Name: 모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 학습하세요 열가역성 폴리머 역금형을 이용한 이중 구성 히드로겔 제작 방법을 통해 3D 세포 배양용 복잡한 패턴 구조를 만드는 기술을 익히세요. 이 방법은 조직 공학 연구에 활용됩니다.

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우리는 bioprinter에 도움 데보라 STUDER 감사합니다. 작품은 부여 계약을 N에 따라 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013) ° NMP4-SL-2009-229292에 의해 투자되었다.

1. 폴록 사머 407 용액의 조제 가능한 경우, 냉장실 (4 ° C)의 폴록 사머 솔루션의 준비를 수행합니다. 사용할 수없는 경우, 얼음처럼 차가운 물이 가득 비커에 유리 병을 놓습니다. 높은 온도에서 폴록 사머가 젤 점 이상이어야하며 제대로 분해되지 않습니다. <ol><li> 유리 병에 얼음 차가운 PBS 용액 60 mL를 추가하고 자석 교반기를 사용하여 적극적으로 저어. </li><li> 폴록 사머의 24.5 그램 무게와 차가운 PBS에 소량에 추가합니다. 폴록 사머 부분적으로 더 추가하기 전에 해산 될 때까지 기다립니다. </li><li> 모든 폴록 사머이 녹을 때까지 저어. </li><li> 100 ML의 최종 볼륨에 도달 할 때까지 차가운 PBS를 추가합니다. 최종 농도는 24.5 % W / V 될 것입니다 </li><li> 솔루션을 교반 중지하고 ° C가 용액에서 거품과 거품 때까지 사라 4에서 휴식을 할 수 있습니다. 젤 안에 갇혀 거품이 P로 전송됩니다rinter 카트리지 및 인쇄 희생 금형의 결함으로 이어질 것입니다. </li><li> 필터 (0.22 μm의 필터) 바늘을 방해 할 수있는 불필요한 입자를 제거하기 위해 직접 인쇄 카트리지에 솔루션을 제공합니다. 필터링 단계 필터 폴록 사머의 겔화를 방지하기 위해 (또는하지 않을 경우 냉각 팁, 필터 등 사용 가능) 추운 방에서 수행해야합니다. ° C까지 30 분 실험을하기 전에 4시에로드 된 카트리지를 보관하십시오. </li></ol> 2. 3D 프린터의 준비 이 작품에 사용되는 3D 프린터는 regenHU에서 &quot;BioFactory&quot;입니다. 시스템의 돌출 부분은 여러 부분으로 구성되어 있습니다. 상단의 압력 카트리지는 루어 잠금 어댑터를 통해 커넥터에 연결합니다. 커넥터는 카트리지의 출구와 솔레노이드 밸브의 입구 사이의 공백을 메워. 솔레노이드 밸브의 출구에서 직경이 다른 바늘을 사용할 수 있습니다. 소재는 하위에 압출진공 청소기를 이용하여 이동하는 단계에 개최되는 strate. 시스템의 주요 부분은 그림 1에 묘사되어 있습니다. 기타 압출 기반 시스템은 인쇄 과정에 사용하고, 최적화 프로세스는 각 시스템에 대해 수행해야 할 수 있습니다. <ol><li> 초순수로 채워 별도의 1.5 ML 테스트 튜브 솔레노이드 밸브 (노즐 직경 0.3 mm)와 바늘 (내경 0.15 mm) 놓고 30 분 동안 청소하는 가열 초음파 욕조에 넣습니다. 에탄올로 세척 밸브를 세척하고 질소 총을 건조. </li><li> 밸브와 니들 프린터뿐만 아니라 빈 카트리지 청소를 설치합니다. </li><li> 시스템에 3 줄의 압력을 적용하고 압축 공기로 설치된 밸브와 니들에서 잔여 액체를 날려. 작은 바늘 직경, 그것은 바늘을 방해 할 수있는 작은 입자의 항목을 방지하기 위해 압축 공기의 출구에 설치된 필터 (공통 주사기 필터 0.45 μm의 기공 크기)를 가지고하는 것이 좋습니다. </lI&gt; <li> 폴록 사머와 함께로드 카트리지 압력을 해제하고 설치합니다. 폴록 사머 실내 온도와 겔에 도달 할 수 있도록 카트리지는 카트리지를 설치하기 전에 냉장고에서 약 30 분을 이동해야합니다. </li><li> 시스템에 3 줄의 압력을 적용하고 바늘 끝을 도달하고 지속적인 물가에서 돌출 될 때까지 폴록 사머를 분배. </li></ol> 3. 인쇄 매개 변수의 최적화 정확한 3D 구조를 만들려면 인쇄 과정은 선택한 재료와 농도 최적화 할 수 있습니다. 점도와 3D 인쇄 시스템에 따라 각 재료 매개 변수의 고정 세트에 대한 특정 분배 볼륨과 선 두께를 얻을 것입니다. <ol><li> 적합한 CAD 소프트웨어 (그림에서 ISO 파일을 생성 할 수)와 함께, 당신은 인쇄하고자하는 구조로 같은 길이에 대한 하나의 라인을 그립니다. </li><li> 현미경 유리 슬라이드 25mm X 75mm X 1 배치mm 또는 프린터에 다른 기판과 진공을 ON하여 고정합니다. </li><li> 프린터 소프트웨어에서 50 Hz의 높은 주파수로 솔레노이드 밸브를 설정하고 3 줄의 높은 압력을 설정합니다. </li><li> 300mm / 분의 단계 속도를 가진 단 하나 줄 하나의 레이어를 인쇄합니다. </li><li> 원하는 라인 폭에 도달 할 때까지 압력을 줄일 수 있습니다. 또한 밸브의 개방 시간을 통해 돌출 볼륨을 제어 할 수 있습니다. </li><li> 어떤 연속 선이 더 이상 인쇄 할 수 없습니다 때까지 밸브의 빈도를 줄일 수 있습니다. 이 값 이상의 주파수를 선택합니다. </li></ol> 참고 : 원하는 라인 폭과 지속적인 라인이 달성되면, 하나의 인쇄 층을 한 후 최적의 단계 속도와 바늘의 상승 즉, 층 두께를 결정합니다. <ol start="7"><li> 서로의 상단에 여러 레이어를 인쇄하고 바늘이 여러 인쇄 층 후 이전 레이어 위에 올바른 위치에 있는지 확인합니다. 층의 두께 (바늘 리프트를 조정) 이렇게 각 계층은 다음 중 하나 (그림 3)의 상단에 인쇄되어 있는지 확인합니다. </li><li> 300mm / 압출 레이어가 이전의 것들 (그림 4)와 같은 위치에서 시작하고 종료하도록 분 단계적에서 무대의 무대의 속도를 감소시킵니다. 너무 높은 단계의 속도는 압출 재료가 이전 레이어를 터치하기 전에 단계는 이동 될 수. </li><li> 인쇄 기둥 구조. 단계 3.1.-3.8를 수행하는 대신 하나의 선 그리기의 단일 지점을 그립니다. 기둥을 인쇄 할 때에 집중하는 매개 변수는 기둥이 입금되어야 위치에서 프린트 헤드의 압력 (층 두께와 폴록 사머의 기둥의 직경을 조절) 밸브의 개방 시간 (압출 볼륨) 및 체류 시간입니다 . </li><li> 매개 변수가 최적화 될 때, 라인의 여러 레이어를 인쇄하는 단단한 벽 또는 포인트, 기둥의 경우가 발생합니다. 나중에 사용하기 위해 매개 변수를 저장합니다. </li></ol> 이 시점에서의 최적화 과정 동안 발견 매개 변수를 사용합니다. <ol><li> 유리 현미경 슬라이드에 내부 구조 (여기에는 기둥 배열)를 인쇄하고 밤새 건조하자. 이)는 구조물의 크기와 두께를 줄이고 b)는 피할 수 리프트 오프 백필 동안, 그래서 구조와 기판 사이 더 나은 접착력을 제공합니다. </li><li> CAD 소프트웨어로, 당신은 멀리 용출 채운하려는 구조를 둘러싼 외벽의 구성 구조를 그려라. 폴록 사머와 구조를 인쇄합니다. 벽의 인쇄 6 분 소요됩니다. </li></ol> 주의 : 벽 때문에 바늘의 크기의 내부 구조로부터 최소 3.5 mm 떨어져 인쇄 할 수 있습니다. 그렇지 않으면 외벽의 인쇄가 내부 구조를 파괴 할 것이다 <ol start="3"><li> 당신의 SACR를 백필 할 솔루션을 준비합니다와 ificial 형 (탈 이온수 여기에 1 % 아가로 오스). 아가로 오스 솔루션은 35 ° C와 45 ° C. 사이의 온도를 가지고 있어야 이 온도 아래, 아가가 너무 빨리 응고 것이다 폴록 사머 구조가 부드럽게 때문에이 온도 이상, 그것은 인쇄 된 기둥을 파괴 할 수 있습니다. </li><li> 천천히 피펫을 사용하여 되메우기 솔루션을 희생 형을 입력합니다. 이 벽 내부 구조의 파괴를 방지하기 위해 천천히 수행해야합니다. </li><li> 채워질 솔루션 젤을하게하거나 사용 폴리머에 따라 가교. 아가의 경우 응고가 10 분 동안 4 ° C에서 열렸다. </li><li> 폴록 사머 구조를 용출하는 10 분 동안 얼음 목욕 채워질 희생 형을 놓습니다. </li><li> 종이 티슈로 채워질 구조를 몰아 내고 새로운 유리 현미경 슬라이드에 배치합니다. 사이의 공간에 빈에서 세 번째 하이드로 젤의 누설을 방지하기 위해 유리 현미경 슬라이드에주의 구조를 누르면채워질 구조와 유리 현미경 슬라이드. </li></ol> 5. 보이드의 작성 <ol><li> 용출 폴록 사머에 의해 왼쪽 빈 공간을 채우기 위해, 30 G 바늘을 장착 한 주사기로 의도 된 고분자 용액을 채운다. 이 예제에서, 우리는 0.05 %의 추가로 0.15 M 염화나트륨 용액에 1 % 알긴산 메타 크릴 레이트를 사용하여 W / V 리튬 페닐 -2,4,6 - trimethylbenzoylphosphinate (LAP)와 2.5 %의 v / V를 사용 알렉사 - 488 복합 피브리노겐 . 알렉사 - 488 복합 피브리노겐은 시각화 목적을 위해 추가되었습니다. </li><li> 5 분 및 이미지에 대한 고강도 UV 램프 (100 와트, 365 nm의 기판에서의 거리 3.5 cm이었다)와 폴리머를 Photopolymerize 에피 형광 또는 공 촛점 현미경을 사용하여 구성. </li></ol>

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저자는 선언 아무 상관이 없다.

여기에 우리가 처음 제시 빠르게 때문에 ~ 20 ° C의 폴록 사머의 젤 - 졸 전환 차가운 물에 용출 될 수있는 희생 금형 thermoresponsive 폴리머의 사용 전체 프로세스의 속도가 적절한 해상도로 인쇄 할 수 없습니다 생체 고분자 구조의 빠른 생성을위한 폴록 사머 재미 있습니다. 여기에 설명 된 기술은 다른 하이드로 겔 내에서 또는 이전에 다른 물질 35에 대해보고 되었기 때문에 미세 유체 채널의 생성을위한 패턴 하나의 하이드로 겔을 사용할 수 있습니다. 희생 형으로 폴록 사머의 장점은 채워지고 나중에 용출 할 수있는 고체 계층별로 계층 구조에 임의의 형상에 인쇄 할 수 있다는 것입니다. 우리는 여기에 구조화 된 하이드로 겔을 만드는 두 번째 히드로 겔의 후속 백필과 폴록 사머와 희생 금형을 만드는 과정을 설명합니다. 구조화 된 하이드로 겔의 재료는 채널이 될 수 있습니다작성 시점에서 점도와 온도에 관해서는 제한 OSEN. 폴리에틸렌 글리콜 디...

조직 공학 접근 방법은 인간의 조직과 장기 19,20의 재생과 관련하여 지난 몇 년 동안 많은 진전을 만들었습니다. 그러나, 지금까지 조직 공학의 초점은 종종 단순한 구조 또는 방광 21,22 또는 피부를 23-25으로 작은 치수가 조직에 한정되어있다. 인간의 몸은, 그러나, 세포와 세포 외 기질이 공간적으로 정의 된 방식으로 배열되어 많은 복잡한 3 차원 조직을 포함하고 있습니다. 이러한 조직을 제조하는 기술은 특정 위치에서 3 차원 구조 내에서 세포와 세포 외 기질 발판을 배치 할 수 있어야합니다. Bioprinting는 제조 복잡한 3 차원 조직의 비전 10,11,26-28을 실현 할 수있는 그런 기술이 될 가능성이있다. Bioprinting은 패터닝 소재 전송 프로세스의 사용 &quot;으로 정의 생물학적으로 상대를 조립합니다evant 재료 - 분자, 세포, 조직, 생분해 성 생체 -. 하나 이상의 생물학적 기능 &quot;4 달성하기 위해 소정의 조직과 그것은 여러 가지 기술을 포함 두 개의 서브 마이크론 해상도에 이르기까지 서로 다른 해상도 및 길이의 비늘에서 작동하는 압출 인쇄 1,12,30위한 420 μM ~ 150 ㎛의 해상도 광자 중합 29. 아니 하나의 재료 또는 재료의 조합이 각각의 방법 (31)의 요구 사항을 만족시킬 것이다. 압출 인쇄의 주요 매개 변수는 점도 겔화 시간이다 높은 점도와 빠른 겔화가 바람직하다 32. 3D 프린팅은 복잡한 형상에게 30,33,34를 만들기위한 희생 금형 쉽게 만들 수있는 기술입니다. 이 과정은 압출 bioprinter 등 신속한 프로토 타이핑 기술을 사용하여 금형의 구조를 기반으로합니다. 만든 희생 형이 사용됩니다그들의 낮은 점도와 느린 겔화 시간으로 인해 인쇄하기 어려운 물질로부터 복잡한 구조를 형성한다. 여기에 제시된 방법은 낮은 온도에서 빠르게 용해하고 정확하게 압출 될 수있는 물질로 이루어진 희생 곰팡이의 생성을 포함한다. 블록 공중 합체 폴리 (에틸렌 글리콜) 99 - 폴리 (프로필렌 글리콜) 67 - 폴리 (에틸렌 글리콜) 99 (또한 플루로 닉 F127 또는 폴록 사머 407라고도 함) 이러한 요구 사항을 충족. 그것은 이미 우리의 지식, 액체 환경에서의 불안정성으로 인해 수정되지 않은 버전의 인쇄에 사용 된 적이 있으며, 압출 인쇄 1 수정 버전에서 사용되었지만. 폴록 사머 407도 반전 열 반응 문제 18 즉, 냉각시 보솔 겔에서이 변화를 보여줍니다. 가장 중요한 것은, 그것은 매우 높은 충실도 복잡한 임의의 곡선 구조로 인쇄 할 수 있습니다. 이렇게하면에서 구조화 된 하이드로 겔의 생성저점도 물질이 경우 느린 겔 아가, 인쇄 희생 금형에 솔루션을 피펫 있습니다. 높은 충실도와 주조 구조화 된 하이드로 젤로부터 빠른 용출 그것은 마스크 또는 자주 리소그래피 방법에서 요구되는 스탬프를 사용하지 않고 다른 형상으로 금형을 만들 수있는 빠르고 유연한 방법을 만들어 함께 희생 형 인쇄의 조합. 주조 구조화 된 하이드로 젤은 더욱 낮은 점도로 인해 압출 인쇄에 적합하지 않은 다른 물질로 채워질 수있다. 이것은 우리의 경우 저점도 알긴산 메타 크릴 레이트 솔루션입니다. 여기에 우리가 기둥 배열의 예제를 사용하여 하이드로 겔 패턴에 대한 thermoresponsive 역 희생 금형의 방법을 제시한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Poloxamer (Pluronic F127)</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp; productID=10010015" target="_blank">10010-015</a></td><td></td></tr><tr><td>CAD 소프트웨어</td><td>regenHU</td><td>BioCAD</td><td></td></tr><tr><td>알긴산 메타크릴레이트</td><td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td><td></td><td>FP7 프로젝트 nr nmp4-sl-2009-229292</td></tr><tr><td>인간 플라즈마의 피브리노겐, Alexa fluor 488 conjugate</td><td>invitrogen</td><td>f13191</td><td></td></tr><tr><td>리튬 페닐 -2,4,6- 트리메틸 벤조일 포스 피네이트 (LAP)</td> <td>Innovent e.V Technologieentwicklung Jena</td><td></td><td>FP7 프로젝트 Nr NMP4-SL-2009-229292</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Bioprinter</td><td>regenHU</td><td>Biofactory</td><td></td></tr><tr><td>Valve</td><td>regenHU</td><td>300 &# 956; m Nozzel 직경</td><td></td></tr><tr><td>바늘</td><td>regenHU</td><td>150 &#956; m ApoTome</td> Zeiss UV 광원이 있는 Zeiss Axioobserver 내경 <td></td></tr><tr><td></td><td>UVP</td><td>Blak-Ray B-100AP 고강도 UV 램프</td><td>100W</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

모방의 창조 3d 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 thermoresponsive 역 금형 인쇄

Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Bioprinting은 신속한 프로토 타입 산업에서 그 기원을 가지고 새로운 기술입니다. 다른 인쇄 공정은 접촉 bioprinting 1-4 (압출, 딥 펜과 소프트 리소그래피), 비접촉식 bioprinting 5-7 (레이저 앞으로 전송, 잉크 제트 증착)와 같은 두 개의 광자 광중합 8로 레이저 기반 기술로 나눌 수 있습니다. 그것은 등 다른 세포 유형 17의 공동 배양의 영향으로 기본적인 생물 학적 질문에 대답하는 등 조직 공학 9-13, 바이오 센서 미세 14-16로와 도구로 많은 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 일반적인 포토 리소그래피 나 소프트 리소그래피 방법과는 달리, 압출 bioprinting은 별도의 마스크 나 스탬프를 필요로하지 않는 장점이 있습니다. CAD 소프트웨어를 사용하여 구조의 설계를 신속하게 운영자의 요구 사항에 따라 변경 및 조정될 수있다. 이 리소그래피 기반의보다 유연 bioprinting합니다방법. 여기에 우리가 예를 들어 하이드로 겔 내에서 기둥의 배열을 사용하여 다중 소재 3D 구조를 만들려면 희생 금형의 출력을 보여줍니다. 이 기둥은 신경 가이드 도관 내의 혈관 네트워크 또는 튜브에 대한 중공 구조를 나타낼 수 있습니다. 희생 형을 위해 선택된 재료는 폴록 사머 407, 4에 액체 우수한 인쇄 특성을 가진 thermoresponsive 폴리머이었다 ° C 및 겔화 온도 이상으로 고체 ~ 20 ° C 24.5 % W / V 솔루션 18. 이 속성은 폴록 사머 기반의 희생 금형 수요에 용출 될 수 있으며, 특히 좁은 형상에 대한 고체 물질의 느린 분해에 장점이 있습니다. 폴록 사머를 희생 금형을 만들 현미경 유리 슬라이드에 인쇄되었다. 아가는 금형에 피펫 및 겔화 될 때까지 냉각 하였다. 얼음 냉수에있는 폴록 사머의 용출 한 후, 아가로 오스 금형 보이드 알지네이트 메타 크릴 레이트 SP로 가득 차 있었다FITC 표시 피브리노겐과 iked. 채워진 빈 공간은 다음 UV와 교차 연결되었고, 구조는 에피 형광 현미경으로 몇 군데 있었다.

대표 결과는 반전 형 기술은 (그림 2) 제 2 물질로 채워질 수 구조화 된 젤을 만드는 것을 보여줍니다. 모든 인쇄 과정의 시작 부분에 인쇄 매개 변수가 먼저 최적화되어 있습니다. 매개 변수의 단계적 조정은 그림 3과 하나의 선이 인쇄 그림 4에 나와 인쇄 다층 구조가 발생합니다. 층의 두께는 (하나의 인쇄 층 후 바늘) 이용하실 너무 낮은 경우, 하나는 바늘이 위의 레이어를 만질 것을 알 것입니다. 바늘이 너무 높은 경우, 인쇄 구조의 표면에 물결 무늬가 나타납니다. 이 그림 테스트 된 모든 층의 두께가 주어진 단계의 속도가 너무 크다고 3A-3D에서 볼 수 있습니다. 높은 단계의 속도는 층의 두께를 줄일 수 있기 때문에, 세트와 실제적인 층의 두께 사이의 작은 차이가 축적 웨이브 패턴이 시작됩니다구조 증가의 높이로 표시합니다. 층의 두께를 낮추는 방법으로, 차이가 작아와 ...

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

이 절차의 전반적인 목적은 3D 세포 배양을 위한 패턴화된 2성분 하이드로젤을 제작하기 위해 리버스 몰드(reverse mold)를 출력하는 것입니다. 이는 먼저 4 °C에서는 액체 상태이지만 상온에서는 부드러운 젤 상태가 되는 열가역성 폴리머를 사용하여 리버스 몰드를 출력함으로써 달성됩니다. 이 리버스 몰드는 나중에 제거될 수 있습니다.두 번째 단계는 선택한 바이오폴리머로 역몰드를 채우는 것입니다. 여기서는 aros를 사용하였습니다. 바이오폴리머는 효소, UV 또는 온도 가교를 통해 가교 결합될 수 있습니다.다음으로, 몰드를 찬물에 담가 역몰드를 탈형합니다. 이 단계가 끝나면, 완성된 AROS 몰드는 추가 공정을 진행할 준비가 됩니다. 마지막 단계는 공극을 두 번째 바이오폴리머로 채우는 것이며, 이 바이오폴리머에는 세포가 포함될 수 있고 효소, UV 광선 또는 온도를 통해 가교 결합시킬 수 있습니다.최종적으로, 우리는 공간적으로 조직된 D 세포 배양 지지체를 제작하기 위한 재현 가능한 방법을 확립하였습니다. 동료가 Oxr의 열 반응성 특성을 활용하여 이를 희생 몰드로 사용할 수 있다고 제안했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻게 되었습니다. 이 절차의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 Misha Muah가 진행하겠습니다.먼저 유리 병에 60 milliliters의 차가운 PBS 용액을 넣고 마그네틱 스터러를 사용하여 격렬하게 교반합니다. 그런 다음 Paul ER 24.5 grams을 정량하여 차가운 PBS에 조금씩 첨가합니다. Paul Oxr가 PBS에 부분적으로 용해될 때까지 기다린 후 추가로 첨가하십시오.모든 Paul Oxr이 용해될 때까지 용액을 계속 교반합니다. 다음으로, 최종 부피가 100 milliliters가 될 때까지 얼음처럼 차가운 PBS를 추가하여 최종 농도를 24.5%weight per volume로 맞춥니다. 그 후 혼합물이 충분히 섞일 때까지 교반합니다.용액의 교반을 멈추고 4 °C에서 하룻밤 동안 방치하여 용액 내의 기포와 거품이 모두 사라지게 합니다. 겔 내부에 갇힌 기포는 프린터 카트리지로 옮겨져 출력된 희생 몰드에 결함을 유발할 수 있습니다. 바늘을 막을 수 있는 불필요한 입자를 제거하기 위해 미리 냉각시킨 필터를 사용하여 용액을 프린팅 카트리지에 직접 멸균 여과합니다.실험 시작 30분 전까지 카트리지를 4°C에서 보관하십시오. 초순수로 채운 별도의 1.5 mL 미세 원심분리 튜브에 솔레노이드 밸브와 니들을 넣고 30분 동안 초음파 세척하여 프린팅 준비를 하십시오. 그 다음, 세척된 밸브를 에탄올로 헹구고 질소 건으로 건조하십시오.다음으로, 세척된 솔레노이드 밸브와 니들을 프린터에 장착하십시오. 또한, 시스템 테스트를 위해 비어 있는 깨끗한 프린트 카트리지를 장착하십시오. 시스템에 3 bar의 압력을 가하고 압축 공기를 사용하여 장착된 밸브와 니들에서 잔류 액체를 모두 불어내십시오.바늘 직경이 작은 경우에 해당합니다. 바늘을 막을 수 있는 미세 입자의 유입을 방지하기 위해 압축 공기 배출구에 필터를 설치하십시오. 그런 다음 압력을 끕니다.압력이 0으로 떨어지면 poly oxr이 미리 충전된 카트리지를 장착합니다. 프린팅 전, 액체 상태인 poly oxr이 실온에 도달하여 겔화될 수 있도록 카트리지 장착 약 30분 전에 냉장고에서 꺼내 두어야 합니다. 카트리지를 뒤집어 poly oxr이 겔화되었는지 확인하십시오.다음으로, 시스템에 3 bar의 압력을 가하고 Paul Emer를 바늘 끝까지 분사하여 연속적인 가닥으로 압출되도록 합니다. bio CAD 소프트웨어를 사용하여, 프린터 소프트웨어 설정 메뉴에서 출력하고자 하는 구조물과 거의 동일한 길이의 선 하나를 그립니다. 파라미터 섹션에서 솔레노이드 밸브를 50 hertz의 고주파수로 설정하고, 고압 설정을 3 bar로 수동 조정합니다.다음으로, 유리 현미경 슬라이드를 프린터에 놓고 진공 장치를 켜서 고정합니다. 그런 다음 스테이지 속도를 300 millimeters per minute로 설정하여 단일 선의 한 층을 프린팅합니다. 새로운 선을 그릴 때마다 수동으로 압력을 낮추고 소프트웨어의 주파수 설정을 조절하여 원하는 선폭을 얻되, 선이 끊기지 않고 연속적으로 유지되도록 합니다.그려진 선이 끊어지면 하한값에 도달한 것입니다. 원하는 너비의 연속적인 선이 얻어지면, 출력된 구조물의 결함 여부를 확인하여 최적의 스테이지 속도와 층 두께를 결정하십시오. 층 두께를 미세하게 조정하기 위해 압력과 주파수 또한 약간 재조정해야 할 수도 있습니다.층 두께 설정을 테스트하려면, 여러 층을 서로 위에 겹쳐서 출력하고 바늘이 이전 층 위의 올바른 위치에 있는지 확인하십시오. 각 층이 이전 층 바로 위에 출력되도록 층 두께를 조정하십시오. 스테이지 속도를 최적화하려면, 압출된 층의 시작점과 끝점이 이전 층의 위치와 일치하기 시작할 때까지 스테이지 속도를 300 millimeters per minute부터 단계적으로 낮추십시오.스테이지가 너무 빠르게 이동하면 층 상단에 물결 모양의 패턴이 나타납니다. 기둥 구조를 프린팅하려면 CAD 소프트웨어에서 선 대신 단일 점을 그리십시오. 그런 다음 압력과 주파수를 미세 조정하여 층 두께와 기둥 직경을 조절하고, 프린트 헤드의 스텝 시간을 조정하여 프린팅 속도를 최대화하십시오.최적화가 완료되면, 추후 사용을 위해 매개변수를 저장하십시오. 먼저, 이 필라 배열과 같은 내부 구조를 유리 현미경 슬라이드 위에 프린팅하고 건조시킵니다. 하룻밤 동안 건조하면 구조의 크기와 두께가 감소하며, 구조와 기판 사이의 접착력이 향상됩니다.다음 날, 제거 및 충전하려는 구조물을 둘러싸는 외부 벽 구조를 그립니다. 바늘의 크기로 인해 폴리머 벽은 내부 구조물로부터 최소 3.5 밀리미터 떨어져서 출력되어야 합니다. 그다음, 탈이온수에 1% aros 혼합물을 준비하고, 완전히 용해될 때까지 전자레인지로 가열합니다.agro solution을 35~45 °C 사이로 냉각하십시오. 그런 다음 피펫을 사용하여 sacrificial mold에 agro solution을 채웁니다. 이때 벽 내부 구조의 파괴를 방지하기 위해 천천히 주입해야 합니다.몰드를 채운 후 4°C에 두어 겔을 응고시킵니다. 약 10분 후에 겔을 냉장고에서 꺼내어 얼음 수조에 10분 동안 두어 폴리머 구조를 용출시킵니다. 그다음 구조물을 조심스럽게 꺼내고 페이퍼 타월로 가볍게 눌러 잔류 수분을 제거합니다.세 번째 하이드로젤의 누출을 방지하기 위해, 구조체를 새로운 유리 현미경 슬라이드 위에 조심스럽게 눌러 밀봉합니다. 다음으로, 0.15 M 염화나트륨에 알긴산 메타크릴레이트 1% 용액을 준비합니다. 용액을 볼텍싱하여 알긴산 메타크릴레이트를 용해시킵니다.그 다음, 형광을 통해 쉽게 시각화할 수 있는 세 번째 하이드로젤을 얻기 위해 2.5% v/v Alexa 488 접합 피브리노젠과 0.05% w/v 리튬 페닐 2,4,6-트리메틸벤조일 포스페이트를 첨가합니다.이 용액을 30 gauge 바늘이 장착된 0.3 milliliter 주입기에 넣습니다. 그런 다음 주입기를 사용하여 용출된 폴리머로 인해 생긴 빈 공간을 채웁니다. 각 컬럼에서 바늘을 뺄 때 폴리머를 분사하여 각 컬럼을 완전히 채워야 합니다.마지막으로, 주입된 폴리머를 고강도 UV 램프로 5분 동안 광중합시킨 후, 에피 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 제작물을 이미징합니다. 여기에는 방금 제작한 것과 유사한 제작물의 3D Zack 재구성 이미지가 표시되어 있으며, 백필(backfill)에는 형광 표지된 alginate가 사용되었습니다. 필러 모양은 녹색 기둥으로 나타나며, 제작물의 외곽 부분은 투명하게 보입니다.이 영상에서 보여주는 기술은 여기 제시된 동심원과 같이 다양한 3D 배열에 광범위하게 적용 가능합니다. 해상도는 바늘의 직경에 따라 달라집니다. 이 설계에 사용된 150 micron 직경의 바늘은 직경 120에서 200 micron 사이의 가닥을 생성할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 oxr 프린팅에 포함된 단계들을 충분히 이해하게 될 것입니다. 본 영상에서는 패턴 하이드로젤을 제작하기 위한 희생 몰드로 oxr을 사용하는 방법을 시연하였으나, 제조 공정용 버전의 폴리머를 사용하는 경우 oxr을 UV로 안정화할 수도 있습니다.

printing-thermoresponsive-reverse-molds-for-creation-patterned-two

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 프로토콜에서는, 우리는 기술의 기반이되는 수직 전이 게시물의 마이크로 액추에이터 어레이의 제조 방법 및이 기본 기술이 모두 2 차원 입체 문화에 높은 처리량 기계 역동적인 세포 배양을 실시하도록 수정할 수 있습니다을 증명 패러다임.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

간단한 기법은 일반적인 세​​포 배양 기판에 동적 마스크 프로젝션 리소그래피를위한 디지털 micromirror 장치를 사용하여 microfabricated 신경 문화 시스템의 급속한 생산 설명되어 있습니다. 이러한 문화 시스템은 천연 생물 학적 구조가 더 대표 수 있으며, 설명된 기술은 다양한 어플 리케이션에 맞게 수 있습니다.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

우리는 독립형 형태로 조립 및 조작할 수 있는 간단한 프로세스를 사용하여 미세 패턴화된 하이드로겔 시트의 제작을 설명합니다. 이러한 모듈식 하이드로겔 시트를 사용하면 제어된 세포 미세환경으로 간단한 매크로 스케일 3D 세포 배양 시스템을 생성할 수 있습니다.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 촬상 실시간 세포 생물학 연구를위한 강력한 도구이다. 여기서, 종래의 표면 형광 현미경을 사용하여 생리적 3 차원 히드로 겔 미세 환경에서 FRET 촬상 세포위한 방법이 제시된다. 활성 범위에 걸쳐 선형 비율을 산출 비율 적 FRET 프로브에 대한 분석을 설명한다.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

우리는 3차원 세포 배양 응용을 위한 합성 하이드로겔 매트릭스의 광 매개 형성 및 후속 생화학적 패터닝을 위한 순차적 프로세스를 설명합니다. 세포 적합성 photoclick chemistry를 가진 하이드로겔의 구성 및 변형이 입증되었습니다. 또한 패턴을 정량화 및 관찰하고 이러한 하이드로겔 내에서 세포 생존력을 결정할 수 있는 손쉬운 기술이 제시됩니다.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

이 프로토콜 사용자 정의 3D 인쇄 하는 플라스틱 금형을 사용 하 여 변수 크기의 자기 조립된 조직 반지 날조를 위한 플랫폼을 설명 합니다. PDMS 원판 3D 인쇄 형;에 치료 된다 다음 agarose 치료 PDMS 원판에 캐스팅 됩니다. 세포는 그들은 조직의 반지로 집계 결과 agarose 우물에 시드.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

우리는 셀과 다중 세포 소기관으로 3D 문화와 실험을 위한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 장치는 정의 된 화학 유인 구배가 있는 3D 미세 환경에서 가용성 신호에 대 한 셀룰러 응답을 분석 할 수 있습니다. 유기 체는 약한 시끄러운 입력의 검출에 단일 세포 보다 낫다.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

여기에 제시된 젤라틴 메타크릴로일의 3D 바이오프린팅을 위한 방법이다.

젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

하이드로겔 형성 중 전단 처리는 전단력이 제거된 후 전단이 얇지만 빠르게 재구성되는 마이크로겔 현탁액의 생성을 초래합니다. 이러한 물질은 바이오프린팅 복합체, 세포 함유 구조의 지지 매트릭스로 사용되었습니다. 여기서는지지 베드 및 호환 가능한 바이오 잉크를 제조하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.

부유 된 3D 바이오 프린팅을위한 겔화 동안 전단 처리에 의해 형성된 Agarose 유체 겔

이 기사에서는 세포외 기질 경화 및 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 광조정 가능 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다.

섬유아세포 활성화를 연구하기 위한 3D 바이오프린팅 광조정 가능 하이드로겔

학습하세요 열가역성 폴리머 역금형을 이용한 이중 구성 히드로겔 제작 방법을 통해 3D 세포 배양용 복잡한 패턴 구조를 만드는 기술을 익히세요. 이 방법은 조직 공학 연구에 활용됩니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

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