 진행하고 수행 한 균주를 개발하는 Δku80 변종 다양한 방법으로 사용할 수 있습니다여러 유전자 조작을 대상으로. 이 유전 적 방법과 이후의 표현형 분석의 응용 프로그램은 T.의 생물학의 기본적이고 독특한 측면을 보여줄 것입니다 gondii의 말라리아 (Plasmodium의 SP에.) 및 크립토스포리디움 (Cryptosporidium의)이 발생할 관련된 중요한 인간 병원체.

자세한 템플릿은 제한 효소 사이트의 배치에 HXGPRT의 후속 삭제 유전 표적 유전자의 검증 대상뿐만 아니라, 플라스미드 건설을 촉진 프라이머의 생성을 포함, 유전자를 삭제 대상으로 플라스미드를 구축 제공됩니다 단일 단계 과정 (그림 1A-C, 그림 2A, 그림 3A). 일반 회로도 예를 들면, 목표 유전자 삭제 (그림 2A), 녹아웃의 삭제를 확인하는 데 사용되는 프라이머 쌍을 만들기 위해 제시, 유형 I rop18 (그림 2B) 및 PCR 검증의 대표적인 결과가 표시됩니다 (그림 2C). 이 대표 결과는 대상 상대적으로 어려운 유전자 좌위에서 얻을 수있는 결과의 범위를 설명하기 위해 표시됩니다. 성공적으로 목표 유전자 삭제에서의 유전자의 부재가 발생합니다관심이 늘어 PCR 제품 (PCR 1), (3)의 존재 &#39;게놈 대상 측면 (PCR2), 제대로 5 사이의 통합 HXGPRT 선택 마커의 존재&#39;와 (PCR3와 후 pCR4) 삭제를 정의 3 &#39;게놈 대상 측면 . 클론 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11 HXGPRT가 GOI (그림 2C)를 대체했다 타겟 유전자의 삭제를 (녹아웃) 확인됩니다. 유전자의 삭제를 포함하지 않는 클론은 밴딩 다양한 패턴으로 표현 될 수있다. 일반적으로 유전자의 삭제없이 복제는 PCR1 및 PCR2 관찰 밴드 부모의 변형 (부모 패턴)을 반영하지만 클론 1과 2 (그림 2C)를위한 것과 같이 PCR3 또는 후 pCR4합니다.합니다 이 &quot;부모의 패턴은&quot;몇 가지 잠재적 인 메커니즘에서 발생합니다. 때때로, MPA 저항 선택한 기생충 플라스미드 대상 pΔGOI의 비 통합 지속 episomes을 가지고, 우리는 계속 선택은 종종 이러한 episomes에게 강제주의통합 할 수 있습니다. 우리는 또한 내가 Δ는 pΔGOI의 의도 통합으로 인해 ku80 변형 DHFR 5 &#39;와 3&#39;발기인 요소 DHFR 유전자 좌도에 또는 부분적으로 삭제 HXGPRT에 통해 표현 HXGPRT의 cDNA를 포함하는 플라스미드 대상 형식 드문 배경을 준수 현장 14. 이 희귀 한 이벤트가 타겟 통합이지만, 그것은 의도 된 통합 아니었다 어떤 유전자 교체 전략을 설계 기억하는 핵심 역할을합니다. 타겟팅 pΔGOI에 실시 120 bp의보다 큰 DNA 상 동성이 플라스미드 원하지 않는 배경을 돌려 줄 수 Δ ku80 변종 2 재결합 다른 사이트를 제공 할 수 있습니다. HXGPRT 선택 마커 타입 II 형 DNA와 비교할 때 염기 다형성이 나는 순서를 기반으로하기 때문에 유형 II 저기, Δ ku80 변형이 배경이 감소 또는 존재하지 않는 나는을 입력 비교하는크게 유형 II 저기, Δ ku80 변형 1을 사용하여 실험이 드문 배경 줄어 듭니다. 유전자 현장은 (삭제할 수없는) 필수, 또는 현장에서 주파수를 대상으로, 또는 매우 낮은 유전자를 가지고 있다면 경우 episomes 쉽게 성장과 선택을 통해 제거되지 않습니다 【비 통합],이 부모 패턴 MPA에서 관찰 된 패턴을 지배하게 될 것이다 지속 저항 클론. 또한, 표적 DNA 분자는 때때로 단지 5 &#39;또는 3&#39;게놈 대상 측면과 밴드 (하지만 둘 다) 클론 10 같이 PCR1 및 PCR2과 함께 (5 PCR3 또는 후 pCR4 중 하나에 대한 관찰에 통합하는 관찰 &#39;통합) 및 복제 7 (3&#39;통합) (그림 2C). 이러한 패턴은 HXGPRT을 통합 만이 대상으로 통합이 관심의 유전자를 삭제하지 않는 현장에서 대상 플라스미드의 통합을 통해 단일 십자가의 드문 발생을 제안한다. 이 패턴 (레인 7 및 그림 2C 10) EM그 대상 통합 대신 발생 확인하는 PCR 데이터를보고 할 필요가 phasizes 하나는 동종 건너와 표적 분자의 동종 번째 통합. 드물게, 우리는 부모의 패턴 타겟 삭제 패턴을 모두 나타냅니다 클론 12 (그림 2C)로 표현 유전 적 혼합을 준수합니다. 이 패턴은 대부분 잘 복제에서 동일한 위치에 존재하는 두 개의 기생충 유전자형의 경우에 발생합니다. Δ ku80Δgoi에서 HXGPRT의 제거를위한 일반적인 회로도 :: HXGPRT 긴장에서 HXGPRT을 삭제할 수는 (그림 3A) 표시됩니다. 클론 4, 7, 9, 11, 12 (그림 3C)에서 볼 수 있듯이 Δ ku80 Δ gra2 :: HXGPRT (그림 3B)에서 HXGPRT의 제거의 유효성을 검사하는 데 사용되는 프라이머 쌍은 PCR5에 고유 한 ~ 1.2 KBP 대역을 증폭. HXGPRT는 궤적, 2 ~ 3에서 제거되지 않은 경우.4 KBP 밴드는 (클론 1, 2, 3, 6, 8, 10 및 부모의 통제) 관찰된다. 몇 가지 메커니즘 HXGPRT의 제거 (6TX 선택) 더 도전적이고 HXGPRT의 통합 (MPA는 + X 선택)보다 효율적으로 만들기 위해 행동한다. MPA 선택은 6TX 선택 14,16 단순히 더 효율적입니다. 또한, HXGPRT 표현의 높은 수준은 MPA 선택 16,24보다 6TX 선택을 위해 필요합니다. 따라서, HXGPRT 효소 활동이나 돌연변이 또는 유전자의 현장에서 HXGPRT의 발현을 감소 성적인 변화를 줄일 수 변이는 잠재적 6TX 선택의 효과를 폐지 할 수 있습니다. 심지어 6TX 선택의 이러한 도전, Δ ku80 변종 6TX 선택의 성공률은 1-3의 첫 번째 시도에서 90 %보다 큽니다. 단백질 코딩 유전자의 직접 C-말단 태그에 대한 일반적인 구조는 (그림 4) 표시됩니다. 이방식은 태그 유전자의 HXGPRT 3 &#39;의 상동 재조합을 통해 더블 크로스를 통해 직접 통합을 사용하며 위에서 설명한 것과 유사한 검증 전략을 사용합니다. 유전자는이 플라스미드 독립적으로 격리 대상으로 DNA와 두 번째 형질 전환을 사용하여 확인할 수있다 필수적인 유전자로 의심됩니다. 이러한 규제 유전자 발현에 대한 계획과 같은 다른 방법은 유전자가 25 중요한 경우 추가 검증에 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> 그림 1. 플라스미드 대상 DNA의 설계의 개요. 설계. 도식은 PCR이 pRS416 셔틀 벡터와 HXGPRT의 minigene 카세트에 대한 33 bp의 겹침 5 &#39;와 3&#39;대상 측면을 증폭하는 데 사용되는 프라이머를 중복. 회로도에 나와 뇌관이었다5 &#39;및 3&#39;pΔROP18 10의 목표 측면. 표적 DNA 분자를 설계 B. 전반적인 전략을 생성하는 데 사용됩니다. pΔGOI의 백본 pRS416 셔틀 벡터를 포함하는 우라실 (URA) 및 암피실린 (AMP) 선택 마커입니다. ~ 1 KBP 5입니다 pRS416에 삽입 된 &#39;F1과 R1 프라이머를 사용하여 HXGPRT의 minigene 카세트 및 pRS416에 대한 중복과 게놈 DNA에서 증폭 된 DNA 대상 측면은 1 ~ KBP 3&#39;DNA 대상 측면을위한 중복과 게놈 DNA에서 증폭된다 HXGPRT의 minigene 카세트와 F2와 R2 프라이머 HXGPRT의 minigene 카세트를 사용 pRS416. 다음과 같은 고유 한 제한 효소 소화 사이트는 프라이머에 추가됩니다 F1 입문서는 re.X (제한 효소 X 컷 사이트) R2에 RE.Y, DNA 대상 측면 5 &#39;5의 끝&#39;에서 플라스미드를 잘라 소비세 HXGPRT 분에 R1 및 F2 프라이머의 DNA 대상 측면과 RE.Z 3 &#39;3 끝&#39;에서 플라스미드를 절단하는 프라이머rop18의 삭제 대상 구조를 생성하는 데 사용 igene 카세트입니다. C. 뇌관 시퀀스. 굵은 지역은 T.에 해당 gondii의 게놈 시퀀스와 굵은 글씨 이외의 지역 pRS416 및 HXGPRT의 minigene 카세트와 중복 제한 효소 사이트 및 시퀀스에 해당합니다. HX_F 및 HX_R 프라이머 쌍은 HXGPRT minigene 카세트 14 증폭. 프라이머는 5 ~ &#39;3&#39;읽어보십시오. 펜트 레스 등 10 일부터 적용 표. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> 그림 2. HXGPRT를 사용하여 유전자의 삭제에 대한 프로토콜의 개요. . DisruptioN 번 교차하여 Δ ku80Δhxgprt 변형에 GOI ~ 1 KBP 5 &#39;DNA 대상 측면과 ~ 1 KBP 3&#39;플라스미드 pΔGOI에 DNA 대상 측면을 사용하여 상동 재조합 이벤트. PCR의 PCR1를 사용하여 전략 PCR2, PCR3 및 후 pCR4은 (눈금 표시) GOI 궤적의 대상 HXGPRT의 통합 및 삭제를 가진 복제 시스템의 유효성을 검사하는 유전자형 확인을 가능하게하는 표시됩니다. B. 대표 프라이머 쌍은 rop18의 삭제를 검증하기 위해 설계 . ROP18_DF 및 ROP18_DR는 PCR1, ROP18_ExF 및 ROP18_CxR이 PCR2, ROP18_CxF 및 DHFR_CxR이 후 pCR4을 (그림 2A 참조) 증폭 PCR3 및 DHFR_CxF 및 ROP18_CxR을 증폭 증폭 증폭. 프라이머는 5 ~ &#39;3&#39;읽어보십시오. 표 펜트 레스 등의 HXGPRT를 사용하여 목표 유전자 삭제 (rop18)의 검증 10. C. 대표 결과를 적응. MPA의 Δ ku80Δhxgprt 및 선택에 플라스미드 pΔROP18의 다음 형질 +X, MPA + X 저항하는 클론 rop18의 삭제을 분석 하였다. 부모의 변형 제어 PCR 3 (~ 1,200 BP)과 PCR을위한 PCR 1 (~ 400 bp의) 및 PCR 2 (~ 650 bp의) 제품에 대한 긍정적이고 부정적인 4 (~ 1,300 BP) 제품입니다. 대상 GOI 녹아웃은 PCR2, PCR3 및 후 pCR4 제품에 대한 긍정적이며 (그림 2A 참조) PCR 한 제품에 대한 음수입니다. 표시는 PCR1 및 PCR2 (상단 패널)의 결과를 대표 패널, PCR3 (중간 패널) 및 후 pCR4 (아래 패널)입니다. 클론 3, 4, 5, 6, 8, 9, 11은 복제의 타겟 유전자의 삭제 이벤트를 정의 PCR 1, PCR2, PCR3 및 후 pCR4의 정확한 밴딩 패턴을 나타냅니다. 클론 1, 2, 7, 10, 12 유전자 삭제하지 않습니다, 그리고 기타 잠재적 대표 결과에 해당합니다. (C = 부모의 통제 변형 Δ ku80Δhxgprt, M = 크기 마커). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> 그림 3. 관심의 유전자가 HXGPRT를 삭제하려면 다시 대상의 프로토콜의 개요. 더블 크로스 오버로 HXGPRT 선택 마커 제거 변형 Δ ku80Δgoi에서 상동 재조합 이벤트 :: HXGPRT은 1 ~ KBP 5 &#39;DNA 대상 측면과 ~ 1 KBP 3&#39;플라스미드 pΔGOIc에 DNA 대상 측면을 사용 A. 전략. 유전자형 확인을위한 PCR 전략은 (눈금 표시) 삭제를 걸쳐 PCR 제품 (PCR5)에 대한 분석에 프라이머 쌍을 사용하여 묘사된다. B.는 gra2에서 HXGPRT 선택 마커의 제거를 확인하기 위해 설계 담당자 프라이머 쌍 변형 Δ ku80Δgra2의 궤적 :: HXGPRT. 프라이머 GRA2 _CLF 및 GRA2_CxR는 PCR5를 증폭. 프라이머<html> 5 ~ 6TX에 Δ ku80Δgoi :: HXGPRT 및 선택에 플라스미드 pΔGOIc의 다음과 같은 형질을 얻을 수 있습니다 6TX 저항 클론. C. 대표위원회 &#39;3&#39;읽어보십시오. 클론 4, 7, 9, 11, 12 HXGPRT 마커의 대상 삭제 (~ 1.2 KBP 제품 그 측면 &#39;5에 약간의 중복에 측면&#39;과 3 &#39;외부 3에 걸쳐에 해당 PCR5의 정확한 밴딩 패턴을 전시 측면). 클론 1, 2, 3, 6, 8, 10 (이 밴드 빛)이 복제가 허용 6TX에 대한 저항의 정도를 전시에도 불구하고, 부모의 복제 유전자형에 해당하는 3.4 KBP ~ 주위의 예상 줄무늬 패턴을 나타냅니다 자신의 선택 (이 표현형은 가끔 (프로토콜 2.1 (8 단계)에있는 주 및 대표 결과 섹션을 참조하십시오) 셧다운 HXGPRT의 발현에 의해 자발적으로 발생할 수 있습니다. (C = 부모의 통제 변형 Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = 크기 마커).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> 그림 4. 단백질의 C-말단에 태그를 대상으로 DNA 분자의 디자인. 전략은 또한 3 &#39;하류 규제 영역으로 작동 할 수 HXGPRT 마커의 기능을 기반으로합니다. pΔGOItag의 백본 pRS416 셔틀 벡터 포함 우라실 (URA) 및 암피실린 (AMP) 선택 마커입니다. DNA 대상 측면에 대한 중복과 게놈 DNA에서 증폭 ~ 1 KBP 5 &#39;Fgoi 및 Rtag 프라이머 ~ 1 KBP 3 사용 HXGPRT의 minigene 카세트 및 pRS416에 대한 중복과 게놈 DNA에서 증폭 된 DNA 대상 측면&#39;은 pRS416에 삽입 F2와 R2를 사용하여 HXGPRT의 minigene 카세트 및 pRS416프라이머 및 HXGPRT의 minigene 카세트입니다. 5 &#39;DNA 대상 측면은 대체 종료 코돈 다음 태그 (HA, Myc와 그의 등) 종료 코돈을 대체합니다. MPA + X 선택은 C-말단 태그와 하류 HXGPRT을 통합하고, HXGPRT 마커 다음 위치 3 &#39;UTR 이동합니다. 다음과 같은 고유 한 제한 효소 소화 사이트는 프라이머에 추가됩니다 Fgoi 프라이머의는 re.X (제한 효소 X 컷 사이트) DNA 대상 측면 5 &#39;5의 끝&#39;에서 플라스미드를 잘라 RE.Y에 플라스미드 건설에 사용하는 다시 대상 태그 유전자 현장 삭제하려면 HXGPRT의 minigene 카세트 소비세에 Rtag 및 F2 프라이머의 DNA 대상 측면 3 &#39;3 끝&#39;에서 플라스미드 및 RE.Z을 잘라 R2 프라이머 3 &#39;UTR의 위치를 복원합니다 HXGPRT 마커.

여기에서 우리는 유형 I 및 유형 II를 사용하는 방법을보고<em&gt; Δku80</em의&gt; 변종<em&gt; 톡소 포자충</em&gt; 효율적으로 기능 게놈 분석 대상으로 유전자 삭제 및 유전자 교체를 생성합니다.

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

본 절차의 전반적인 목표는 Toxoplasma gondii의 type one 및 type two delta 2 80 균주를 사용하여 효율적이고 신뢰할 수 있는 유전자 교체를 수행하는 것입니다. 이는 먼저 서로 다른 5' 및 3' 유전자 타겟팅 DNA 플랭크(flank) 사이에 HX GPRT 선택성 마커를 정방향으로 융합하여 타겟팅 DNA 분자를 구축함으로써 이루어집니다. 본 절차의 두 번째 단계는 구축된 타겟팅 DNA 분자를 type one 또는 type two Toxoplasma gondii 균주에 형질전환시키는 것입니다.세 번째 단계는 이중 교차 상동 재조합 사건을 인내심 있게 선택하고 개별 클론을 분리하는 것입니다. 마지막 단계는 분리된 돌연변이 클론에서 유전자 표적화 사건의 발생 여부를 검증하는 것입니다. 궁극적으로, 이 절차의 결과는 다양한 하위 응용 분석을 통해 표적 유전자 녹아웃, 유전자 교체 및 태그 유전자를 분석함으로써 기생충 유전자의 기능을 보여줄 수 있습니다.이 기술이 이 기생충의 야생형 균주를 사용하는 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 타입 1 및 타입 2 delta 2 80 기생충 배경을 통해 정밀하게 유전적으로 정의된 균주를 생성하기 위한 표적 이중 교차 상동 재조합 이벤트를 매우 신뢰성 있게 선택할 수 있게 되었다는 점입니다. 이 기술은 특히 toxodb.org의 온라인 유전체 자원과 결합하여, 항독소 혈장 약물 치료를 위한 새로운 표적 발굴과 안전하고 효과적인 약독화 백신 균주의 개발 속도를 크게 높여줄 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 표적 DNA 분자의 설계나 Toxoplasma gondii의 유전적 조작에 어려움을 겪을 수 있습니다.하지만, 환자의 숙련도와 신뢰할 수 있는 표적 분자의 설계가 성공을 보장할 것입니다. 먼저, 유전체 DNA로부터 표적 유전자의 5' 및 3' 게놈 표적 플랭크를 PCR로 증폭하여 프로토콜을 시작하십시오. 그다음, HX GPRT cDNA 미니 유전자 카세트로부터 5' 및 3' DHFR 플랭크가 포함된 HX GPRT 선택 마커를 PCR로 증폭하십시오.효모 재조합 또는 유사한 방법을 사용하여 3D NA 분자들을 plasmid PRS 416에 올바른 5'에서 3' 방향으로 융합함으로써, 표적 유전자의 결손을 유도할 plasmid p delta GOI를 생성합니다. 그다음, 합류(confluent)된 HFF 세포가 담긴 25 cm 플라스크에 접종한 후 68~72시간 뒤에 T gia에 transfection하기 위해, 선형화된 타겟팅 plasmid 15~30 µg을 포함하는 100 µL 샘플을 준비합니다. HFF 세포의 90~95%가 용해되었음을 시각적으로 확인하여 갓 용해된 기생충의 존재를 검증합니다. 생존 가능한 기생충은 유전자 타겟팅에 필수적입니다.액체가 플라스크 뚜껑 안쪽이나 목 부분에 튀지 않도록 주의하며 폐쇄된 플라스크를 세게 흔들어 생존 가능한 기생충이 용액에 잘 섞이도록 교반합니다. 플라스크에서 기생충을 회수하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 형질전환을 준비합니다. 타겟팅 플라스미드를 delta CO 80 톡소플라스마(toxoplasma) 균주에 전기천공법으로 도입합니다.전기천공된 혼합물을 합류된 HFF 세포와 30 milliliters의 감염 배지가 들어 있는 150 centimeter 플라스크로 옮깁니다. 감염된 배양물을 37 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 배양하며, 이는 transfection 후 약 20 hours 정도입니다. 배지를 MPA plus X 선택 배지로 교체합니다.이제 기생충을 37 °C에서 약 8일 동안 방해 없이 배양합니다. 플라크(plaque)가 보이면 플라스크를 흔들어 단층 세포로부터 세포 외 기생충을 분리하여 기생충 용액을 생성합니다. 이 기생충 용액 약 0.5 mL를 5 mL의 MPA plus X 선택 배지가 들어 있고 HFF 세포가 합류(confluent) 상태인 새로운 25 cm 플라스크로 옮깁니다.약 3일 후에 이 배양물을 PAs one A로 지정하십시오. 원래 플라스크에서 기생충 용액 0.5 mL를 동일한 선택 배지가 포함된 다른 HFF 세포 플라스크로 옮기는 과정을 반복하십시오. 이후 5일 동안 이 배양물을 PAs one B로 지정하십시오.pfu 확인을 위해 1차 계대 A와 B를 모니터링합니다. 감염 구역(zones of infection)의 수가 25개 이상으로 적절한 1차 계대 A 또는 B 중 하나를 선택하여 서브 클로닝을 진행합니다. 기생충이 HFF 세포를 용해시킬 때마다, 배양물을 합류(confluent) 상태의 HFF 세포가 담긴 새로운 25 centimeter 플라스크로 옮기고 선택 배지를 추가합니다. transfection 3주 후, 기생충을 MPA plus X 배지로 적절한 농도가 되도록 희석하여 서브 클론용 신선한 기생충을 준비하고, 이 기생충 용액을 합류 상태의 HFF 세포가 포함된 96 well 트레이에 균일하게 분배합니다.웰당 기생충 1마리의 농도로 첫 번째 트레이를 준비하고, 웰당 기생충 2마리의 농도로 두 번째 트레이를 준비합니다. 원래의 transfection 날짜 이후, 두 트레이 모두 37 °C에서 배양합니다. 1형 기생충의 경우 20일 이전, 2형 기생충의 경우 25일 이전에 기생충을 서브클로닝하지 마십시오.온라인 텍스트에 설명된 대로 녹아웃 균주가 검증될 때까지 25 centimeter 플라스크 계대를 매주 일정에 따라 계속 진행합니다. 약 일주일 후 40~60배 배율로 96 웰 플레이트를 판독합니다. 50 µL로 설정된 피펫을 사용하여 단일 감염 구역으로 확인된 단일 PFU가 포함된 웰만 선택합니다.PFU 위로 액체 흐름을 유도하여 웰 내부의 기생충을 분산시킴으로써 해당 웰들의 내용물을 혼합합니다. 선택된 웰들을 혼합한 후 4~5일 뒤에, 세포 용해가 일어난 클론 12개를 선택합니다. 96웰 트레이에서 12개의 클론을 24웰 트레이의 12개 웰로 옮깁니다. 이때 피펫 팁으로 웰 바닥을 긁어 6 µL를 흡입하여 옮깁니다.용액을 1 mL의 MPA plus X 선택 배지가 포함된 HFF 세포가 합류 성장한 24-웰 트레이의 웰로 옮깁니다. 24-웰 트레이를 37 °C에서 배양하며 HFF 세포의 용해 여부를 모니터링합니다. 24-웰 트레이에서 세포가 용해된 웰의 기생충을 매주 일정에 따라 계대 배양합니다.스크래치 및 드로잉 기법을 사용하여 기생충 용액 2 µL를 MPA 및 X 선택 배지가 포함된 새 플레이트로 옮깁니다. 계대 배양 후, 원래의 24-웰 트레이에서 기생충을 수확하여 DNA 수집을 위해 작은 튜브로 옮깁니다.마지막으로, PCR을 사용하여 표적 유전자의 결실 여부를 테스트함으로써 5' 및 3' 표적 플랭크의 통합을 확인하십시오. 또한 HX GPRT 선택 표지자의 존재 여부를 확인하십시오. 본 프로토콜은 조작된 delta Q 80 균주에서 HX GPRT 표지자를 제거하기 위한 것이며, 자세한 내용은 온라인 텍스트에 설명되어 있습니다.P delta GOYC는 6가지 TX 배지를 이용한 음성 선택을 통해 기생충에서 HX GPRT를 제거하는 것을 목표로 합니다. 그 후 PCR을 사용하여 HX GPRT의 소실을 확인하며, 로커스에서 HX GPRT가 제거되지 않은 경우에는 1.2 Kilobase pair 밴드가 나타납니다. 제거된 경우에는 3.4 kilobase pair 밴드가 나타납니다.이 프로토콜의 마지막 부분인 단백질의 C-말단 태깅(C terminal tagging) 또한 온라인 텍스트에 상세히 설명되어 있습니다. 표적 유전자 결손을 만들기 위한 개요 프로토콜을 수행한 후, 일반적으로 표적 지정이 어려운 부위인 type one R 18의 녹아웃(knockout) 결손 여부를 확인하기 위해 PCR을 사용하였습니다. PCR 1은 R 18 유전자 PCR 생성물이 없음을 보여줍니다.PCR 2는 3' R 18 게놈 표적 플랭크의 존재를 보여줍니다. PCR 3과 PCR 4는 선택 마커가 5' 및 3' 게놈 표적 플랭크 사이에 적절히 통합되었음을 보여주며, 이는 R 18 결실이 이루어졌음을 정의합니다. 균주에서 후속 결실을 만들기 위해 선택 마커를 재사용하려면, 먼저 해당 유전자 좌위에서 기존의 HX GPRT를 제거해야 합니다. 설명된 프로토콜을 따른 후 다음과 같이 진행합니다.균주 delta two 80 delta GRA two에서 HX GPRT가 삭제된 GRA two 두 locus로부터 제거되었습니다. 1.2 kb 밴드로 나타나는 HX GPRT의 소실을 확인하기 위해 HX GPRT-PCR을 사용하였습니다. HX GPRT가 제거되지 않았을 때는 3.4 kb 밴드가 나타났습니다. 초기 유전자 표적화 단계 이후, 동일한 type one 또는 type two 균주에서 다중 녹아웃을 구축하거나, "이 단백질은 세포 내 어디에 위치하는가?"와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 돌연변이 균주에 태그를 붙이거나 보충하는 추가적인 유전자 표적화 방법을 적용할 수 있습니다.또는 이 단백질이나 경로의 생물학적 기능을 설명하는 핵심 도메인이나 활성은 무엇입니까? 이 기술은 해당 분야의 연구자들이 모델 AP 복합체 및 기생충 toxoplasma에서 기생충 유전자 기능에 대한 탐구를 확대할 수 있는 길을 열어줍니다. Gandhi eye.Toxoplasma를 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 전체 과정 동안 모든 BSL 2 가이드라인을 준수하는 등의 예방 조치를 유지해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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배우세요 Toxoplasma gondii의 Δku80 균주를 이용한 유전자 표적 교체 방법입니다. HXGPRT 선택 마커와 동원 재조합을 활용하여 정확한 유전자 결실 및 태깅을 수행하고 기생충 유전체 기능 연구를 가속화하세요.

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