모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

이 절차의 전반적인 목표는 3D 세포 배양을 위한 패턴화된 2액형 하이드로겔을 만들기 위해 리버스 몰드를 프린팅하는 것입니다. 이것은 먼저 섭씨 4도의 액체이지만 실온에서는 부드러운 겔인 열 가역성 폴리머에서 역 주형을 인쇄하여 수행됩니다. 이 역 금형은 나중에 피할 수 있습니다.

두 번째 단계는 선택한 생체 고분자로 역 주형을 채우는 것입니다. 여기서는 aros를 사용했습니다. 생체 고분자는 효소, UV 또는 온도 가교에 의해 가교될 수 있습니다.

다음으로, 리버스 몰드는 El 곰팡이를 찬물에 담그는 것으로 암시됩니다. 이 단계가 끝나면 결과 AROS 금형을 추가 처리할 준비가 됩니다. 마지막 단계는 세포를 포함할 수 있고 효소, 자외선 또는 온도를 통해 가교 결합할 수 있는 두 번째 바이오 폴리머로 공극을 채우는 것입니다.

궁극적으로, 우리는 D 세포 배양 스캐폴드에 공간적으로 조직화된 재현 가능한 방법을 확립했습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 동료가 Oxr를 희생 주형으로 사용하여 Oxr의 열 반응 특성을 활용할 수 있다고 제안했을 때 처음 떠올랐습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Misha Muah입니다.

먼저 유리병에 얼음처럼 차가운 PBS 용액 60ml를 넣고 자석 교반을 사용하여 세게 저어줍니다. 그런 다음 Paul ER 24.5g의 무게를 측정하고 차가운 PBS에 소량을 첨가합니다. 더 추가하기 전에 Paul Oxr이 PBS에서 부분적으로 용해될 때까지 기다리십시오.

Paul Oxr이 모두 용해될 때까지 용액을 계속 저어줍니다. 다음으로, 최종 부피가 100밀리리터에 도달할 때까지 얼음처럼 차가운 PBS를 추가하여 부피당 중량 24.5%의 최종 농도를 생성합니다. 그런 다음 잘 섞일 때까지 혼합물을 저어줍니다.

용액을 젓는 것을 멈추고 용액의 거품과 거품이 사라질 때까지 밤새 섭씨 4도에서 그대로 두십시오. 겔 내부에 갇힌 기포는 프린터 카트리지로 옮겨져 인쇄된 희생 금형에 결함을 유발할 수 있습니다. 멸균 필터: 바늘을 막을 수 있는 원치 않는 입자를 제거하기 위해 사전 냉각 필터를 사용하여 용액을 인쇄 카트리지에 직접 여과합니다.

실험 30분 전까지 카트리지를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 솔레노이드 밸브와 바늘을 초순수로 채워진 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 30분 동안 신디케이트하여 프린팅을 준비합니다. 그런 다음 청소한 밸브를 에탄올로 헹구고 질소 건으로 건조시킵니다.

그런 다음 프린터에 깨끗한 솔레노이드 밸브와 바늘을 설치합니다. 또한 빈 깨끗한 잉크 카트리지를 설치하여 시스템을 테스트합니다. 시스템에 3bar 압력을 가하고 설치된 밸브와 니들에서 잔류 액체를 압축 공기로 불어냅니다.

작은 바늘 직경용. 바늘을 막을 수 있는 작은 입자의 유입을 방지하기 위해 압축 공기 출구에 필터를 설치하십시오. 그런 다음 압력을 끕니다.

압력이 0으로 떨어지면 poly oxr이 사전 로드된 카트리지를 설치합니다. 카트리지를 장착하기 약 30분 전에 카트리지를 냉장고에서 꺼내야 액체인 폴리 옥스가 인쇄하기 전에 실온과 젤에 도달할 수 있습니다. 카트리지를 뒤집어 폴리 옥스가 젤링되었는지 확인하십시오.

다음으로, 시스템에 3bar의 압력을 가하고 바늘 끝에 도달하고 연속적인 가닥으로 압출될 때까지 Paul Emer를 분배합니다. bio CAD 소프트웨어를 사용하여 프린터 소프트웨어 설정 메뉴에서 인쇄하려는 구조와 거의 같은 길이로 한 줄을 그립니다. 매개변수 섹션에서 솔레노이드 밸브를 50Hz의 고주파로 설정하고 고압 설정을 3bar로 수동으로 조정합니다.

그런 다음 유리 현미경을 설정하고 프린터를 밀어 넣은 다음 진공 청소기를 켜서 제자리에 고정합니다. 그런 다음 분당 300mm의 스테이지 속도로 단일 라인의 한 레이어를 인쇄합니다. 손으로 압력을 줄이고 각 새 라인에 대한 소프트웨어의 주파수 설정을 줄여 원하는 라인 너비를 얻고 라인이 연속적으로 유지되는지 확인하십시오.

그려진 선이 끊어지면 하한에 도달한 것입니다. 원하는 너비의 연속 라인이 달성되면 인쇄된 구조에서 결함을 확인하여 최적의 스테이지 속도와 레이어 두께를 결정합니다. 층 두께를 미세 조정하기 위해 압력과 주파수도 약간 재조정해야 할 수도 있습니다.

레이어 두께 설정을 테스트하려면 여러 레이어를 서로 위에 인쇄하고 바늘이 이전 레이어 위의 올바른 위치에 있는지 확인합니다. 각 레이어가 이전 레이어 위에 직접 인쇄되도록 레이어 두께를 조정합니다. 스테이지 속도를 최적화하려면 스테이지 속도를 분당 300mm에서 단계적으로 줄여 압출된 레이어가 이전 레이어와 동일한 위치에서 시작하고 끝나도록 합니다.

스테이지가 너무 빨리 움직이면 레이어 맨 위에 물결 모양의 패턴이 나타납니다. 기둥 구조를 인쇄하려면 CAD 소프트웨어에서 선 대신 단일 점을 그립니다. 그런 다음 압력과 주파수를 미세 조정하여 층 두께와 기둥 직경 및 프린트 헤드의 단계 시간을 조절하여 인쇄 속도를 최대화합니다.

최적화가 완료되면 나중에 사용할 수 있도록 매개변수를 저장합니다. 먼저 이 기둥 배열과 같은 내부 구조를 유리 현미경 슬라이드에 인쇄하고 건조시킵니다. 하룻밤 건조는 구조물의 크기와 두께를 줄이고 구조물과 기판 사이의 접착력을 향상시킵니다.

다음 날, 피하고 채우려는 구조를 둘러싸고 있는 외벽으로 구성된 구조를 그립니다. 폴리머 벽은 바늘의 치수로 인해 내부 구조에서 최소 3.5mm 떨어진 곳에 인쇄해야 합니다. 다음으로, 탈이온수에 1%aros의 혼합물을 완전히 용해된 후 전자레인지에 가열하여 준비합니다.

농업 용액을 섭씨 35도에서 45도 사이로 식히십시오. 그런 다음 피펫을 사용하여 희생 주형에 농업 용액을 채 웁니다. 이것은 벽 내부의 구조물이 파괴되지 않도록 천천히 수행해야합니다.

채워지면 금형을 섭씨 4도에 놓아 젤을 응고시킵니다. 약 10분 후 냉장고에서 젤을 꺼내 얼음 욕조에 10분 동안 넣어 폴리머 구조를 용리합니다. 그런 다음 구조를 조심스럽게 제거하고 종이 티슈로 얼룩을 만들어 잔여 수분을 제거합니다.

새 유리 현미경 슬라이드에 구조를 조심스럽게 눌러 세 번째 하이드로겔의 누출을 방지하는 우수한 밀봉을 만듭니다. 다음으로, 0.15 몰 염화나트륨에 1 % 용액의 알기네이트 메타 크릴 레이트를 준비합니다. Vortex는 알기네이트 메타크릴레이트를 용해시키는 용액입니다.

그런 다음 볼륨에 2.5% 볼륨을 추가합니다. Alexa, 4 88 공액 피브리노겐 및 부피당 0.05% 중량. 리튬 페닐 2 4 6 트리메틸 벤조일 포스페이트를 사용하여 형광을 통해 쉽게 시각화할 수 있는 세 번째 하이드로겔을 얻습니다.

이 용액을 30게이지 바늘이 장착된 0.3ml 주사기에 넣습니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 회피된 폴리머가 남긴 공극을 채웁니다. 각 열에서 바늘을 뽑을 때 폴리머를 배출하여 각 열을 완전히 채워야 합니다.

마지막으로, 주입된 폴리머를 고강도 UV 램프로 5분 동안 사진 중합한 다음 에피 형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 구조체를 이미지화합니다. 여기에 표시된 것은 방금 제작된 것과 유사한 구조물, 즉 되메우기에 사용되는 형광 라벨의 알긴산염을 3D Zack이 재구성한 것입니다. 기둥 모양은 녹색 기둥으로 나타나고 구성의 바깥쪽 부분은 투명합니다.

이 비디오에 표시된 기술은 여기에 표시된 동심원과 같은 다양한 3D 배열에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 해상도는 바늘 직경에 따라 다릅니다. 이 설계에 사용된 150미크론 직경의 바늘은 직경이 120미크론에서 200미크론 사이인 가닥을 생성할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 oxr 인쇄와 관련된 단계를 잘 이해하게 될 것입니다. 우리는 패턴 하이드로겔을 만들기 위한 희생 주형으로 oxr을 사용하는 것을 입증했지만, 중합체의 제조 관련 버전을 사용하는 경우 oxr도 UV 안정화될 수 있습니다.