Name: STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-09T21:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 배우세요 STA-PUT 속도 침전법을 사용하여 생식세포를 분리하는 방법을. 크기와 밀도 차이를 이용해 정자 형성 세포 유형을 효율적으로 분리하고 정제할 수 있습니다.

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이 연구는 NIH 보조금 SLB에 GM055360와 RGM에 U54HD068157에 의해 지원되었다. JMB는 펜실베니아 대학 (GM008216)에서 T32 유전학 교육 그랜트에 의해 지원되었다.

STA-PUT 프로토콜은 세 단계를 포함한다 : 1) 장치 및 시약의 설정, 전체 고환에서의 세포 현탁액 2) 준비, 3) 셀 로딩, 침강 및 분수 수집. 두 연구원의 팀에 의해 수행하는 경우, 프로토콜은 평균 8 시간이 소요된다. 1. STA-PUT의 장치를 설정한다 (그림 1) 수집의 방법을 선호하는 경우 *** STA-PUT 장치는 4 ° C 대형 냉장고 나 또한 일부 컬렉터를 수용 할 수있는 차가운 방에 배치해야합니다. <ol><li> 전에 (또는 적어도 몇 시간 전에) 당신이 방법을 수행 밤, 모든 장비 (특히 유리와 튜브)를 세척하고 70 % 에탄올로 소독. 완전도 1에 도시 된 바와 같이 장치를 조립하기 전에 장비를 건조 시키. </li><li> 두 개의 2 L 실린더 (그림 1B 및 C) 및 셀 로딩 챔버 (보안 <str사연&gt; 그림 1A) 상단 플랫폼 및 튜브 클램프 튜브의 두 개의 작은 조각으로 모두를 연결합니다. 클램프 모든 튜브 폐쇄. 가장 오른쪽이 L 실린더에 주둥이를 밀봉. </li><li> 셀 로딩 챔버에있는 작은 교반 막대 (그림 1A)와 2 % BSA를 포함 할 가장 왼쪽이 L 실린더에 큰 교반 막대 (그림 1B)를 놓습니다. </li><li> 플랫폼 (그림 1D)에 2 L 침강 챔버를 놓습니다. 직접 침강 챔버 (도 1D)의 바닥에있는 개구부의 상부에 금속 배플 (도 1F)을 배치. 배플은 분수를 수집하는 동안 셀 그라데이션의 액체 및 중단의 소용돌이로 교반 방지 등이 중요하다. 침전 챔버의 상부에 뚜껑을 놓습니다. </li><li> 삼방 스톱 콕 (도 1G)의 그라운드 글라스 조인트에 진공 그리스의 미량을 적용하면, SE의 아래쪽 콕 클램프dimentation 챔버, 스톱 콕 및 침강 실의 그라운드 글라스 조인트를 연결. </li><li> 튜브와 코크의 오른쪽 콘센트에 셀 로딩 챔버 (그림 1A)를 연결합니다. 마개를 닫습니다. </li><li> 마개의 왼쪽 콘센트에 세포 분별 튜브를 연결합니다. 분별 튜브의 개방 단부에 연결된 유리 파스퇴르 피펫으로 튜브의 조각을 포함한다. 작은 구멍 튜브의 조각은 유리 피펫의 좁은 끝 부분에 부착되어있다. 좁은 피펫은 분수를 수집하는 동안 세포 현탁액의 흐름을 제한합니다. 맨 아래에이 작은 튜브를 클램프. </li><li> 2 L 크렙스 준비 (1X) 실험 (표 1)의 일을 버퍼. 그런 다음, 1X 레브 550 ml의 2 % BSA, 1X 레브에있는 550 ㎖의 4 % BSA 및 1X 크렙스에 50 ㎖의 0.5 % BSA를 준비합니다. 필터와 4 ° C.에 이러한 솔루션을 냉각 </li><li> 오른쪽 2 L 실린더 (그림 1C)의 4 % BSA 용액과 2 % BSA를 부어왼쪽 2 L 실린더 (그림 1B)의 솔루션을 제공합니다. 확인이 실린더를 연결하는 튜브에 큰 거품이 없는지 확인하십시오. </li><li> 이러한 그라데이션을 방해 할 수로, 셀 로딩 챔버로 크렙스 버퍼를 따르고 있는지 더 큰 거품이 없다하고, 침전 챔버와이 챔버를 연결하는 튜브를 입력합니다. 압박 또는 튜브를 가볍게 치는 것은 부드럽게 거품을 제거하는 데 도움이됩니다. 크렙스 버퍼의 모든 튜브가 아닌 세포 실에 있는지 확인합니다. </li><li> 크렙스 완충액 소량 침강 챔버 내로 유동하고 튜브를 채우고있는 큰 기포를 제거하기 위해 세포 분획 튜빙으로 거의 모든 버퍼를 배출되도록. </li><li> 직접 침전 실 아래 부분 수집기를 놓습니다. 모든 분수 튜브가 제자리에 있고 오염을 방지하기 위해 플라스틱 포장으로 덮여 있는지 확인합니다. </li></ol> 2. 전체 고환에서 정자 형성 세포를 분리 <oL&gt; <li> 캘리포니아 주 12 성인 마우스 (바람직하게는 최소 8 주 이전) 및 실온에서 크렙스 버퍼에 어떤 장소 오염 물질을 씻어에서 고환을 해부하다. 설명하는이 프로토콜은 실험실 생쥐의 사용을 포함하고 펜실베니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학의 가이드 라인을 준수하여 수행되었다. </li><li> 당신이 정 세관을 추가하려는 직전에 원뿔 튜브에 50 ㎖ 크렙스 버퍼에 45 mg의 콜라게나 제를 추가합니다. 이 솔루션은 몇 분 동안 33 ° C까지 가열 할 수 있습니다. 두 50 ML 원뿔 튜브에 균등하게 분할합니다. </li><li> 투 니카 albuginea을 버리고 정 세관을 발표, 8 ML 크렙스 버퍼를 포함하는 별도의 접시에 고환을 디 캡슐. 투 니카 albuginea는 정 세관을 둘러싸고있는 얇은 막이다. 세관은 쉽게 투 니카 albuginea에서 분리해야합니다. 이를 위해, 투 니카 albuginea의 절개를, 친구 야 함께이 막을 개최집게의 R, 멀리 포셉의 다른 쌍을 사용하여 막에서 밖으로 세관을 밀어. </li><li> 콜라게나 제 용액 25 ㎖를 포함하는 각 원뿔 튜브에 세관을 포함하는 4 ML 크렙스 버퍼를 추가하고 10 분 동안 33 ° C에서, 동요, 품어. 끝에, 세뇨관는 &quot;스파게티와 같은&quot;외관을 가져야한다. </li><li> 세관은 튜브의 바닥에 ~ 5 분에 정착 할 수 있습니다. 상층 액을 붓고 세관은 튜브의 바닥에 각각의 시간을 정착 할 수 있도록 (실온에서) 25 ㎖를 크렙스 버퍼에 배를 세척한다. 각 튜브 ~ 5 ㎖ 크렙스 버퍼를 남겨주세요. </li><li> 세탁은, 당신이 정 세관을 추가하려는 직전에 팔콘 튜브에 50 ㎖ 크렙스 버퍼에 30 밀리그램의 트립신을 추가하는 동안. 이 솔루션은 몇 분 동안 33 ° C까지 가열 할 수 있습니다. 두 50 ML 원뿔 튜브에 균등하게 분할합니다. </li><li> 25 ㎖의 세관을 포함하는 두 개의 튜브의 각 트립신 솔루션을 추가합니다. 셀을 방지하기 위해 각각의 튜브에 3 μg의 DNA 분해 효소 (1 μg/10ml)를 추가응집에서의. 10 분 동안 33 ° C에서, 동요, 품어. </li><li> 약 10 배의 상품을 피펫 팅, 세관을 포함하는 용액을 교반의 넓은 구멍 피펫을 사용합니다. 이 솔루션은 더 많은 단일 세포 현탁액과 같이 시작한다. </li><li> 추가로 10 분 동안 33 ° C에서, 동요, 품어. 약 25 배의 상품을 피펫 팅, 단일 세포 현탁액에 세관을 분산 넓은 구멍 피펫을 사용합니다. 당신이 아직도 세관 또는 세포 덩어리를 많이 볼 경우, 피펫으로 더 분산 및 / 또는 각 튜브에 또 다른 3 μg의 DNA 분해 효소 (더블 초기 농도)를 추가합니다. </li><li> 100 ㎛의 메쉬 셀 스트레이너 (30 ㎖의 세포 현탁액을 각 튜브에 대해 하나)을 통해 단일 ​​세포 현탁액을 필터. 세포 현탁액을 결합하고 세포의 총 수 (10 × 13 7-8 사이 셀이어야한다) 센다. *** 그라데이션에 이상 800,000,000 세포를 넣지 마십시오. </li><li> 2.10 단계에서 얻은 세포 수에 기초하여, appropr 펠렛늦었 5 분 450 RCF에서 필터링 된 세포의 부피 30 ㎖ 크렙스 버퍼로 세척. 반복합니다. *** 보통 22 고환 이상 800,000,000 세포를 얻을 수 있지만 세포의 수보다 더로드되지 않습니다. </li><li> 조심스럽게 기포를 생성하지 않고 (세포 응집의 정도에 따라) DNA 분해 효소 μg 2.5에서 5 사이를 함유하는 25 ㎖의 0.5 % BSA에서 세포를 재현 탁. 세포가 응집하지 않도록합니다. 100 μm의 메쉬 셀 스트레이너를 통해 단일 ​​세포 현탁액을 필터링합니다. 세포는 이제로드 할 준비가되어 있습니다. 튜브를 몇 번 반전로드하기 전에 잘 섞는다. </li></ol> 3. 셀 로딩 및 침전 <ol><li> 반드시 마개가 닫혀 있는지,하지만 액체가 침전 실 (그림 1D)에 셀 챔버 (그림 1A)로부터의 정보 흐름을 허용 할 위치에서 확인합니다. </li><li> 낮은 설정 교반 막대가 지속적으로 이동 할 수 있도록 (약 70 RPM)에 모두 교반 막대 판을 돌려, 그러나 천천히. </li><li> 셀 챔버 (도 1a)에 세포 현탁액을 넣고 세포를 10 ㎖ / 분 (도 1D)의 속도로 침강 챔버 내로 서서히 유동되도록 스톱 콕을 열어. 마개를 닫습니다. 유속은 침강 실에 체적 간격을 표시함으로써 결정될 수있다. </li><li> 셀 챔버에 0.5 % BSA 용액 5 ㎖을 넣고 10 ㎖ / 분의 속도로 침강 챔버로 흘려. 마개를 닫습니다. 이 단계는 세포 챔버로부터 세포를 세척한다. 배를 반복합니다. </li><li> 그라데이션을 준비 셀 챔버 (그림 1A)와 두 개의 2 L 실린더 (그림 1B 및 C)의 클램프를 열고, 40 ㎖ / 분의 속도 (그림 1D)에서 침강 실에 액체를 배출하기 시작 즉시. 그것은 침전 챔버로 BSA 구배를로드하는 데 약 20 ~ 30 분 소요되도록 유량을 조절합니다. 상단에 거짓말 세포의 얇은, 흐트러 층BSA 그라데이션 볼 수 있어야합니다. BSA의 대부분이로드되면, 마개를 닫고 액체가 분별 튜브에 침전 챔버에서 배출 할 수 있도록 위치로 돌립니다. </li><li> 볶음 판을 끕니다. </li><li> 세포가 1 시간 45 분 동안 침전 할 수 있습니다. 이 시간 동안 장치를 방해하지 않습니다. 기계적 교반 그라데이션을 방해 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 분수의 분류 및 분석 다음 단계를 수행 ***, 그라데이션을 방해하지 않도록주의하십시오. BSA 구배 방해가되는 경우, 절차는 작동하지 않을 것이다! <ol><li> 세포가 침전 한 후, 천천히 50 ML 원뿔 튜브에 침전 실에서 50 ㎖를 배출하고 따로 설정합니다. 이 부분은 일반적으로 세포와 파편의 원치 않는 덩어리가 포함되어 있습니다. </li><li> 분수의 집에 분수 튜브를 연결합니다. *** 그것은 손으로 분수를 수집 할 수도 있습니다 경우 분수 콜레ctor에 사용할 수 없습니다. </li><li> 분수를 수집 : 10 ㎖ (한 포집 관을 채우는)가 매 45 초를 수집되도록 꼭지와 유량을 조절합니다. </li><li> 분수 수집 관을 씌우고 4 ℃에서 450 RCF에서 5 분 동안 회전 조심스럽게 뜨는을 붓고 나머지 액체에 세포를 재현 탁하고, 얼음에 세포를 유지. </li><li> 모든 분수가 수집되면, 현미경으로 다른 세포 집단의 분수를 분석 할 수 있습니다. 상이한 세포 유형은 세포의 크기 및 핵 형태학 8,15 기반으로 구별 될 수있다. 2 (a) 체세포와 감수 세포 정조 세포에 대해 충실 세 풀링 된 분획은 &quot;대표 결과&quot;, (b) 라운드 정자 등을 도시하는데,도 (C) 길게과 정자를 응축. <ul><li> 정조 세포 유형은 12-14μm 캘리포니아입니다. 직경 및 염색질 조성 동질 둥근 핵이있다. </li><li> B 형 정조 세포는 8 9μm 캘리포니아입니다. 직경과 둥근 목 한핵 주변을 따라 더 밀도가 이질 염색질을 보여 D 핵. </li><li> 사전 leptotene의 정모 세포는 7.5-8.2μm 캘리포니아입니다. 직경, B 형 정조 세포보다 세포질을 가지고 있고, B 형 정조 세포와 유사한 모양의 핵이있다. </li><li> Leptotene 차 정모 세포는 8 ~ 10 μm의 캘리포니아 있습니다. 직경 및 사전 leptotene의 정모 세포의 것과 유사하지만, 핵 막에 더 조밀 한 염색질을 얻을 것 같다 핵이있다. </li><li> 접합기에 이어지는시기로 차 정모 세포는 10 ~ 12 μm의 캘리포니아 있습니다. 직경 및 leptotene 차 정모 세포의 것과 유사 핵이있다. </li><li> Pachytene의 정모 세포 어디서나 12 ~ 18 μm의 캘리포니아에서입니다. 직경과 큰 핵 주변 세포질의 얇은 테두리로 구성되어 있습니다. 조밀 염색질 이상의 덩어리가 핵에서 볼 수있다. </li><li> 원형 정자는 10 ㎛ 캘리포니아입니다. 직경이 중간에 밀집 염색 chromocenter 라운드 핵이있다. </li><li> 잔여체는 직경이 6.5 μm의 원형이며, 핵이 부족 ~하다. </li><li> 길게 및 응축 정자는 정자를 둥글게 크기가 비슷하지만, 고유, 낫 모양의 핵이있다. </li></ul><ol><li> 분수 15로 시작하는 85까지 매 5 분수를 분석 할 수 있습니다. 보통, 15 이하 분수도 혼합 덩어리 진 것입니다, 그리고 85 위의 분수없이 사용할 수있는 세포에 몇 가지를 포함합니다. </li><li> 분수 수집 관 (세포를 원심 분리 후 재 부유 한 후)에서 액체의 5UL을 가지고 크렙스 버퍼에 8 %의 포름 알데히드의 5UL에 추가 부분을 분석 할 수 있습니다. 고정 된 세포는 실온에서 5 분 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 고정 된 세포에 0.1 % 트리톤과 DAPI (5 μ / ㎖ 크렙스 버퍼)의 5UL를 추가합니다. 세포를 5 분 동안 실온에서 앉을 수있다. </li><li> 슬라이드 상에 생성 된 용액 10 μl를 놓고 커버 슬립으로 덮고, 각 분획의 순도를 결정하기 위하여 형광 현미경으로 분석한다. </li><li> 감수 분열과 체세포 이배체 세포, 둥근 정자, 그리고 길게 / 응축 정자 : 크기와 핵 형태에서 유사 세포의 다음 인구를 만들 수있는 ( &quot;대표 결과&quot;참조) 분수를 결합합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 설명하는이 프로토콜은 실험실 생쥐의 사용을 포함하고 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행되었다. 이 프로토콜에 사용되는 동물은 펜실베니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (IACUC 프로토콜 # 804284)의지도와 승인 아래에 유지됩니다.

신뢰할 수있는 세포 배양 시스템은 아직 모든 정자 형성 세포 유형 3을 생성하는 존재하지 않는 정자를 연구하는 사람들은 정자 형성 세포 샘플에 대한 동물 모델에 의존하고 있습니다. 정자 형성 세포가 쉽게 전체 고환에서 수집되어 있지만, 단지 혼합 인구가 발생합니다. 이는 감수 세포, 둥근 정자 및 응축 정자 등이 세포의 특정 아형을 공부하고자하는 사람들을위한 문제가있다. 세 가지 다른 방법은 현재 정자 형성 세포의 이러한 하위 유형을 구분하는 데 사용되는 : STA-PUT, FACS 및 elutriation 6-13. 각각의 셀 분류기 및 elutriator : 후자의 두 가지 방법은 장비의 비싼 조각에 대한 액세스를 필요로합니다. FACS 방법은 다른 정자 형성 세포 유형의 고순도의 개체군을 산출하더라도, 프로세스 6 시간 걸리고 2-3 고환 (11) 당 셀 분류 당 0.5-2.0 × 106 세포를 수득 하였다. STA-PUT 메타 같은 Elutr...

포유류의 정자는 고환 1의 정 세관에서 여러 단계에서 발생하는 복잡한 분화 과정이다. 간단히, 정액을 운반하는 가느 다란 분할의 상피 세포 근처에있는 정조 세포를 같은 줄기 후 감수 분열을 거쳐 정모 세포로 분화. 감수 분열이 완료되면, 그 결과 반수체 세포, 또는 원형 정자는 spermiogenesis, 세포질과 핵의 압축 흘림을 포함하는 분화 과정을 겪는다. 정자는 점차적으로 각각 편모를 개발하고 핵의 신장 및 응축을 받다, 길게 한 후 응축 정자를 생산. 최종 제품은 정소 세관 및 궁극적으로 더 성숙 부고환으로의 루멘 내로 방출되는 정자이다. 정자의 과정에서 특별한 호르몬 분자 조건에 의존하기 때문에고환은 정자의 전체 프로세스에 대한 신뢰할 수있는 체외 배양 시스템은 아직 2,3를 개발되지 않았습니다. 배양 방법은 줄기 세포에서 &quot;원시 생식 세포 유사 세포&quot;및 반수체, &quot;라운드 spermatid 같은 세포&quot;를 만들기 위해 개발되었지만, 이들 방법은 아직 이러한 세포를 다수 생성하여 저장 정자 형성 세포를 생산하는 데 실패 할 수 없다 유형 4.5. 다행히도, 정자 형성 세포 유형은 액체 구배로 분리 될 전체 정소로부터 얻어진 단일 세포 현탁액을 허용하는 크기가 상당히 다르다. STA-PUT 방법은 여기에 설명, 크기와 질량 6-9에 따라 정자 형성 세포를 분리하기 위해 선형 BSA의 그라데이션과 간단한 침을 사용합니다. FACS 및 elutriation 10-13 : STA-PUT 방법은 정자 형성 세포 유형을 구분하는 다른 두 가지 가장 널리 사용되는 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. STA-PUT 장치는 ONL 필요전문 유리의 Y 여러 조각 추운 방이나 대형 냉장고에 조립. 따라서, 셀 소터 나 elutriator를 사용하는 것보다 덜 비싸다. 각 세포 집단의 순도는 FACS 11로 얻은만큼 높지는 않지만 STA-PUT 방법은, 세포 분류와 비교할 시간 프레임에서 FACS에 의해 분류 될 수있는 것보다 정소 당 세포의 높은 금액을 산출한다. 셀 (자기 활성화 된 셀 정렬, MACS)이 최근 성공적으로 혼합 고환 세포 인구에서 정조 세포의 농축을 위해 사용되어왔다, 그러나 14 마커 적절한 표면의 지식의 부족으로 인해 정모 세포 또는 정자를 분리하는 현재 적합하지 않은 자석 구슬을 이용하여 정렬. FACS 나 MACS 이상의 STA-PUT 방법의 또 다른 장점은 대부분 FACS 프로토콜과 대조적으로, 어떤 DNA 또는 염색 다른 타입을 필요로하지 않기 때문에 이후의 배양에 적합 가능한 세포를 분리 할 수​​있는 능력이다. L을 필요로 연구를위한정자 형성 세포 유형의 아게 수율은 ~ 90 %의 순도, STA-PUT 이상적인 방법입니다.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10857 100MG</td><td>대체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>0.5%, 2% 및 4% BSA 용액</td>은 각각 <td>0.25g, 11g 및 22g을 각각 50ml, 550ml 및 550ml의 1x KREBS의 부피로 용해합니다.</td><td>STA-PUT 절차의 날로 지정됩니다. 필터는 살균합니다.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (10x)</td><td>3.26g KH2PO4 + 139.5g NaCl +5.89g MgSO4/7H20 + 40g 포도당 + 3.78g CaCl2/2H20 + 7.12g KCl, ddH20</td><td>오토클레이브/필터로 2L로 가져오고 4°C에서 보관하십시오. C를 몇 달 동안 사용합니다.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (1x)</td> <td>4.24 g NaHCO3 100 ml ddH20에 용해시킵니다. 200ml 10x 크렙스를 추가합니다. ddH20과 함께 2L로 가져옵니다.</td><td>STA-PUT 절차의 날로 지정됩니다. 필터는 살균합니다.</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소</td><td>Sigma</td><td>C9891-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DNEP-5MG</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T9201-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>연구원</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td> <td>선호연구자</td><td></td><td></td>선호</tr><tr><td>포름알데히드(~37%)</td>연구<td>자</td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr> 선호 <tr><td>표 2: 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td>회사</td><td>카탈로그 #</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>완전한 STA-PUT 장치</td><td>ProScience Glass Shop</td><td>STA-PUT(이 절차는 표준 침전 챔버를 사용합니다. No. 56700-500)에는</td> <td>장치에 필요한 모든 유리 제품 및 장비가 포함됩니다. 더 작은 셀 번호로 STA-PUT을 수행하기 위해 대체 유리 기구를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>10 &뮤; m 메쉬 필터</td><td>Fisherbrand</td><td>22363549</td><td> </td></tr><tr><td>마우스 해부 도구</td><td>연구자</td><td></td><td></td>선호</tr><tr><td>캡이 있는 14ml 둥근 바닥 분획 수집 튜브</td> 연구<td>자</td><td></td><td></td>선호</tr><tr><td>약 100개의 튜브</td><td></td><td></td><td></td>필요</tr><tr><td>분획 분취기</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>모델: Frac-920, 제품 코드: 18-1177-40</td><td>대안을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, 커버 유리</td><td>연구자</td><td></td><td></td>선호</tr><tr><td>광/형광 현미경</td><td>연구자</td><td></td><td></td> 선호</tr></tbody></table>

sta-put 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

포유류의 정자는 고환의 정 세관에서 여러 단계에서 발생하는 복잡한 분화 과정이다. 현재, 체외에서 정자 형성 차별화 있도록 신뢰성있는 세포 배양 시스템은없고, 정자 형성 세포의 대부분의 생물학적 연구는 마우스와 쥐와 같은 동물 모델에서 조직 수확을 필요로합니다. 비 정자 형성 (간질, 세르 톨리, 골수, 상피 세포) 및 정자 형성 모두 (정조 세포, 정모 세포, 둥근 정자, 정자 및 정자를 응축) - - 고환은 많은 종류의 세포가 포함되어 있기 때문에 정자에 관련된 생물학적 메커니즘 연구를 분리해야 이들 상이한 세포 유형의 농축. 이 경우, 고환에서 - - 선형 BSA 그라데이션을 통해 STA-PUT 방법은 세포의 이종 집단의 분리를 허용한다. 개별 세포 유형은 CE에 따라 다른 침강 속도로 침강LL 사이즈, 및 다른 세포 유형의 농축 분획을 수거하고 추가 분석에 이용 될 수있다. STA-PUT 방법은 특정 셀 정렬 방법으로 수득 될 수있는 예를 들어 세포 유형의 고도로 순수한 분획물을 초래하지 않지만, 각 분획의 전체 세포의 더 높은 수율을 제공 않는다 (7 ~ 8 × 10 8 세포의 시작 인구에서 ~ 1 × 108 세포 / 정자 형성 세포 유형). 이 고수익 방법은 전문 유리를 필요로하고 형광 활성화 된 셀 분류기 (FACS) 또는 elutriator 같은 전문 장비에 대한 액세스가 제한 실험실을위한 이상적인 방법하고, 어떤 차가운 방이나 대형 냉장고에 수행 할 수 있습니다.

STA-PUT 절차에서 이상적인 결과는 셀의 크기 및 밀도에 기초하여 세포의 고환에서 상당히 눈에 띄는 박리이다. 정소로부터 격리 세포 BSA 그라데이션을 통해 침전되는 동안, 셀들의 몇몇 뚜렷한 밴드가 관찰 될 수있다. 세포 덩어리는 상관 그라데이션의 바닥에 가라 그리고 다른 분획을 오염되지 경향이있다. 좀 더 그라데이션까지 대형 체세포 및 감수 세포 될 것입니다. 멀리 그라데이션까지 아직도 작은 원형 정자 될 것입니다. 그라데이션의 상단이 정자, 정자, 적혈구 오염을 응축됩니다에서 (이 핵없이 작은 원형 세포로 나타납니다). 분수는 빛과 형광 현미경의 조합 (그림 2) (15)를 사용하여 신속하게 분석 할 수 있습니다. 감수,의 정원, 체세포 이배체 세포는 고환에있는 가장 큰 세포이며, 큰 핵에게 그 얼룩 relati를 포함합니다되었습니다 Vely 균일 DAPI와. 원형 정자는 일반적으로 밝게 염색 chromocenter으...

STA-PUT 방법은 크기와 밀도에 따라 정자 형성 세포의 다른 인구의 분리 할 수​​ 있습니다.

STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

이 프로시저의 전반적인 목표는 고환에서 발견되는 다양한 유형의 세포들을 분리하는 것입니다. 먼저, 마우스로부터 혼합 세포군을 수확하십시오. 고환 세포와 BSA 밀도 구배를 stay put 장치에 로딩하십시오.이제 세포가 BSA 밀도 구배를 통해 침강하도록 둡니다. 그 후 분획물을 수집하고 세포 구성에 따라 이를 결합합니다. 결과적으로, stay put을 이용한 속도 침강법은 크기와 밀도의 차이를 기반으로 고환의 서로 다른 세포 유형을 분리하는 데 사용됩니다.FACTS와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 단순한 유리 기구와 중력을 이용하여 상당히 높은 순도로 다양한 세포 유형을 대량으로 분리할 수 있다는 점입니다. 2 L 실린더 두 개와 세포 로딩 챔버를 상단 플랫폼에 고정하고, 튜브 클램프가 달린 작은 튜브 두 개로 모두 연결합니다. 모든 튜브를 클램프로 잠그고 가장 오른쪽에 있는 2 L 실린더의 배출구를 밀봉합니다.셀 로딩 챔버에 작은 교반바를 넣고, 가장 왼쪽에 있는 2L 실린더에 더 큰 교반바를 넣습니다. 그런 다음 2L 침강 챔버를 플랫폼 위에 올립니다. 분획 수집 중에 액체의 와류가 발생하여 세포 구배가 흐트러지는 것을 방지하기 위해, 금속 배플을 침강 챔버 바닥의 개구부 바로 위에 배치합니다.이제 침전 챔버의 뚜껑을 닫습니다. 3방향 스톱콕(three-way stop cock)의 연마 유리 조인트에 진공 그리스를 아주 소량 도포합니다. 그런 다음 스톱콕과 침전 챔버의 연마 유리 조인트를 연결하여 스톱콕을 침전 챔버 바닥에 클램프로 고정합니다.다음으로, 튜브를 사용하여 세포 로딩 챔버를 스톱콕(stop cock)의 오른쪽 배출구에 연결합니다. 스톱콕을 닫은 후, 세포 분획 튜브를 스톱콕의 왼쪽 배출구에 연결하고 가장 하단의 작은 튜브를 클램프로 고정합니다. 2% BSA 용액을 왼쪽에 있는 2리터 실린더에 붓습니다.오른쪽 2L 실린더에 4% BSA 용액을 붓습니다. 실린더들을 연결하는 튜브 내에 큰 기포가 없는지 확인하십시오. 세포 로딩 챔버에 Krebs 완충액을 붓고, 이 챔버와 침강 챔버를 연결하는 튜브를 채웁니다.기울기를 방해할 수 있는 큰 기포가 없는지 확인하십시오. 필요한 경우, 튜브를 가볍게 짜거나 튕겨 기포를 제거하십시오. 모든 crebs 용액이 셀 챔버가 아닌 튜브 안에 들어 있는지 확인하십시오.소량의 Krebs 완충액이 침전 챔버로 흘러 들어가게 합니다. 그런 다음 완충액의 거의 대부분을 세포 분획 튜브로 배출하십시오. 튜브를 채우고 큰 기포를 제거하려면 분획 수집기를 침전 챔버 바로 아래에 배치하십시오.모든 분획 튜브가 제자리에 있는지 확인하고, 오염을 방지하기 위해 플라스틱 랩으로 덮습니다. 8 mL의 Krebs 용액이 담긴 별도의 플레이트에서 정소를 탈피시킵니다. 핀셋 한 쌍을 사용하여 세정관을 둘러싸고 있는 얇은 막을 절개합니다.이제 다른 핀셋으로 막을 잡습니다. 세뇨관을 막 밖으로 밀어내어 분리합니다. 세뇨관이 포함된 Krebs 용액 4 mL를 콜라게나제 용액 25 mL가 들어 있는 각 원추형 튜브로 옮깁니다.세관이 스파게티와 같은 모양이 될 때까지 33 °C에서 10분 동안 흔들어 줍니다. 다음으로, 세관이 튜브 바닥에 가라앉도록 5분 동안 그대로 둡니다. 상층액을 따라내고 실온에서 25 mL의 Krebs 용액으로 2회 세척하며, 매회 세척 시 세관이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.각 튜브에 Krebs 용액을 약 5 mL 남깁니다. 세뇨관을 trypsin으로 처리하여 배양한 후, 와이드 보어 피펫(wide bore pipette)을 사용하여 세뇨관이 포함된 용액을 교반합니다.피펫팅을 약 10회 반복하여 섞어줍니다. 용액이 단일 세포 현탁액과 유사한 상태가 되기 시작할 것입니다. 이제 각 30 milliliter 단일 세포 현탁액을 100 micron 메쉬 세포 스트레이너로 여과합니다.세포 현탁액을 혼합한 후, 전체 세포 수를 측정합니다. 스톱콕(stop cock)이 세포 챔버에서 침전 챔버로 흐름을 유도하도록 위치해 있는지 확인하십시오. 두 교반 바 플레이트를 모두 낮은 설정으로 돌립니다.그런 다음 세포 현탁액을 세포 챔버에 붓습니다. 스톱콕을 열어 세포가 10 milliliters per minute의 속도로 침강 챔버에 천천히 흐르도록 합니다. 이후 스톱콕을 닫아 세포 챔버에서 세포를 씻어냅니다.0.5% BSA 용액 5 mL를 붓고 분당 10 mL의 속도로 침전 챔버에 배출합니다. 스톱콕을 닫고 BSA 세척 과정을 4회 더 반복합니다. 이제 세포 챔버와 2 L 실린더 두 개 사이의 클램프를 열어 액체를 분당 40 mL의 속도로 침전 챔버에 즉시 배출하며, BSA 구배가 침전 챔버에 로딩되는 데 약 20~30분이 소요되도록 유속을 조절합니다.BSA 구배 위에 세포가 얇고 흐트러짐 없이 층을 이루고 있는지 관찰하십시오. BSA의 대부분이 로딩되면, 스톱 콕을 닫고 액체가 침강 챔버에서 분획 튜브로 배출될 수 있는 위치로 돌리십시오. 이제 교반기를 끄고 세포가 1시간 45분 동안 침강하도록 둡니다.침전이 완료되면 분획 튜브를 분획 수집기에 연결하십시오. 스톱콕을 사용하여 수집 튜브당 10 mL가 45초마다 수집되도록 유속을 조절하십시오. 모든 분획이 수집되면 현미경으로 분획을 분석하여 서로 다른 세포 집단을 확인하십시오.각 분획의 순도를 결정하기 위해 세포 크기와 핵 형태를 기반으로 서로 다른 세포 유형을 구별할 수 있습니다. DPI로 염색된 세포 10 µL를 슬라이드 위에 옮깁니다. 커버 슬립을 덮고 형광 현미경으로 분석합니다.크기와 핵 형태가 유사한 분획들을 추출하여 세포 집단을 생성합니다. 약 22개의 고환을 이용한 일반적인 준비 과정에서, 이 고정 절차를 통해 약 10⁸개의 세포를 얻을 수 있습니다.광학 현미경과 형광 현미경을 조합하여 각 메타제닉 세포 유형 분획을 빠르게 분석할 수 있습니다. 감수 분열 세포, 정원세포 및 체세포 이배체 세포는 고환에서 발견되는 가장 큰 세포들이며, dpi로 염색했을 때 비교적 균일하게 염색되는 큰 핵을 가지고 있습니다. 원형 정세포는 더 작은 크기의 세포로, 일반적으로 밝게 염색되는 염색질 중심을 가진 작은 원형 핵을 가지고 있습니다. 응축 및 신장 중인 정세포는 낫 모양의 핵을 가진 작은 세포들입니다.세포 분획물을 결합한 후, 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 통해 순도를 추가로 결정할 수 있습니다. 감수분열 세포의 일반적인 마커는 Synaptonemal Complex 1 단백질입니다. 응축되는 정세포의 일반적인 마커는 전이 단백질 또는 프로타민입니다.이 기술을 숙달하고 개발 후 적절히 수행한다면 7시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 기술은 정자 형성 분야의 연구자들이 고환의 다양한 세포 유형에서 세포 프로세스를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

마우스 testis에서 높은 정화 가능한 meiotic 분수를 얻는 효과적인 방법은 형광 활성 세포 분류 (외과)와 세련된 세포 분리 프로토콜을 결합하는, 설명되어 있습니다. 이 방법은 DNA의 내용과 개별 meiotic 분수의 핵 밀도의 차이 활용합니다.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

이 비디오는 고환의 구성 요소인 쥐 정세관에서 Sertoli 세포를 분리하는 절차를 보여줍니다. 효소 분해 및 반복 세척은 Sertoli 세포가 용액으로 방출되는 것을 촉진하며, 이는 증식 및 성장을 위해 추가로 배양될 수 있습니다.

Isolation of Immune Regulatory Sertoli Cells from Mouse Seminiferous tubbules (쥐 정액 세뇨관에서 면역 조절 세르톨리 세포(Immune Regulatory Sertoli Cells) 분리

효소 세제를 피 설치류 자료에서 고환 세포 현탁액의 기계적 준비를위한 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 매우 간단하고 빠르고, 재현성 및 흐름 정렬 및 RNA 추출에 적합한 좋은 품질의 세포 현탁액을 렌더링합니다.

고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

유세포 분석을 사용하여 마우스 정자에 대한 정렬 전략을 설명합니다. 정자류는 둥글게(정자형성 단계 1-9), 초기신장(정자형성 단계 10-12), 후기신장(정자형성 단계 13-14) 및 길쭉한 정자류(정자형성 단계 15-16)를 포함하여 4개의 매우 순수한 개체군으로 분류됩니다. DNA 염색, 크기 및 입도는 선택 매개변수로 사용됩니다.

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산

이 연구는 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터 정제 된 배아 세포 집단을 얻는 방법의 표준화를 기술한다. Hoechst-33342 및 propidium iodide로 염색하는 기계적 고환 해리와 남성 생식 생물학의 비교 연구에서 폭넓게 응용할 수있는 FACS 분류법을 결합한 간단한 프로토콜입니다.

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

이 관 스쿼시 기술의 목표는 빠르게 세포 무결성을 유지 하면서 마우스 spermatocytes를 개발의 cytological 기능을 평가 하기 위해입니다. 이 메서드와 spermatogenesis의 모든 단계의 학문에 대 한 수 있습니다 마우스 감수 분열의 연구에 대 한 다른 생화학 및 분자 생물학적 접근 함께 쉽게 구현할 수 있다.

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

이 논문에서 우리 밀도 그라데이션 원심 분리 기술 및 정자 생리학 연구에 응용 프로그램의 성능에 설명 하고자 합니다.

조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 차동 품질의 정자 컬렉션

여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비와 불연속 소 혈청 알부민 밀도 그라데이션을 사용하여 성인 마우스 고환에서 파키틴 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자를 풍부하게하기위한 프로토콜입니다.

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

여기에서는 마우스에서 ROSI(round spermatid injection)를 수행하는 방법, 유망한 임상 응용 기술을 가진 기술이며 배아 발달의 기전을 조사하기 위한 유용성을 소개합니다.

마우스 라운드 Spermatid 주입

배우세요 STA-PUT 속도 침전법을 사용하여 생식세포를 분리하는 방법을. 크기와 밀도 차이를 이용해 정자 형성 세포 유형을 효율적으로 분리하고 정제할 수 있습니다.

STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리

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