Name: 3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 배우세요 pH 반응형 형광 나노센서를 PLGA 전기방사 스캐폴드에 통합하여 3D 세포 배양 환경을 실시간으로 모니터링하는 방법을. 이 기술은 조직 공학에서 세포 성장 조건을 비침습적으로 분석하는 데 활용됩니다.

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BBSRC에서 자금 조달이 친절하게 인정 (허가 번호 BB H011293 / 1).

개요 제 1 반응은 pH가 나노 센서와 SEM을 이용하여 형광 분석법 및 사이즈를 이용하여 pH를 행 나노 센서 응답의 특성화의 제조를 설명한다. 2 장에서는 전기 방사 된 고분자 지지체 및 SEM을 사용하여 형태와 크기의 특성의 준비에 대해 설명합니다. 섹션 2는 pH가 반응 나노 센서의 포함과 함께 전기 방사 공중 발판 자기보​​고 지지체의 제조 방법을 설명합니다. 그 결과 자기보고 발판은 전기 방사 섬유의 모든 형태 학적 변화가 발생했는지 여부를 평가하기 위해 SEM을 특징으로한다. 통합 된 나노 센서에서 발생하는 자기보고 발판에서 형광 공 초점 현미경에 의해 평가된다. 3 장에서는 전기 방사 비계와 자기보고 지지체에 세포의 문화를 설명합니다. 발판은 먼저 프레파라트에 멸균비계는 살균과 세포의 문화가 자기보고 비계의 형광 기능에 영향을 미치는 여부를 결정하기 위해 평가하는 세포 배양 다음에 대한 이온. 프로토콜은 전기 방사 지지체에 배양하는 세포에 나노 센서의 전달을 설명합니다. Lysotracker 염료는 나노 센서는 휴대 산성 구획으로 수행되지 않았 음을 확인하는 데 사용됩니다. 1. 준비 및 산도 응답 졸 - 겔 나노 센서의 분석 산도 응답 졸 - 겔 나노 센서의 1.1 준비 참고 :이 준비 흄 후드에서 수행해야합니다. <ol><li> (및-6) - 카르복시, 숙신 에스테르 디메틸 포름 아미드 (FAM-SE) (1.5 mg)을 (DMF) (1 ㎖) 라운드 플라스크와 6 carboxytetramethylrhodamine을 바닥 - 5를 용해하여 pH를 나노 센서 내에서 사용하기 위해 형광 준비 또 다른 라운드에서 숙신 에스테르 DMF에 (TAMRA-SE) (1.5 mg)을 (1 ㎖) 바닥 플라스크.각 플라스크에 3 - 아미노 프로필 트리에 톡시 실란 (APTES) (1.5 mL)을 추가하고 어둠 속에서 24 시간 동안 건조 질소 분위기 (21 ° C)에서 교반 즉 호일 샘플을 감싸줍니다. </li><li> 둥근 바닥 플라스크에 포함 된 에탄올의 혼합물 (6 ㎖)과 수산화 암모늄 (30 중량 %, 4 ㎖)에 위의 염료 (250 μL)의 양을 추가하고 1 시간 (21 ° C)에 저어. </li><li> 천천히 추가로 2 시간 동안 교반 계속 혼합물에 테트라 에틸 오르토 실리케이트 (TEOS) (0.5 ㎖)를 추가합니다. 혼합물 흐린 켜집니다. 나노 센서는 회전 증발에 의해 수집 될 수 있습니다. 나노 센서는 향후 사용을 위해 4 ℃로 유리 바이알에 저장 될 수있다. 주의 : 자신의 마른 형태의 나노 센서의 추가 처리가 연기 후드 또는 균형 Weighsafe 예를 들면, 묶어야합니다 그 무게의 경우 수행해야합니다. </li></ol> pH가 1.2 나노 센서 응답 <ol><li> 믹시에 의해 산도 5.5-8.0에 이르기까지 Sørensen의의 인산염 완충 용액을 준비나트륨 인산 (0.2 M) 및 제 2 인산 나트륨 (0.2 M) 스톡 용액 NG 특정 비율. pH 미터를 사용하여 최종 pH를 확인합니다. 수산화 나트륨 (NaOH를) (4 M) 또는 염산 (HCL) (2 M)를 사용하여 산도에 대한 약간의 조정을합니다. </li><li> 이 솔루션은 흐린 될 때까지 먼저 다음 초음파 세척기에서 선박을 잠수 3 분의 소용돌이에 나노 센서 솔루션을 포함하는 용기를 개최하여 pH를 버퍼 (5 ㎎ / ㎖)의 산도 나노 센서를 일시 중단 (약 5 분). 완전히 용액에 나노 센서를 일시 중단이 단계를 반복합니다. </li><li> 광 베트로 최초의 솔루션을 놓고 5에 488 ㎚의 여기 파장을 사용 - (및-6) - 카르복시 (FAM)와 6 carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) 568 nm의. FAM과 TAMRA는 형광 분광계를 사용하는 558-580 nm의에 대한 500-530 nm의 방출 파장을 수집합니다. </li><li> pH가 다른 pH에서 관찰 할 수 있도록 광 큐벳에서 해법을 변경 및 C를 계속발광 스펙트럼을 ollecting. </li><li> 교정 곡선을 생성하기 위하여 각각의 pH 값에서 생성 발광 최대 값의 비율을 계산한다. </li></ol> 나노 센서의 1.3 SEM <ol><li> 탄소 코팅 전자 현미경 스텁에 나노 센서의 샘플을 놓고 아르곤 분위기에서 5 분 동안 금으로 코팅 스퍼터. </li><li> 주사 전자 현미경 (SEM)으로 관찰한다. 전자 충전 (그림 1)을 최소화하기 위해 작동 거리, 전압 및 배율을 조정 이미징 동안. </li></ol> 2. PLGA 발판의 준비 및 분석 2.1 전기 방사 PLGA 발판 <ol><li> 흄 후드에서 폴리 피리 디늄 메이트와 디클로로 메탄 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) (DCM) (20 % (w / w)) (PF) (1 % (W / W))를 녹입니다. 18 G 무딘 채우기 바늘과 주사기 펌프에 안전하게 적합으로 10 ML의 주사기로 솔루션을 놓습니다. </li><li> 거리를 20 cm (20)의 바늘 끝 거리cm X 15cm 알루미늄 포집 판. </li><li> 알루미늄 집 전판에 주사기 지구의 선단부에 고전압 전원 장치의 전극을 부착. 주의 : 관리는 높은 전압 즉, 항상 전기 방사 장비 중 하나를 처리하기 전에 전기 공급을 끄고 사용주의해야한다. </li><li> 2 시간 동안 12 kV의에 3.5 m / h의 일정한 유속을 이용하여 솔루션을 제공. 이러한 조건을 사용하여 전기 방사는 약 60 ㎛의 발판 깊이를 제공 할 것입니다. </li><li> 용매 잔류 물이 증발 할 수 있도록 24 시간 동안 흄 후드의 발판을 남겨주세요. </li></ol> 2.2 전기 방사의 pH 응답 PLGA 발판 <ol><li> 섹션 2.1에 있지만 고분자 용액 (5 ㎎ / ㎖)에 나노 센서를 추가로 수정 한 바와 같이 pH를 응답하여 나노 센서를 통합 발판을 준비한다. 초음파의 도움을 PLGA 솔루션의 나노 센서를 일시 중단 (약 5 분) 이전<html> 10 ML의 주사기에 배치합니다. </li></ol> 2.3 PLGA 비계의 SEM과의 pH 응답 비계 <ol><li> 탄소 코팅 전자 현미경 스텁에 PLGA 지지체 또는 산도 반응 발판의 샘플을 놓고 나노 센서의 SEM (그림 1)에 설명 된대로 진행합니다. </li></ol> 산도 응답 비계의 2.4 교정 <ol><li> 35mm 배양 접시에 산도 반응 발판의 샘플을 놓고 적절한 완충 용액에 담그지. </li><li> 공 초점 현미경에 나노 센서 내에서 TAMRA을 자극하는 FAM과 568 nm의 크립톤 레이저를 자극하는 488 nm의 아르곤 레이저를 사용합니다. FAM과 TAMRA에 대한 558-580 nm의에 대한 500-530 nm에서의 pH 반응 발판의 형광 방출을 관찰합니다. (그림 2). 여기 파장의 수집을 방지하기 위해 순차적 인 검색을 사용합니다. </li></ol> 3. PLGA 발판과의 pH 응답 PLGA 발판에 따라 세포 배양 ntent &quot;&gt; 주 : 다음은 세포 배양 캐비닛에서 수행되어야한다. 세포 배양을위한 PLGA 발판 3.1 준비 <ol><li> 2cm 2 조각으로 PLGA 또는 산도 반응 PLGA 지지체를 잘라. </li><li> 15 분 각면 8 cm의 거리에서 자외선 (UV) 빛을 조사하여 발판을 소독. </li><li> 12 잘 문화 판에 발판을 전송하고 상단에 스틸 링을 배치합니다. (5 % V / V) 내부에 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 스틸 링 밖에서 밤새 품어 페니실린 / 스트렙토 마이신의 솔루션을 추가 (37 ° C, 5 % CO 2). 2cm 외부 직경 1cm 내부 직경 1 cm 깊이 : 강철 반지는 노팅엄 대학에서 제조 다음과 같은 차원이되었다합니다. </li><li> 살균 용액을 제거하고 PBS로 세척. </li><li> (500 μL) 및 외부 (500 μL) 스틸 링, 인큐베이터에있는 곳 (37 ° C, 5 % CO 2 내부에 세포 배양 배지를 추가 </서브&gt;) 세포 현탁액을 준비하는 동안. </li><li> 세포 현탁액을 준비하고 트리 판 블루 배제 분석을 사용하여 세포 수를 수행합니다. </li><li> 1 × 106 세포 / ml의 세포 수를 달성하기 위해 세포 현탁액을 만들기. </li><li> 스틸 링의 내부와 외부에서 용지를 제거합니다. </li><li> 스틸 링 (1 평방 미터)의 외부에 데워진 세포 배양 배지로 교체하십시오. </li><li> 스틸 링의 내부에 세포 현탁액 300 μl를 추가합니다 - 바위 플레이트 앞뒤로 부드럽게 세포를 배포합니다. </li><li> 인큐베이터로 세포 배양 접시를 놓고 (37 ° C, 5 % CO 2) - 2-3 일마다 미디어를 새로 고침 - 세포 부착 그러나 한 실험이 필요로에 대한 문화를 계속, 24 시간 내 자리를 차지한다. </li></ol> PLGA 비계에 배양 된 세포에 3.2 나노 센서 납품 <ol><li> 3.1 절에 설명 된대로 PLGA 지지체 위에 종자 세포. 이 연구 빈 PLGA 지지체 (하지 contai에 대한이미징 때 닝 나노 센서가)에 의한 형광 방출의 중첩에 사용되었다. </li><li> (37 ° C, 5 % CO 2) 72 시간 동안 세포 전달 나노 센서하기 전에 발판에 걸쳐 성장하고 마이그레이션 할 수 있도록 인큐베이터로 세포 시드 발판을 놓으십시오. </li><li> 배달 나노 센서에 앞서 1 시간 (37 ° C, 5 % CO 2) 배양, PBS로 세포를 씻어 표준 배지에서 항생제 및 혈청 무료 미디어에 미디어를 변경합니다. 참고 : 3T3 세포에 대한 표준 배지는 소 태아 혈청 (10 % (V / V)), L-글루타민 용액 (2 ㎜), 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 둘 베코의 수정 된 이글 매체의 구성 (1 % (V / V)) . </li><li> 배양 기간 동안 간단히 솔루션 A.을 만들 티멤 (50 μL)와 나노 센서 (5 mg)을 초음파 처리하여 나노 센서 - 리포좀 복합체를 제조 </li><li> 티멤 (45 μL)에 리포 펙 타민 2000 (5 μL)를 추가하여 용액 B를 만들고 5 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 솔루션 추가용액 B에, 나노 센서 - 리포좀 복잡한 솔루션 C를 형성하기 위해 20 분 동안 실온에서 품어. </li><li> 세포에 용액 C (100 μL)를 첨가하고 3 시간 동안 (37 ° C, 5 % CO 2) 배양. </li><li> 인큐베이터, 대기음 미디어에서 셀 시드 발판을 제거하고 공 초점 현미경으로 살아있는 세포의 시각화를 허용하는 PBS (1 ㎖)를 추가하기 전에 PBS로 두 번 세척한다. 참고 : 다른 pH에서 보정이 수행되고 있었기 때문에 세포 배양 배지에 존재하는 페놀 빨간색 표시도 자기 형광을 일으킬하지 않고되도록 PBS는이 프로토콜에 사용되었다. 그러나 페놀 레드 무료 미디어는 세포 배양의 장기 분석을 위해 사용될 수 있습니다. </li><li> 다른 pH를 버퍼에 셀 시드 발판을 담그고 세포와 관련된 나노 센서의 반응을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 공 초점 현미경 (Figu를 사용하여 형광을 관찰함으로써 및 TAMRA FAM에서 형광 농도의 비율을 결정함으로써 피를 모니터링다시 3). </li></ol> 포유 동물 세포 내에서 3.3 나노 센서 위치 <ol><li> 로 3.2의 설명 FAM 염료 (TAMRA의 형광 방출이 LysoTracker 레드와 같은 스펙트럼 영역에 있기 때문입니다)를 포함하는 나노 센서와 세포를 품어. 1.1 절에 있지만, 준비하고 TAMRA를 추가 생략하여 설명한 바와 같이 이러한 나노 센서를 준비합니다. </li><li> 나노 센서의 납품 기간에 따라 50 nm의 LysoTracker 레드 원액을 희석. </li><li> PLGA 인공 지지체에 배양 세포에 희석 용액 (2 μL)의 분취 량을 추가합니다. </li><li> 1 시간 (37 ° C에서 5 % CO 2)에 LysoTracker 레드와 세포를 품어. </li><li> 배양 기간에 따라 용지를 제거하고 공 초점 현미경을 사용하여보기위한 준비 (산도 7.4) (2 ㎖) PBS에 미디어를 변경하기 전에 PBS (산도 7.4)로 두 번 세포를 씻으십시오. 주 : 페놀 레드 무료 미디어 대신 PBS로 사용할 수 있습니다. </li><li> 핵 얼룩 드라 추가PBS에 Q5 그래서 최종 농도는 5 μM과 3 분 (37 ° C 5 % CO 2)의 세포 배양이다. 그것은 DRAQ5와 잠복기 다음 용지를 변경할 필요가 없다. </li><li> 650 만 나노 센서 DRAQ5 발색단을 흥분과 500-530 nm의 580-600 nm에서 형광을 관찰 할 수 LysoTracker 레드와 633 nm의 헬륨 / 네온 레이저를 자극 할 수있는 568 nm의 크립톤 레이저를 FAM을 자극하는 488 nm의 아르곤 레이저를 사용하여 -750 (그림 3) 각각 nm의. 여기 파장의 수집을 방지하기 위해 순차적 인 검색을 사용합니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

조직 공학은 특정 조직이나 기관의 기능을 수리, 교체, 유지 또는 향상시키기 위해 생체 조직 모델과 같은 생체 조직 대체 요법에 모두로 사용할 수있는 생물학적 대체를 만드는 목표로. 몇 년 교체하거나 조직의 원조 수리 그러나이 자주 인해 궁극적으로 거부하거나 추가 재수술에 이르게 호스트 조직 및 / 또는 감염, 가난한 통합에 실패하는 합성 대체가 사용되었습니다. 주입 이전에 실험실에서 생체 조직 생성은 완전 통합을 달성하는 문제를 해결하고 치환술에 대한 필요성을 감소시킬 수있다. 그러나 실현이 목표에 적합한 생체 외 전파와 3D 구조 내에서 세포의 조작은 체외에서 조직의 적절한 육체적 인 조절과 결합되어야한다. 이것은 하나의 근본적인 생물학에 대한 연구를 계속 진행되는 다수의 방식으로 달성 될 수있다참여뿐만 아니라, 합성 대체의 생산에 관련 엔지니어링 및 제조 문제를 조회. 그것은 설명 프로토콜이 기여하는 것을 목표로하는 것이 후자의 문제입니다. <p cl...

조직 공학의 주요 전략은 형태는 교체 예정의 조직과 유사하며 세포 성장 및 1,2 함수를 지원할 수 지지체를 제조하는 생체 적합성 물질의 사용이다. 비계는 세포 부착 및 증식이 아직 3 차원 세포 구조의 틈새를 통해 세포 이동을 할 수 있도록하여 기계적인 지원을 제공합니다. 비계는 세포의 영양분의 질량 수송을 허용하고 신진 대사 폐기물 3의 제거를 방해하지 않아야합니다. 전기 방사는 세포 성장의 4-6 지원할 수있는 고분자 지지체의 제조를위한 유망한 방법으로 떠오르고있다. 그들은 종종 다공성이며 3D 셀룰러 구조 (7)의 간극을 통하여 세포 - 세포 상호 작용뿐만 아니라 세포 이동을 허용로서 생성 부직포 전기 방사 섬유 세포 성장에 적합하다. 그것은 t 중에 세포 생존을 모니터링하는 것이 중요그는 문화의 기간 및 그 세포 생존을 보장하기는 3D 구조의 전체에 걸쳐 유지된다. 분석 농도 구배가 3D 구문에 존재할 수있는 예를 들어, 이러한 산소와 pH가 배양 조건, 조심 제어를 필요로합니다. 생물 반응기 또는 관류 시스템은 격자 간 흐름의 생체 내 조건에서 결과적 증가 영양소 입금 및 대사 폐기물 제거 8로 모방하기 위해 사용될 수있다. 이러한 시스템은 일정한 미세 환경 조건을 보장하는지 여부의 질문에 실시간으로 셀룰러 미시를 평가함으로써 해결 될 수있다. 실시간으로 모니터링 할 수있는 키 미시 메트릭은 다음을 포함한다 : 온도, 셀 매체의 화학적 조성, 용존 산소와 이산화탄소의 농도, 산도, 다습. 이러한 메트릭, 온도가 가장 쉽게 현장 프로브에 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 일반적으로 잔존 나열된 메트릭을 모니터링하기위한 방법따라서 volve 샘플링에 대한 나누어지는 제거하고 세포 배양을 방해하고 오염의 위험을 증가시킨다. 연속, 실시간 방법이 모색되고있다. 현재 모니터링 방법은 일반적으로 물리적으로 pH를 모니터 또는 산소 프로브와 같은 세포 구조를 조사 악기에 의존한다. 그러나 이러한 침입 방법은 세포 구조를 손상 지속적인 실험을 방해 할 수 있습니다. 3D 구조 내에서 분석 농도의 비 침습적 모니터링은 영양 고갈 9 등 다양한 환경 적 측면의 실시간 모니터링을 가능하게 할 수 있습니다. 이 구조 내에서 깊은 지역에 영양 공급의 평가를 허용하고 신진 대사 폐기물을 효과적으로 10,11 제거되는 여부를 결정하는 것입니다. 침입의 문제를 해결하기위한 시도 시스템은 일반적으로 pH가, 산소를 모니터링하고 12 포도당 배양 용기 모두를 통해 외부 센서에 배양액을 통과 관류 챔버의 사용을 수반한다.드레 직접 샘플링 분취 액의 제거를 필요로하지 않고 같은 시츄 모니터링에 제공 할 배양 용기에 통합 될 수있는 센서의 개발에 대한 관심이 높아지고있다. 현장과 우리가 자기보고 발판 (13)을 생성하는 전기 방사의 발판으로 분석 반응하는 나노 센서를 통합 한 미세 환경 조건의 비 침습적 모니터링에 대한 이러한 단점을 해결하기 위해. 감지 장치는 전기 방사에 의해 또는 종래 골격 형성 14,15로 중합체에 혼입된다 분석 반응 염료의 사용을 통해 생성 된 실제 고분자 지지체 하나 어디에 형광 활성을 모니터링함으로써 같은 촬상 장치의 역할을 지지체는, 미리 제조 된 . 그러나, 이러한 촬상 장치는 다른 분석에서 가능한 간섭으로 인한 잘못된 광 출력을 줄 가능성이있다. 비율 적 감지 장치 스와의 사용설명 된 프로토콜에서 제조 된 것과 같은 채널이 가능한 부작용을 제거하고 해당 분석 물에 대한 특정 응답을 제공하는 잠재력을 보유하고있다. 여기에 제시된 전기 방사의 발판이로 인해 선택, 합성 공중 합체 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA)로부터 제조 된 식품의 약국의 생분해 성 및 생체 특성으로 인해 관리 (FDA) 승인 및 추적하는 데 다양한 세포 유형 16-18의 성장 및 기능을 지원하는 기록. 제조 된 비율 계량 분석 응답 나노 센서는 산도에 반응합니다. 나노 센서가 하나의 염료, FAM은 산도에 응답하고, 다른 생체 적합성 인 졸 - 겔 매트릭스로 두 형광 염료를 통합, TAMRA는 산도에 응답 아니므로 내부 표준으로서 작용한다. 그들은 크게 겹치지 않는 더욱이 TAMRA FAM 및 양쪽의 형광 별도로 분석 할 수있다. 형광 EMI의 비율을 결정특정 파장에서 두 염료 (투약) 소지는 다른 환경 조건의 독립의 pH 응답을 제공합니다. 자기보고 비계가 개발 한 3D 모델을 방해하지 않고 현장에서 실시간으로 pH를 반복 평가를 허용 할 수 있습니다. 우리는이 지지체는 세포 부착 및 증식을 지원할 수있는 문제의 분석에 응답하여 남아 있는지 보여 주었다. 설계 구조의 부산물 산성의 반응 속도는 understudied 아르 유지와 같은 산도 반응 발판을 사용하여 크게 이러한 연구 19을 용이하게 할 수 있습니다. 또한, 조직 공학 응용 프로그램에 대한 자기보고 발판의 사용 기회를 완전히 이해 모니터와 체외에서 3D 모델의 조직 구조의 성장, 비 침습적으로 실시간으로 최적화를을 제공합니다. 산도 반응 나노 센서는 전기 방사 PLGA의 scaffol에 따라 배양 섬유 아세포의 세포 내 환경에 배달 된DS. 염료의 형광 발광의 비율은 피를 모니터링하는 데 사용하고 자기보고 골격 도입 산도 나노 센서에 비교 하​​였다. 3D 환경에서 배양 된 세포에 나노 센서의 배송이 깊은 비파괴 방식으로 구문에 분석 농도의 모니터링을 가능하게 할 수 있습니다. 따라서 나노 센서 비파괴 3D를 통해 세포 행동을 평가하기 위해 실행 가능한 이미징 도구 장기 분석을 허용 생성 할 수있다. 3D 구조 내의 개별 세포의 분석 농도를 선별가 충분한 영양과 산소 농도를 받고있는 것을 확신 할 수있을 것입니다. 모니터링 프로세스 파라미터는 산소와 영양분의 효과적인 대량 수송을 위해 표준화 된 기술의 개발에 도움이 있었다. 세포 내 환경과 고분자 지지체에 나노 센서의 결합으로 나노 센서의 배송은 3 차원 CONST 내에서 세포 생존 능력의 평가뿐만 아니라 비계 성능을 허용하기 위해 결합 될 수있다조직 성장 프로세스 동안 ructs. 이것은 이러한 구조의 지식 증가로 이어질 생물학적으로 관련 조직 대체물의 제조를 진행 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>에탄올</td><td>피셔</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>무수 디메틸포름아미드(DMF)</td><td>시그마</td><td>270547</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄 50%(v/v) 수용액</td><td>Alfa Aesar</td><td>35574</td>, <td>순수로 30%(v/v)로 희석</td></tr><tr><td>TEOS</td><td>Sigma</td><td>13190-3</td><td></td></tr>, <tr><td>3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)</td><td>시그마</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)</td><td>Invitrogen</td><td>C1311</td><td></td></tr><tr><td>6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 (0.2 M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 (0.2 M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>트립신/EDTA</td><td>시그마 알드리치</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>시그마 알드리치</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마 알드리치</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시그마 알드리치</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>소스 생명과학</td><td>배치-213-101992</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마 알드리치</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus Ltd</td><td>DR50050</td><td></td></tr><tr><td>질소 가스</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320269</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica TCS-SP</td><td></td><td>아르곤 및 크립톤 레이저와 63X 0.9NA 침수 렌즈</td></tr><tr><td>UV 광</td><td>UVLS28 UVP, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>교반기 플레이트</td><td>SB161-3 Jencons-PLS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Jenway 모델 3510</td><td></td><td></td></tr><tr><td>회전 증발기</td><td>Buchi 로터리 증발기 R200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기(나노센서)</td><td>Hermle Z300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기(세포 배양)</td><td>Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Whirlimixer Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기</td><td>FB11021 Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 시트</td><td>노팅엄 대학교</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm 세포 배양 플레이트</td><td>이와키</td><td>3000035</td><td></td></tr><tr><td>10ml 주사기</td><td>Becton Dickenson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T3 섬유 아세포</td><td>유럽 세포 배양</td><td></td><td></td>컬렉션</tr><tr><td>PLGA</td><td>Lakeshore Biomaterials</td><td>7525 DLG 7E</td><td></td></tr><tr><td>포름산 피리디늄</td><td>시그마 알드리치</td><td>P8535</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>시그마 알드리치</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성</td><td>시그마 알드리치</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마 알드리치</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>시그마 알드리치</td><td>320331</td><td></td></tr></tbody></table>

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

적절한 지지체에 3 차원 배양 세포는 더 생체 내 미세 환경을 모방 및 세포 - 세포 상호 작용을 증가하는 것으로 생각된다. 그 결과 3 차원 세포 구조는 종종 차원에서 연구와 유사한 실험을보다 분자 이벤트 및 세포 - 세포 상호 작용을 공부에 더 관련이있을 수 있습니다. 발판에 걸쳐 높은 세포 생존 능력과 효과적인 3D 문화를 만들려면 산소주의 깊게 분석 농도 구배로 제어 할 산도 필요로 배양 조건은 3 차원 구조 전반에 걸쳐있을 수 있습니다. 여기에서 우리는 많은 포유 동물 세포의 문화에 대한 자신의 이후의 준비와 함께 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 발판으로 생체 적합성의 pH 반응 졸 - 겔 나노 센서 및 그 설립을 준비하는 방법을 설명합니다. 산도 반응 발판은 3 차원 세포 구조 내에서 미세 환경의 산도를 결정하는 도구로 사용할 수 있습니다. 또한, 세부에게 산도 반응 nanose의 전달을 우리성장 전기 방사 PLGA 지지체에 의해 지원되었다 포유 동물 세포의 세포 내 환경에 nsors. 산도 응답 나노 센서의 세포질 위치는 전진 동안 실험 세포 내 산도 (PHI)를 모니터링하는 데에 이용 될 수있다.

준비된 산도 응답 나노 센서의 크기 분포는 묘화 나노 센서의 인구가 측정 및 240-470 nm의 (도 1a)의 범위 내에서 나노 미터 크기를 갖는 것으로 하였다 SEM을 사용하여 분석되었다. 좁고 비교적 작은 직경의 과제는 나노 입자를 제조 Stöber 메서드를 사용과 일치한다. 그것은 산성 조건을 사용하여 제제가 입경 넓은 분산을 생성하는 반면 나노 입자 Stöber 방법을 사용하여 나노 입자의 합성 중에 염기성 pH 환경 준비 IE하여, 사이즈의 양호한 제어를 허용하는 것이 발견되었다. 설명 된 방법을 사용하여 제조 된 PLGA의 전기 방사 섬유의 대표적인 SEM 현미경 사진이 생성 된 PLGA 지지체가 섬유는 나노 미터 치수가 최소한의 구슬 장식이나 파손을 표시 부직포 섬유로 구성되어 있음을 보여주는 그림 1B에 표시됩니다. 그림 1C </st룽&gt; 5 밀리그램의 농도 PLGA 용액에 나노 센서의 첨가 / <s...

생체의 pH 응답 졸 - 겔 나노 센서는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 지지체에 혼입 될 수있다. 생성 된 자기보고 지지체는 지지체에 세포를 배양하는 동안 미세 환경 조건 인 시츄 모니터링에 사용될 수있다. 3D 셀룰러 구조는 실험을 방해하지 않고 실시간으로 모니터링 할 수있는 이는 유익하다.

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 성장에 영향을 미치는 조건에 대한 이해를 돕기 위해, 실시간 및 in situ로 모니터링이 가능한 pH 응답형 나노센서와 자가 보고형 스캐폴드를 제작하는 것입니다. 이를 위해 먼저 형광 출력을 통해 pH를 모니터링할 수 있는 생체 적합성 분석물 응답형 나노센서를 준비합니다. 두 번째 단계로, pH 응답형 나노센서를 고분자 전기방사 스캐폴드에 통합하여 세포를 배양하고 모니터링할 수 있는 3D 환경을 구축합니다.다음으로, 포유류 세포를 전기방사 지지체 위에 안착시키고, 세포 내 pH를 모니터링하기 위해 나노센서를 세포 내 환경으로 전달합니다. 실험 과정에서 공초점 현미경으로 획득한 형광 비율을 기반으로, 세포 내 나노센서와 자체 보고형 지지체가 조직 공학 환경 내의 pH를 모니터링할 수 있음을 보여주는 결과가 도출됩니다. 전자 pH 프로브 사용과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 세포 성장을 방해하지 않고 실제 위치(in situ)에서 실시간으로 측정이 가능하다는 점입니다.먼저 둥근 바닥 플라스크에 fam SE 1.5 milligrams를 dimethylformamide(DMF) 1 milliliter에 녹여 형광체를 준비합니다. 다른 플라스크에도 Tamara SE 1.5 milligrams를 DMF 1 milliliter에 녹입니다. 그런 다음 각 플라스크에 three amino propyl triethyl 1.5 milliliters를 첨가하고, 건조한 질소 분위기의 21 °C 환경에서 24시간 동안 암소에서 계속 교반합니다.다음으로, 6 mL의 에탄올과 4 mL의 수산화암모늄이 들어 있는 둥근 바닥 플라스크 혼합물에 두 가지 염료 용액을 각각 250 µL씩 첨가합니다. 이 새로운 혼합물을 21 °C에서 1시간 동안 교반합니다. 혼합물에 0.5 mL의 tetraethyl orthosilicate를 천천히 첨가하고, 다시 2시간 동안 교반을 계속합니다.이 시간 동안 혼합물이 불투명하게 변하는 것을 확인한 후, 회전 증발법으로 나노센서를 수집하여 향후 사용을 위해 4°C의 유리 바이알에 보관하십시오. 다음으로, 건조된 pH 나노센서를 pH 5.5에서 pH 7.5까지 pH 0.5 간격의 Sorenson 인산염 완충액에 5 mg/mL 농도로 첨가하십시오. 샘플을 3분 동안 볼텍싱하여 나노센서를 재현탁시킨 후, 5분 동안 또는 용액이 불투명해질 때까지 초음파 처리하

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 세 차원 세포 배양을위한 다공성 고분자 칩의 microfabrication 두 가지 프로세스를 제시한다. 첫 번째는 용매 증기 용접 공정과 결합 핫 엠보싱입니다. 두 번째는 생산의 중요한 단순화하기 위해 선도적인 이온 트랙 기술과 함께 최근에 개발된 microthermoforming 프로세스를 사용합니다.

입체 세포 배양을위한 칩 크기의 공사장 공중 발판의 Microfabrication

우리는 세포 - 세포 상호 작용의 차이를 수치 3D 조직 같은 spheroids 및 잠재적인 응용 프로그램을 생성하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

이 원고는 새로운 3차원 간세포 배양 플랫폼, 역콜로이드 결정 골격 및 간세포 거동을 평가하기 위한 수반되는 기술의 제작을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 크기 조절 가능한 기공, 상호 연결성 및 세포 외 기질 단백질을 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 골격에 접합하는 능력은 Huh-7.5 세포 성능을 향상시킵니다.

반전 콜로이드 결정체 폴리 (에틸렌 글리콜) 비계의 제작 : 간 조직 공학을위한 삼차원 세포 배양 플랫폼

여기에서는 세포 응집을 통해 3D 세포 스페로이드를 형성하기 위한 빠르고 유연한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 여러 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 세포 이동, 침습 또는 아노이키스 분석을 포함한 다양한 응용 분야와 세포-매트릭스 상호 작용의 이미징 및 정량화에 적합합니다.

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

여기, 우리 자기 연골 같은 조직으로 dedifferentiated 인간의 관절 chondrocytes의 분화를 촉진 하는 펩 티 드 건설 기계 조립에 3D 문화 시스템을 얻기 위해 프로토콜을 제시.

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

이 논문은 이전에 설명한 3차원 콜라겐 기반 스캐폴드에 신경모세포종 세포주를 파종하고, 미리 결정된 기간 동안 세포 성장을 유지하고, 다양한 실험 목표를 충족하도록 적응할 수 있는 여러 세포 성장 및 세포 행동 분석 및 다운스트림 애플리케이션을 위한 스캐폴드를 검색하는 데 필요한 단계를 나열합니다.

콜라겐 기반 스캐폴드를 사용한 신경모세포종의 3차원 체외 생체모방 모델

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

입상 스캐폴드 내에서 입자 분획의 변동성을 최소화하면 재현 가능한 실험이 용이해집니다. 이 작업은 시험관 내 조직 공학 응용 분야를 위해 제어된 입자 분획으로 과립 스캐폴드를 생성하는 방법을 설명합니다.

3D 세포 배양을 위한 미세 다공성 어닐링 입자 스캐폴드의 입자 분획 제어

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

암 전이를 연구하기 위해 이세포성 누화를 캡처하는 3D 암 모델이 매우 필요합니다. 우리의 연구는 침입 및 세포 공간 분포를 연구하는 데 사용할 수 있는 골격 및 골격이 없는 환경에서 이종 다세포 기질-상피의 생성을 제시합니다.

상피암 세포의 스캐폴드가 없는 3D 배양에서 이종다세포 기질 세포(Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion)

배우세요 pH 반응형 형광 나노센서를 PLGA 전기방사 스캐폴드에 통합하여 3D 세포 배양 환경을 실시간으로 모니터링하는 방법을. 이 기술은 조직 공학에서 세포 성장 조건을 비침습적으로 분석하는 데 활용됩니다.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

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