Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적

이 절차의 전반적인 목표는 특정 말초 표적에 충돌하는 분산된 세포의 중앙 전운동 네트워크를 발견한 다음 뇌에서 해당 세포 간의 특정 연결을 확인하는 것입니다. 이것은 먼저 역행하여 근육을 통해 말초로 전달되는 트랜스 시냅스 바이러스 벡터로 전운동 회로를 감염시킴으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 광 형광 현미경으로 감염된 세포를 시각화

세 번째 단계는 전운동 회로에서 이전에 확인된 마디를 표적으로 하는 모노 시냅스 추적자를 주입하여 뇌의 특정 연결을 확인하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 트랜스 시냅스 바이러스 추적과 전통적인 모노 시냅스 신경 해부학적 기술의 조합을 통해 분산된 전운동 네트워크의 세포가 어떻게 서로 연결되어 있는지 보여줄 수 있습니다. 전통적인 모노 시냅스 신경 추적과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 분산된 신경 네트워크의 노드를 식별할 수 있고 해당 네트워크의 세포 간의 특정 연결을 마취된 마우스에서 해결할 수 있다는 것입니다.

모발을 다듬고 베타딘과 70% 알코올을 최소 3회 번갈아 가며 스크럽하여 피부를 소독하여 수술 부위를 준비합니다. 이제 목 부위의 피부를 절개하고 관심 있는 근육을 드러냅니다. 예를 들어, 갑상선 후두 근육에 접근하려면 먼저 수의사 본드 조직 접착제로 절단된 근육을 Sterno 설골 근육 씰의 위에 있는 부분을 제거해야 합니다.

그런 다음 10마이크로리터 나노 필 마이크로 주사기 시스템에 갓 해동된 PR RV 용액을 로드합니다. 데드 스페이스(dead space)를 천천히 청소하고 용액이 마이크로 주사기 팁에서 나오는지 확인합니다. 유체를 생물학적 유해 폐기물로 폐기하고 입체 장치에 조심스럽게 장착하십시오.

마이크로 포지셔닝 장치를 사용하여 바늘 끝을 관심 근육에 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 약간의 붓기가 보일 때까지 근육을 천천히 채웁니다. 이제 주사기를 관심 있는 다음 근육(이 경우 측면 크리코아리테노이드)으로 이동하고 반복합니다.

주사 절차는 각 근육에만 구멍을 뚫습니다. 일단 주입 속도는 근육의 크기와 주입하는 양에 따라 달라집니다. 예를 들어, 초당 4나노리터의 속도로 200나노리터를 5회 주사하면 같은 부위에서 1분 간격으로 주사하여 갑상선 근육을 채워야 합니다.

마이크로 주사기를 집어넣은 후 VET BOND 조직 접착제를 사용하여 근막의 파손을 밀봉합니다. 모든 주사가 끝나면 수의사 본드 티슈 접착제를 사용하여 상처를 봉합합니다. 흉골이 누워있을 때까지 동물을 모니터링하십시오.

그런 다음 기관 동물의 필요에 따라 진통제, 음식, 물 및 보살핌을 제공하십시오. 사용 지침. EGFP 발현 및 PRV에 감염된 뉴런을 분석하는 절차는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.

조직 처리는 이 비디오의 뒷부분에서 다루는 것과 매우 유사합니다. 성인 쥐를 마취시켜 눈을 보호하고 머리의 위치를 고정하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 베타딘과 70% 알코올을 번갈아 가며 수술 부위를 준비합니다.

이제 두피를 절개하고 두피를 뇌 위로 집어넣습니다. 관심 영역. 적절한 입체 좌표에서 드릴로 작은 개두술을 수행합니다.

예를 들어, 성체 마우스에서 PRV 추적으로 식별된 후두 연결 운동 피질의 좌표는 bgma에서 측면 1.2mm, 세로 0.2mm입니다. 다음으로, 멸균수에 7.5%의 비오틴화 덱스트란 아민 용액을 준비합니다. 그런 다음 nano jet two 마이크로 피펫 시스템에 계획된 주입을 위한 충분한 BDA 용액을 로드합니다.

데드 스페이스(dead space)를 천천히 청소하고 용액이 마이크로 파이펫 팁에서 나오는지 확인합니다. 마이크로 포지셔닝 장치를 사용하여 마이크로 피펫 팁을 관심 있는 뇌 영역으로 조심스럽게 내리고 BDA 용액을 천천히 주입합니다. 레이블을 지정할 영역의 크기에 따라 속도를 조정합니다.

예를 들어, 4.6 나노 리터를 4 개의 다른 위치에서 12 회 주입해야합니다. 0.2mm 떨어져. Stro는 성인 쥐의 후두 연결 운동 피질을 덮기 위해 애를 씁니다.

최종 주입량은 관심 영역의 크기에 따라 조정해야 합니다. 라벨은 주입 코어에서 뇌 조직을 통해 라벨링된 뉴런의 과정을 따라 확산될 수 있음을 명심하십시오. 멸균 식염수로 개두술을 깨끗하고 적시고 수의사 본드 조직 접착제를 사용하여 두피 상처를 봉합합니다.

흉골이 누워있을 때까지 동물을 모니터링하십시오. 그런 다음 기관 동물의 필요에 따라 진통제, 음식, 물 및 보살핌을 제공하십시오. 사용 지침.

6일 후, 콜레라 독소 소단위 B를 동물의 근육에 주입할 수 있습니다. 그런 다음 3일 안에 분석을 위해 동물을 희생해야 합니다. 저온 유지 장치에서 40 미크론으로 단면을 절단하고 0.1 어금니 PBS에서 부동 단면을 저장하고, PBS에서 0.3 % 과산화수소로 단면을 30 분 동안 흔들림으로 담금질하고 빛으로부터 보호합니다.

PBS에서 한 번 세탁할 때마다 5분 동안 섹션을 세 번 세탁합니다. 그런 다음 실온에서 갓 준비된 A, b, C 용액에서 한 시간 동안 반응시킵니다. 이제 세척 당 10 분 동안 인산염 완충액에서 섹션을 세 번 세척하십시오.

그런 다음 인산염 완충액에서 교반하면서 8분 동안 절편을 현상합니다.DAB, 과산화수소 및 염화니켈을 포함하는 pH 7.4. 세포 내부의 DAB 반응 생성물은 검게 보여야 합니다.

다음으로, Vector Stain Elite Kit의 일반 토끼 세럼으로 0.3% tween 20을 함유한 PBS에서 30분 동안 흔들면서 섹션을 차단합니다. 다음으로, 염소 안티 CTB에 막힌 부분을 실온에서 2시간 동안 진탕하여 배양합니다. 그런 다음 PBS에서 세탁할 때마다 5분 동안 섹션을 세 번 더 세척합니다.

VE 키트의 rabbit antigo 2차 항체를 적용하고 실온에서 1시간 동안 흔들면서 절편을 배양합니다. PBS에서 세척당 5분 동안 절편을 세 번 세척한 다음 실온에서 갓 준비한 A, b, C 용액에서 30분 동안 반응시킵니다. 인산염 완충액에서 10분 동안 절편을 세 번 세척하고 8분 동안 절편을 배양합니다.

개발 용액에서 세포 내부의 DAB 반응 생성물은 갈색으로 나타나야 합니다. 이제 슈퍼 프로스트와 슬라이드의 섹션을 장착하고 등급이 매겨진 알코올 시리즈를 통해 조직을 탈수한 다음 자일렌을 두 번 세척합니다. 그런 다음 파라마운트로 슬라이드를 덮고 이미징을 진행합니다.

EGFP에 대한 염색은 P RV 1 52를 주입한 후 72시간 후에 1차 운동 뉴런에서 약한 신호를 보이기 시작해야 하며, 염색은 90시간 후에 견고해집니다. 후두 운동 뉴런을 수용하는 이 모호한 핵은 P RV 1 52를 7개의 후두 근육 중 2개에 주입한 후 94시간 후에 볼 수 있습니다. 바이러스가 감염된 근육에 신경을 분포시키는 뉴런을 통해 뇌로 들어갔기 때문입니다.

설상핵(hypoglossal nucleus)과 같은 다른 운동 뉴런 풀은 90시간 후에 EGFP를 발현하지 않습니다. EGFP는 2차 세포에서 볼 수 있습니다. 이러한 뇌간 뉴런은 모호한 핵에서 1차 감염 후 염색되었습니다.

주사는 편측성이었고 그 결과 뇌간의 표지 패턴은 동측 핵의 감염을 나타냅니다. 모호하고 고독한 망상 핵 망상 뉴런도 감염되어 EGFP에 대해 강하게 염색되었습니다. 이 inter neuron은 atory motor neuron pools 및 contralateral nucleus를 포함한 다양한 구조를 연결합니다. 모호한.

그러나 원심성 표적은 바이러스가 역행 방향으로만 확산되기 때문에 레이블이 지정되지 않은 상태로 남아 있습니다. PRV의 생존 시간은 제한적이지만, 말초 주사 부위와 반대쪽으로 EGFP를 발현한 운동 피질의 전운동 뉴런에 감염된 3차 및 고차 세포에서 EGFP 염색을 보여줄 수 있습니다. 아마도 후두 근육 조직의 운동 피질 표현을 구성하는 세포 집단만 감염되었을 것입니다.

BDA 표지 축삭돌기는 화살촉으로 표시된 핵 수준에서 모호한 CTB 양성 운동 뉴런과 접촉하며, 갈색에서 볼 수 있는 후두 근육에 주사하여 라벨링된 양성 운동 뉴런과 접촉하며, 축삭돌기는 후두 운동 뉴런의 수상돌기 근처와 후두 운동 뉴런의 소마 근처에서 정맥류와 추정 말단 배턴을 형성합니다. 이러한 정맥류가 시냅스를 나타내는지 여부를 결정하기 위해 전자 현미경 또는 전기 생리학을 사용한 추가 실험이 필요합니다. 후두 연결 운동 피질에 삽입된 BDA의 양측 주입은 BDA가 방향에 특이적이지 않기 때문에 검은색으로 보이며 구심성 및 원심성 연결 모두에 레이블이 지정될 수 있습니다.

예를 들어, 선행성 표지(anterograde label)의 투영장(projection field)과 역행(retrograde)으로 표지된 세포체(cell body)는 모두 시상(thalamus)에서 볼 수 있습니다. 시상 세포는 화살촉으로 식별되고 내부 캡슐은 방향에 따라 레이블이 지정됩니다. 유사 광견병 바이러스 및 DAB로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 살균과 같은 예방 조치가 필요할 수 있음을 잊지 마십시오.

10% 표백제 용액을 사용하여 PRV 또는 DAB와 접촉한 모든 재료. 이 절차를 수행하는 동안 항상 해당 기관의 규정에 따라 생물학적 유해 고체 및 액체 폐기물을 적절하게 처리해야 합니다.