3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 성장에 영향을 미치는 조건의 이해를 돕기 위해 실시간 및 현장에서 모니터링할 수 있는 pH 반응성 나노센서와 자가 보고 스캐폴드를 생산하는 것입니다. 이는 먼저 형광 출력을 통해 pH를 모니터링할 수 있는 생체 적합성 분석물 반응성 나노센서를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, pH 반응성 나노센서를 고분자 전기 방적 스캐폴드에 통합하여 세포를 배양하고 모니터링할 수 있는 3D 환경을 형성합니다.

다음으로, 포유류 세포는 전기 위에 안착하고, 스캐폴드를 방사하고, 나노 센서도 세포 내 pH를 모니터링하기 위해 세포 내 환경으로 전달됩니다. 실험 중에 세포 내 나노 센서와 자체 보고 스캐폴드가 컨포칼 현미경으로 획득한 형광 비율을 기반으로 조직 엔지니어링 환경 내에서 pH를 모니터링할 수 있는 능력을 보여주는 결과를 얻었습니다. 전자 pH 프로브의 사용과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포 성장을 방해하지 않고 현장에서 실시간으로 측정을 수행할 수 있다는 것입니다.

시작하려면 둥근 바닥에서 1.5mg의 fam SE를 DMF로 알려진 1ml의 디메틸포름아미드에 용해시켜 형광단을 준비합니다. 플라스크는 또한 두 번째 플라스크에서 1.5mg의 Tamara SE를 1ml의 DMF로 용해시킵니다. 그런 다음 각 플라스크에 3 개의 아미노 프로필 트리 에틸 1.5 밀리리터를 넣고 섭씨 21 도의 건조한 질소 분위기 아래에서 24 시간 동안 암흑 속에서 계속 저어줍니다.

다음으로, 둥근 바닥 플라스크에 들어있는 6 밀리리터의 에탄올과 4 밀리리터의 수산화 암모늄을 포함하는 혼합물에 두 염료 용액 250 마이크로 리터를 첨가한다. 이 새로운 혼합물을 1시간 후에 섭씨 21도에서 저어줍니다. 혼합물에 0.5ml의 테트라에틸 오르토스 실리케이트를 천천히 넣고 2시간 동안 계속 저어줍니다.

이 시간 동안 혼합물이 흐려질 것으로 예상한 다음 회전 증발로 나노 센서를 수집하고 나중에 사용할 수 있도록 섭씨 4도의 유리 바이알에 보관합니다. 다음으로, pH 5.5에서 pH 7.5 범위의 sorenson의 인산염 완충액에 밀리리터당 5밀리그램으로 건조된 pH 나노센서를 pH 0.5씩 증가시킵니다. 샘플을 3분 동안 볼텍싱하여 나노 센서를 재현탁시킨 다음 5분 동안 또는 용액이 흐려질 때까지 초음파 처리합니다.

FAM의 경우 488나노미터, 568나노미터의 여기 파장에서 샘플을 측정하여 보정 데이터를 수집합니다. Tamara의 경우 FAM의 경우 500-530나노미터, Tamara의 경우 558-580나노미터에서 배출량을 수집하고 각 pH 값에서 생성된 최대 방출 비율의 비율을 계산합니다. 그런 다음 나노 센서 샘플을 탄소 코팅 전자 현미경에 놓고 아르곤 대기에서 5분 동안 입자를 금으로 스텁 및 스퍼터링하여 SEM 이미징을 위한 샘플을 준비합니다.

코팅이 완료되면 샘플을 전자 현미경에 넣고 작동 거리, 전압 및 배율을 조정하여 전자 전하를 최소화하고 흄 후드에서 최상의 이미지를 생성합니다. 1%perineum formate를 가진 디 클로로 메탄에 있는 20%PLGA 해결책을 만드십시오. 18게이지 무딘 주입 바늘이 있는 10ml 주사기에 용액을 넣고 주사기 펌프에 단단히 끼웁니다.

이 솔루션은 제어 PLGA 골격이 20 x 15cm 알루미늄 수집판에서 바늘 끝을 20cm 떨어진 곳에 만들고 고전압 전원 공급 장치의 전극을 주사기 끝에 부착하고 와이어를 알루미늄 수집판에 접지하는 데 사용됩니다. 그런 다음 전원 공급 장치를 켜고 전압을 12킬로볼트로 조정합니다. 그런 다음 주사기 펌프를 켜고 2시간 동안 시간당 3.5밀리리터의 일정한 유속을 사용하여 용액을 공급합니다.

이렇게 하면 약 60미크론의 스캐폴드 깊이가 생성됩니다. 완료되면 장비를 끄고 배기 후드의 비계를 24시간 동안 그대로 두어 용매 잔류물이 증발할 수 있도록 합니다. pH 반응성 나노 센서와 통합 된 스캐폴드를 준비하려면 이전과 같이 PLGA 용액을 준비하되 이번에는 나노 센서의 밀리리터 당 5 밀리그램을 추가하십시오.

그런 다음 이전과 동일한 설정을 사용하여 pH 반응성을 전기 스핀합니다. 다음으로, 나노센서가 통합된 건조된 스캐폴드의 작은 샘플을 35mm 배양 플레이트에 넣고 컨포칼 현미경에서 pH 5.5와 7.5 사이의 2밀리리터의 소렌센 인산염 완충액에 0.5씩 담궈 스캐폴드의 pH 응답성을 보정합니다. 488 나노미터 아르곤 레이저를 사용하여 FAM을 여기시키고 568 나노미터 크립톤 레이저를 사용하여 나노 센서 내에서 Tamara를 여기시킵니다.

FAM의 경우 500-530나노미터, Tamara의 경우 558-580나노미터에서 방출을 관찰한 다음 각 pH 값에서 생성된 방출 최대값의 비율을 계산합니다. 먼저 각 측면에서 15분 동안 8cm 거리에서 UV 광원으로 골격 표면을 살균합니다. 그런 다음 골격을 12웰 배양 플레이트로 무균 상태로 옮기고 골격 위에 내경이 1cm, 외경이 2cm인 강철 링을 놓습니다.

다음으로, 강철 링의 내부와 외부에 5% 펜 스트립이 있는 PBS를 추가하고 밤새 샘플을 배양합니다. 다음 날. 5% 펜 연쇄상구균으로 PBS를 제거하고 PBS로 골격을 세척합니다.

그런 다음 500마이크로리터의 세포 배양 배지를 강철 링의 내부와 외부에 추가하고 인큐베이터에서 플레이트를 예열합니다. 다음으로, 관심 세포를 수확하고 밀리리터당 6개의 세포에 10의 1배의 세포 현탁액을 준비합니다. 세포가 준비되면 웰에서 매체를 제거하고 강철 링 외부에 1ml의 새 배지를 추가합니다.

그런 다음 300마이크로리터의 셀 현탁액을 강철 링 내부에 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 셀을 고르게 분포시킵니다. 플레이트를 5%CO2의 섭씨 37도 인큐베이터에 넣고 필요한 만큼 세포를 배양합니다. 2-3일마다 배지를 새로 고침하면 이전 섹션에서 설명한 대로 세포를 골격에 파종하고 72시간 동안 중단 없이 자랄 수 있습니다.

그런 다음 PBS로 세포를 헹구고 링 외부에 500마이크로리터의 무혈청 배지를 추가하고 링 내부에 300마이크로리터를 추가합니다. 배양 중 섭씨 37도에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 50 마이크로 리터의 최적 및 잠시 간음과 함께 5 밀리그램의 나노 센서를 첨가하여 용액 A를 준비합니다.

그런 다음 5 마이크로 리터의 지방 절제술 2000을 45 마이크로 리터의 Optum에 첨가하여 용액 B를 혼합하고 혼합물을 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 다음으로, 용액 B 혼합물에 용액 A를 첨가한 후 실온에서 20분 동안 배양하여 나노센서 리포좀 복합체인 용액 C를 형성합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 100 마이크로 리터의 복합 용액을 강철 링 내부에 첨가하십시오.

그런 다음 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고 배양 후 3시간 동안 지방 절제술 시약 복합체와 함께 세포를 배양합니다. 배지를 흡인하고 가열된 PBS로 세포를 두 번 세척한 후 세포 장착 골격을 다른 phs의 완충액에 담궈 나노센서의 반응을 모니터링합니다. 이제 세포 내부에서 형광 컨포칼 현미경을 사용하여 세포를 이미지화하여 포유류 세포 내 나노 센서의 위치를 추적합니다.

먼저, 나노센서가 포함된 fam만 준비하여 PLGA 스캐폴드에 앉은 세포에 전달합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 배지에 2마이크로리터의 50나노 몰 리오 트래커 레드를 추가하고 배양 기간 후 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 매체를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.

그런 다음 2마이크로리터의 PBS 또는 기타 페놀 레드 프리 배지를 추가하여 컨포칼 이미징 중에 세포를 덮습니다. 다음으로, 핵 염색의 5 마이크로 몰을 추가하고 PBS에 5 드랙을 첨가하고 섭씨 37도에서 3 분 동안 세포와 함께 배양합니다. 3분 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 이미지, 나노 센서, 산 세포 기관 및 핵을 이미징하기 위해 컨포칼 스테이지에 놓고, 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다양한 여기 및 방출 파장을 사용하는 동시에 여기 파장의 수집을 피하기 위해 순차 스캐닝을 사용하면서, 준비된 pH 반응성 나노 센서의 크기 분포를 SEM을 사용하여 특성화하여 이미지화된 나노 센서의 모집단을 측정하고 찾았습니다. 240에서 470 나노 미터 범위의 나노 미터 치수를 가지고 있습니다.

왼쪽에는 PLGA 섬유를 방사한 전기의 이미지이고, 오른쪽에는 나노 센서를 사용한 PLGA 섬유를 방사한 이미지입니다. 섬유의 SEM 현미경 사진은 섬유 표면의 나노 센서 연관성의 증거를 제공합니다. 그러나 그들은 또한 골격 섬유 내에 통합될 수 있습니다.

일단 전기가 회전하면, nanosensors는 광학적으로 화학적으로 활동적인 체재하는 그들의 기능을 유지하고 비계 섬유와 관련되는 여기에서 보입니다. 왼쪽은 녹색으로 표시된 fam 염료이고 오른쪽은 빨간색으로 표시된 Tamara 염료입니다. 형광 강도 비율은 여기에 표시된 것과 같이 보정 곡선을 생성합니다.

나노 센서를 단독으로 평가하고 전기에 통합했을 때 PLGA 스캐폴드를 회전시켜 나노 센서가 스캐폴드에 통합된 후에도 광학 활성을 유지한다는 것을 보여주었습니다. 통합된 나노 센서는 또한 버퍼가 5.5와 7.5의 pH 사이에서 번갈아 가며 변화하는 pH 값에 잘 가역적으로 반응합니다. 팜 탐라(Tamra) 비율은 보여질 때마다 예상대로 반응했다.

다음은 트랜스펙션 시약을 통해 나노센서가 세포 내로 전달된 섬유아세포의 컨포칼 이미지입니다. fam과 Tamara 염료의 반점 공동 국소화는 염료가 나노 센서 매트릭스에 갇혀 있음을 시사합니다. 나노센서의 세포 내 전달은 다양한 완충액에 배치된 세포의 fam Tamara 비율을 측정하여 확인할 수 있습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 스캐폴드 기반 나노 센서를 측정할 때 비율이 증가하지만 세포 내의 센서를 측정할 때는 일정하게 유지됩니다. 이 기술이 개발된 후 조직 공학 분야의 연구원들은 현장에서 실시간으로 조사할 수 있습니다. 진행 중인 실험을 방해하지 않고 3D 세포 구조 내에서 미세환경 세포 내 pH 변화.