STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리
October 9th, 2013
STA-PUT 방법은 크기와 밀도에 따라 정자 형성 세포의 다른 인구의 분리 할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 고환에서 발견되는 다양한 유형의 세포를 분리하는 것입니다. 먼저, 마우스에서 혼합된 세포 집단을 수확합니다. 고환은 세포와 BSA 구배를 스테이 풋 장치에 로드합니다.
이제 세포가 BSA 구배를 통해 침전되도록 합니다. 그런 다음 분획을 수집하고 세포 구성에 따라 결합합니다. 궁극적으로, 스테이 풋(stay put)을 통한 속도 침강(velocity sedimentation)은 크기와 밀도의 차이에 따라 고환에서 다양한 유형의 세포를 분리하는 데 사용됩니다.
사실과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 간단한 유리 제품과 중력을 사용하여 상당히 높은 순도로 많은 양의 다양한 세포 유형을 분리할 수 있다는 것입니다. 2개, 2리터 실린더와 셀 로딩 챔버를 상단 플랫폼에 고정하고 튜브 클램프가 있는 두 개의 작은 튜브 조각으로 모두 연결합니다. 모든 튜브를 닫고 가장 오른쪽에 있는 2리터 실린더에 스파우트를 밀봉합니다.
셀 로딩 챔버에 작은 교반 막대를 놓고 가장 왼쪽의 2리터 실린더에 더 큰 교반 막대를 놓습니다. 그런 다음 2리터 침전실을 플랫폼에 놓습니다. 금속 배플을 침전 챔버 바닥의 개구부 바로 위에 배치하여 분획 분취 중 액체의 와류 및 세포 구배의 중단을 방지합니다.
이제 침전실의 뚜껑을 덮습니다. 3방향 스톱 콕의 접지 유리 조인트에 아주 적은 양의 진공 그리스를 바르십시오. 그런 다음 스톱 콕을 침전 챔버의 바닥에 고정하여 스톱 코크와 침전 챔버의 접지 유리 조인트를 연결합니다.
다음으로, 튜브가 있는 스톱 콕의 오른쪽 출구에 셀 로딩 챔버를 연결합니다. 스톱 콕을 닫은 다음 세포 분별 튜브를 스톱 콕의 왼쪽 배출구에 부착하고 맨 아래에 있는 작은 튜브를 고정합니다. 왼쪽 2리터 실린더에 2%BSA 용액을 붓습니다.
오른쪽 2리터 실린더에 4%BSA 용액을 붓습니다. 이 실린더를 연결하는 튜브에 큰 기포가 없는지 확인하십시오. 크렙스 완충액을 세포 로딩 챔버에 붓고 이 챔버와 침전 챔버를 연결하는 튜브를 채웁니다.
그라데이션을 방해할 수 있는 큰 거품이 없는지 확인합니다. 필요한 경우 튜브를 부드럽게 짜거나 튕겨 기포를 제거합니다. 모든 크립이 세포실이 아닌 튜브 안에 있는지 확인합니다.
소량의 크렙스 완충액이 침전실로 흘러 들어가도록 합니다. 그런 다음 거의 모든 완충액을 세포 분획 튜브로 배출합니다. 튜브를 채우고 큰 기포를 제거하려면 분획 분취기를 침전 챔버 바로 아래에 놓습니다.
모든 분획 튜브가 제자리에 있는지 확인하고 오염을 방지하기 위해 플라스틱 랩으로 덮습니다. 8ml의 크렙스를 포함하는 별도의 플레이트에 고환을 캡슐화 해제합니다. 한 쌍의 집게로 정액세관을 둘러싸고 있는 얇은 막을 절개합니다.
이제 다른 집게로 멤브레인을 잡으십시오. 세뇨관을 막 밖으로 밀어냅니다. 세뇨관을 포함하는 4ml의 크렙을 25ml의 콜라겐분해효소 용액이 들어 있는 각 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
세뇨관이 스파게티처럼 보일 때까지 섭씨 33도에서 10분 동안 흔듭니다. 다음으로, 세뇨관이 튜브 바닥까지 5분 동안 가라앉도록 합니다. 상층액을 붓고 실온에서 25ml의 크렙스로 두 번 세척하여 세뇨관이 매번 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.
각 튜브에 약 5ml의 크렙을 남겨 두십시오. 트립신으로 세뇨관을 배양한 후. 넓은 구멍의 피펫을 사용하여 세뇨관이 포함된 용액을 교반합니다.
약 10회 안팎으로 피펫팅합니다. 용액은 단일 세포 현탁액처럼 보이기 시작해야 합니다. 이제 100미크론 메쉬 셀 스트레이너를 통해 각 30ml 단일 셀 현탁액을 필터링합니다.
세포 현탁액을 결합한 후 총 세포 수를 계산합니다. 스톱 콕이 세포실에서 침강 챔버로 흐름을 유도할 수 있는 위치에 있는지 확인하십시오. 두 교반 막대 플레이트를 모두 낮게 설정합니다.
그런 다음 세포 현탁액을 세포 챔버에 붓습니다. 세포가 분당 10ml의 속도로 침강 챔버로 천천히 흘러 들어갈 수 있도록 스톱 콕을 엽니다. 그런 다음 스톱 콕을 닫아 세포실에서 세포를 씻어냅니다.
0.5%BSA 용액 5ml를 붓고 분당 10ml의 속도로 침전 챔버로 배출합니다. 마개를 닫고 BSA 세척을 4회 더 반복합니다. 이제 셀 챔버와 두 개의 2리터 실린더 사이의 클램프를 열어 분당 40밀리리터의 속도로 액체를 침강 챔버로 즉시 배출하고 BSA 구배를 침강 챔버에 로드하는 데 약 20-30분이 걸리도록 유속을 조정합니다.
BSA 구배의 맨 위에 있는 얇고 방해받지 않는 세포층을 모니터링합니다. 대부분의 BSA가 로드되면 스톱 콕을 닫고 액체가 침전 챔버에서 분별 튜브로 배출될 수 있는 위치로 돌립니다. 이제 교반 플레이트를 끄고 세포가 1시간 45분 동안 침전되도록 합니다.
침전이 완료되면 분획 튜브를 분획 분취기에 부착합니다. 10초마다 수집 튜브당 45밀리리터가 수집되도록 스톱 콕으로 유량을 조정합니다. 모든 분획이 수집되면 서로 다른 세포 집단에 대한 분획을 현미경으로 분석합니다.
세포 크기와 핵 형태에 따라 다양한 세포 유형을 구별하여 각 분획의 순도를 결정할 수 있습니다. 10마이크로리터의 DPI 염색 세포를 슬라이드로 옮깁니다. 커버 슬립을 놓고 형광 현미경으로 분석합니다.
크기와 핵 형태가 비슷한 분획을 당겨 세포 집단을 만듭니다. 약 22개의 고환으로 구성된 일반적인 준비입니다. 이 체류로 put 절차는 약 10개의 8번째 세포를 산출합니다.
Perper metagenic cell type fraction은 광학 현미경과 형광 현미경의 조합을 사용하여 빠르게 분석할 수 있습니다. 근세포(Myotic), 정자세포(spermatogonia) 및 체세포 이배체(somatic diploid) 세포는 고환에서 발견되는 가장 큰 세포이며 dpi로 비교적 균질하게 염색되는 큰 핵을 포함합니다. 둥근 정자는 더 작은 둥근 핵을 가진 더 작은 세포이며, 일반적으로 밝게 염색되는 염색체 중심이 응축되어 있는 길쭉한 정자류는 낫 모양의 핵을 가진 작은 세포입니다.
세포 분획이 결합되면 세포 용해물의 서부 혈액 분석을 통해 순도를 추가로 측정할 수 있습니다. 근세포 세포의 일반적인 마커는 Synap Neal Complex one 단백질입니다. 응축 정자류의 일반적인 마커는 전이 단백질 또는 프로타민입니다.
이 기술은 일단 숙달되면 개발 후 적절하게 수행된다면 7시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 기술은 정자 형성 분야의 연구자들이 고환과 다른 세포 유형에서 세포 과정을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
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개요
STA-PUT 방법은 크기와 밀도에 따라 다른 정자형성 세포군을 분리할 수 있습니다. 이 기술은 추가 분석을 위해 고환에서 특정 세포 유형을 분리하는 데 필수적입니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 생식 생물학
배경
- 정자형성을 이해하는 것은 생식 건강에 매우 중요합니다.
- 고환의 다른 세포 유형은 서로 다른 역할과 특성을 가지고 있습니다.
- 분리 기술은 이러한 세포 유형의 연구를 향상시킵니다.
- STA-PUT 방법은 세포 분리를 위해 크기와 밀도의 차이를 이용합니다.
연구 목적
- 다양한 정자형성 세포군을 분리합니다.
- 고환의 세포 구성에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 정자형성 세포 기능에 대한 추가 연구를 촉진합니다.
사용된 방법
- 생쥐 고환에서 혼합된 세포군을 수확합니다.
- STA-PUT 장치에 세포와 BSA 경사를 로드합니다.
- 세포가 BSA 경사를 통해 침전되도록 합니다.
- 세포 구성에 따라 분획을 수집하고 결합합니다.
주요 결과
- 다른 유형의 정자형성 세포의 성공적인 분리.
- STA-PUT 방법의 효과성 입증.
- 크기와 밀도에 따른 세포군 식별.
- 정자형성에 대한 추가 연구를 위한 잠재적 응용 가능성.
결론
- STA-PUT 방법은 세포 분리를 위한 신뢰할 수 있는 기술입니다.
- 이 방법은 정자형성 세포 다양성에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 미래 연구는 이 연구의 발견을 기반으로 진행될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Efficient separation of spermatogenic cell types is critical for dissecting the molecular mechanisms underlying mammalian spermatogenesis, a process not yet recapitulated in vitro. The STA-PUT velocity sedimentation method enables high-yield, scalable enrichment of distinct testicular cell populations, supporting early discovery and mechanistic de-risking in reproductive biology pipelines. This capability is particularly valuable for R&D teams lacking access to advanced cell sorting infrastructure, facilitating robust target validation and functional studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-type specific pathways in spermatogenesis using enriched populations.
- Supports biological de-risking by isolating functionally distinct germ cell stages for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in target validation by providing sufficient cell numbers for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, enriched cell fractions for quantitative and reproducible assay development.
- Supports assay standardization by enabling consistent isolation of defined cell types across experiments.
- Delivers high-yield outputs suitable for scalable compound screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cell populations for translational biomarker discovery in reproductive biology.
- Enables continuity from early discovery to preclinical validation by supplying primary cells for functional studies.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by allowing precise cell-type attribution of observed effects.
Pipeline & Workflow Integration
The STA-PUT method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, especially where in vitro differentiation systems are lacking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific spermatogenic stages.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell fractions for downstream functional assays.
- Analytics: Enables measurement of cell-type specific markers and outputs via microscopy and immunoblotting.
- Translational Research: Supplies primary cell populations for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, equipment-light solution adaptable across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in reproductive target validation.
- Operational Value: Delivers high-yield, reproducible cell fractions using accessible instrumentation.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by supporting robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of reproductive biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in testis dissection, cell handling, and gradient sedimentation.
- Needs specialized but widely available glassware and cold-room or large refrigerator access.
- Demands cross-team standardization for fraction collection and purity assessment.
- Adaptable to various rodent models but may require optimization for other species.
- Fraction purity is moderate; downstream validation (e.g., microscopy, immunoblotting) is essential.
