3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 성장에 영향을 미치는 조건에 대한 이해를 돕기 위해, 실시간 및 in situ로 모니터링이 가능한 pH 응답형 나노센서와 자가 보고형 스캐폴드를 제작하는 것입니다. 이를 위해 먼저 형광 출력을 통해 pH를 모니터링할 수 있는 생체 적합성 분석물 응답형 나노센서를 준비합니다. 두 번째 단계로, pH 응답형 나노센서를 고분자 전기방사 스캐폴드에 통합하여 세포를 배양하고 모니터링할 수 있는 3D 환경을 구축합니다.

다음으로, 포유류 세포를 전기방사 지지체 위에 안착시키고, 세포 내 pH를 모니터링하기 위해 나노센서를 세포 내 환경으로 전달합니다. 실험 과정에서 공초점 현미경으로 획득한 형광 비율을 기반으로, 세포 내 나노센서와 자체 보고형 지지체가 조직 공학 환경 내의 pH를 모니터링할 수 있음을 보여주는 결과가 도출됩니다. 전자 pH 프로브 사용과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 세포 성장을 방해하지 않고 실제 위치(in situ)에서 실시간으로 측정이 가능하다는 점입니다.

먼저 둥근 바닥 플라스크에 fam SE 1.5 milligrams를 dimethylformamide(DMF) 1 milliliter에 녹여 형광체를 준비합니다. 다른 플라스크에도 Tamara SE 1.5 milligrams를 DMF 1 milliliter에 녹입니다. 그런 다음 각 플라스크에 three amino propyl triethyl 1.5 milliliters를 첨가하고, 건조한 질소 분위기의 21 °C 환경에서 24시간 동안 암소에서 계속 교반합니다.

다음으로, 6 mL의 에탄올과 4 mL의 수산화암모늄이 들어 있는 둥근 바닥 플라스크 혼합물에 두 가지 염료 용액을 각각 250 µL씩 첨가합니다. 이 새로운 혼합물을 21 °C에서 1시간 동안 교반합니다. 혼합물에 0.5 mL의 tetraethyl orthosilicate를 천천히 첨가하고, 다시 2시간 동안 교반을 계속합니다.

이 시간 동안 혼합물이 불투명하게 변하는 것을 확인한 후, 회전 증발법으로 나노센서를 수집하여 향후 사용을 위해 4°C의 유리 바이알에 보관하십시오. 다음으로, 건조된 pH 나노센서를 pH 5.5에서 pH 7.5까지 pH 0.5 간격의 Sorenson 인산염 완충액에 5 mg/mL 농도로 첨가하십시오. 샘플을 3분 동안 볼텍싱하여 나노센서를 재현탁시킨 후, 5분 동안 또는 용액이 불투명해질 때까지 초음파 처리하십시오.

FAM의 경우 488 nm, Tamara의 경우 568 nm의 들뜸 파장에서 샘플을 측정하여 보정 데이터를 수집하십시오. FAM은 500~530 nm, Tamara는 558~580 nm 범위에서 방출광을 수집하고, 각 pH 값에서 생성된 최대 방출 강도의 비율을 계산하십시오. 그다음, 나노센서 샘플을 탄소 코팅된 전자현미경 스터브(stub) 위에 놓고 아르곤 분위기에서 5분 동안 금으로 스퍼터 코팅하여 SEM 이미징을 위한 샘플을 준비하십시오.

코팅이 완료되면 샘플을 전자 현미경에 넣고, 흄 후드 내에서 전자 대전 현상을 최소화하고 최적의 이미지를 얻을 수 있도록 작동 거리, 전압 및 배율을 조정하십시오. 디클로로메탄에 1% perfluorooctanoic acid를 포함한 20% PLGA 용액을 제조하십시오. 18게이지 둔탁한 충전 바늘이 장착된 10 mL 주사기에 용액을 채우고 주사기 펌프에 단단히 고정하십시오.

이 용액은 대조군 PLGA 스캐폴드를 제작하는 데 사용됩니다. 바늘 팁을 20 x 15 cm 알루미늄 수집판으로부터 20 cm 거리에 두고, 고전압 전원 공급 장치의 전극을 시린지 팁에 연결하며 전선을 알루미늄 수집판에 접지합니다. 다음으로, 전원 공급 장치를 켜고 전압을 12 kV로 조정합니다. 그런 다음 시린지 펌프를 작동시켜 3.5 mL/h의 일정한 유속으로 2시간 동안 용액을 주입합니다.

이렇게 하면 약 60 microns의 스캐폴드 깊이가 형성됩니다. 작업이 완료되면 장비의 전원을 끄고, 잔류 용매가 증발할 수 있도록 스캐폴드를 흄 후드 내에 24시간 동안 둡니다. pH 반응형 나노센서가 통합된 스캐폴드를 제작하려면, 이전과 동일하게 PLGA 용액을 준비하되 이번에는 나노센서를 5 mg/mL 농도로 추가합니다.

그다음, 이전과 동일한 설정으로 pH 응답성 소재를 전기방사합니다. 이어서, 나노센서가 통합된 건조 스캐폴드의 작은 샘플들을 35 mm 배양 접시에 넣고, 공초점 현미경 하에서 pH 5.5에서 7.5 사이의 0.5 간격으로 조절된 2 mL의 Sorensen 인산염 완충액에 침지시켜 스캐폴드의 pH 응답성을 교정합니다. 나노센서 내의 FAM을 여기시키기 위해 488 nm 아르곤 레이저를 사용하고, Tamara를 여기시키기 위해 568 nm 크립톤 레이저를 사용합니다.

FAM은 500에서 530 nanometers, Tamara는 558에서 580 nanometers 영역의 방출을 관찰한 후, 각 pH 값에서 생성된 최대 방출 강도의 비율을 계산합니다. 먼저, 8 centimeters 거리에서 UV 광원을 사용하여 스캐폴드의 표면을 양면 각각 15분 동안 멸균합니다. 그런 다음 멸균된 상태로 스캐폴드를 12-well 배양 플레이트로 옮기고, 내경 1 centimeter 및 외경 2 centimeters의 스틸 링을 스캐폴드 위에 배치합니다.

다음으로, 스틸 링의 내부와 외부에 5% pen strip이 포함된 PBS를 넣고 샘플을 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 5% pen strep가 포함된 PBS를 제거하고 스캐폴드를 PBS로 세척합니다.

그런 다음 스틸 링의 내부와 외부에 세포 배양 배지 500 µL를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에서 예열합니다. 다음으로, 대상 세포를 수확하여 1 × 10⁶ cells/mL 농도의 세포 현탁액을 준비합니다. 세포가 준비되면 웰에서 배지를 제거하고 스틸 링 외부에 신선한 배지 1 mL를 추가합니다.

그런 다음 세포 현탁액 300 µL를 스틸 링 내부에 추가하고, 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분산시킵니다. 플레이트를 5% CO2가 포함된 37 °C 인큐베이터에 넣고 필요한 시간 동안 세포를 배양합니다. 2~3일마다 배지를 교체하며, 이전 섹션에서 설명한 대로 세포를 스캐폴드에 파종하고 72시간 동안 방해 없이 성장하도록 둡니다.

그런 다음 세포를 PBS로 헹구고 링 외부에 500 µL의 무혈청 배지를, 링 내부에는 300 µL를 추가합니다. 배양 중에 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 나노센서 5 mg을 옵티뮴 50 µL에 넣고 짧게 볼텍싱하여 용액 A를 준비합니다.

그 다음, 45 µL의 Optum에 5 µL의 lipectomy 2000을 첨가하여 용액 B를 혼합하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 이어서, 용액 B 혼합물에 용액 A를 첨가한 후 실온에서 20분 동안 배양하여 나노센서 리포좀 복합체인 용액 C를 형성합니다. 플레이트를 배양기에서 꺼내 복합체 용액 100 µL를 스틸 링 내부에 첨가합니다.

그런 다음 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고, lipectomy 시약 복합체와 함께 세포를 3시간 동안 배양합니다. 배지를 흡입하여 제거하고 따뜻한 PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 나노센서의 반응을 모니터링하기 위해 세포가 부착된 스캐폴드를 서로 다른 pH의 완충액에 담급니다. 이제 포유류 세포 내 나노센서의 위치를 추적하기 위해 형광 공초점 현미경을 사용하여 세포 내부를 이미지화합니다.

먼저, PLGA 스캐폴드에 안착된 세포에 nanosensor가 포함된 fam만을 준비하여 처리합니다. 그 다음, 배지 300 µL에 50 nM lyo tracker red 2 µL를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 시간이 지나면 배지를 제거하고 PBS로 세포를 2회 세척합니다.

그 다음, 공초점 이미징 중에 세포가 마르지 않도록 PBS 또는 다른 페놀 레드 프리 배지 2 µL를 첨가합니다. 이어서, 핵 염색제인 DRAQ5 5 µM을 PBS에 첨가하고 37 °C에서 3분 동안 세포와 함께 배양합니다. 3분 후, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 공초점 스테이지 위에 올립니다. 동반된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 다양한 들뜸 및 방출 파장을 사용하여 나노센서, 산성 소기관 및 핵을 이미징하며, 이때 들뜸 파장이 수집되는 것을 방지하기 위해 순차 스캐닝을 사용합니다. 제조된 pH 응답성 나노센서의 크기 분포는 SEM을 사용하여 분석하였으며, 이미징된 나노센서 집단을 측정한 결과 240 nm에서 470 nm 범위의 나노미터 크기임을 확인하였습니다.

왼쪽은 전기방사된 PLGA 섬유의 이미지이며, 오른쪽은 나노센서가 포함된 전기방사 PLGA 섬유입니다. 섬유의 SEM 마이크로그래프는 나노센서가 섬유 표면에 결합되어 있다는 증거를 제공합니다. 하지만, 나노센서가 스캐폴드 섬유 내부에 통합되어 있을 수도 있습니다.

전기 방사가 완료된 후에도 나노센서는 광학적 및 화학적 활성을 유지하며, 여기에서는 스캐폴드 섬유와 결합된 상태로 나타납니다. 왼쪽은 녹색으로 표시된 fam 염료이며, 오른쪽은 적색으로 표시된 Tamara 염료입니다. 형광 강도 비율을 통해 여기와 같은 검정 곡선이 생성됩니다.

나노센서를 단독으로 평가했을 때와 전기방사된 PLGA 스캐폴드에 통합하여 평가했을 때의 결과가 서로 일치하였으며, 이는 나노센서가 스캐폴드에 통합된 후에도 광학적 활성을 유지함을 보여줍니다. 통합된 나노센서는 버퍼를 pH 5.5와 7.5 사이에서 교대로 변경함에 따라 변화하는 pH 값에 가역적으로 잘 반응하였습니다. Fam/Tamra 비율은 표시된 매회 측정 시마다 예측 가능한 반응을 보였습니다.

다음은 transfection 시약을 통해 나노센서가 세포 내로 전달된 섬유아세포의 공초점 이미지입니다. fam 및 Tamara 염료의 점상 공국소화(punctate colocalization)는 염료가 나노센서 매트릭스 내에 갇혀 있었음을 시사합니다. 다양한 버퍼에 배치된 세포의 fam Tamara 비율을 측정함으로써 나노센서의 세포 내 전달을 확인할 수 있습니다.

여기서 보시는 바와 같이, 스캐폴드 기반 나노센서를 측정할 때는 비율이 증가하지만, 세포 내 센서를 측정할 때는 일정하게 유지됩니다. 이 기술이 개발됨에 따라, 조직 공학 분야의 연구자들은 진행 중인 실험을 방해하지 않고 3D 세포 구조체 내의 미세환경 세포 내 pH 변화를 실시간으로 in situ에서 조사할 수 있게 되었습니다.