Name: Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: 배우세요 콜레라 독소와 바이오틴 덱스트란 아민을 이용한 transsynaptic 추적법으로 주변 대상을 조절하는 중추 운동전 뉴런 회로를 분석하는 방법입니다. 이 기법은 분산된 신경망의 특정 연결을 식별하여 신경해부학 연구에 활용됩니다.

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우리는 후두 수술 기술을 가르치는, 고베 대학, 일본의 박사 토시오 테라지마 감사와 PRV-Bartha를 공급하는 프린스턴 대학의 박사 린 Enquist. 연구는 에리히 D. 자비스에 NIH 개척자 상 DP1 OD000448와 구스타보 Arriaga에 NSF 대학원 연구 활동 상에 의해 지원되었다. 적절하게 적립 이전의 연구에서 수치 저널의 편집 정책에 따라 PLoS의 하나 오픈 액세스 크리에이티브 커먼즈 라이선스 (CC-BY)에서 사용된다.

참고 : 모든 동물 절차를 검토하고 듀크 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 보관 (僞) 바이러스 <ol><li> 우리는 1 × 109 PFU / m의 역가에 프린스턴 대학에서 박사 린 Enquist의 실험실에서 라이브 바이러스 (PRV152)을 얻었다. 바이러스를 생성하는 2 프로토콜을 발표되었다. </li><li> 적절한 바이오 안전성 조건에서 -80 ° C에서 BSL-2 바이오 안전성 캐비닛과 가게 내부 튜브 당 20 μL에서 바이러스를 나누어지는. </li><li> 바로 주입하기 전에 PRV의 나누어지는을 녹여. </li></ol> 근육에 주사 2. 수술 준비 <ol><li> (100 ㎎ / ㎏ 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진) 케타민 - 자일 라진의 근육 내 주사하여 전신 마취를 유도하고 이소 플루오 란을 사용하여 적절한 마취 평면을 유지한다. </li><li> 안과 연고와 각막을 보호합니다. </li><li> T 준비머리를 트리밍과 교류 Betadine의 스크럽 70 % 알코올 (3 사이클의 최소)로 수술 부위를 소독하여 무균 기술에 따라 그 수술 부위. 수술 영역을 커버하는 멸균 커튼을 사용하십시오. 절차 전반에 걸쳐 무균 기술을 준수해야합니다. </li><li> 피부 절개를 확인하고 관심있는 근육을 알 수있다. 예를 들어, 첫 sternohyoid 근육의 상부 부분을 제거 할 필요가있다 cricothyroid 후두 근육에 액세스한다. </li><li> VetBond 조직 접착제와 어떤 횡단 근육을 밀봉합니다. </li></ol> 근육에 PRV 3. 주입 <ol><li> 34 G 스테인리스 스틸 바늘을 부착, 갓 해동 PRV 용액을 10 μL NanoFil의 마이크로 실린 체제를로드, 조심스럽게 정위 장치에 마운트. </li><li> 천천히 죽은 공간을 취소하고 그 솔루션은 마이크로 실린 팁을 종료 확인합니다. bioharzard 폐기물 등의 유체 폐기하십시오. </li><li> 정위 microp 사용ositioning 장치는주의 깊게 관심의 근육에 마이크로 실린 팁을 배치하고 약간의 붓기가 보일 때까지 천천히 근육을 입력합니다. 근육과 볼륨의 크기에 따라 달라질 분사량이 분사된다. 예를 들어, 4 NL / 초의 속도로 200 NL (1 μL 전체)의 다섯 주사 cricothyroid 근육을 채우기 위해 동일한 부위에 약 1 분 이격되어야한다. 관심 옆 근육 주사기 (여기서는 횡 cricoarytenoid)를 이동 및 주입 절차를 반복한다. 한 번만 각 근육에 구멍. </li><li> 5 분 후에 마이크로 실린 후퇴. </li><li> VetBond 조직 접착제를 사용하여 밴드의 틈을 밀봉합니다. </li><li> 모든 주사가​​ 완료된 후, VetBond 조직 접착제를 사용하여 상처를 닫는다. 지역 institional 동물 사용 지침, 봉합이나 상처 클립에 따라이 사용될 수있다. </li><li> 흉골 드러 누움까지 동물을 모니터하고 진통, 음식, 물을 제공하고, Y가 요구 신경우리의 기관 동물 사용 지침. </li><li> 실험적으로 결정된 생존 시간 후 (이 경우 90 시간이 2 라벨 ND 피질 뉴런을 주문하기 위해), 펜토 바르 비탈 과다에 의해, 동물을 희생하고, 0.1 M PBS에서 4 % 포름 알데히드 이어 0.9 % 염수로 transcardially 관류. </li><li> 제거하고 24 시간 동안 4 % 포름 알데히드의 뇌를 사후 수정. </li><li> 최소 48 시간 동안 30 %의 자당을 함유하는 인산염 버퍼에 뇌를 Cryoprotect. </li></ol> eGFP는 4. 면역 화학적 검출 <ol><li> 슬라이딩 마이크로톰에 40 μm의에서 섹션을 잘라 0.1M PBS에 떠있는 부분을 저장합니다. 장착 섹션을 더럽히는 경우가 더 얇은 섹션, 30 μm의 예를 위해 사용될 수있다. </li><li> 빛으로부터 보호 PBS에서 0.3 % H 2 O 2에서 30 분 동안 섹션을 끄다. </li><li> PBS는 VECTASTAIN 엘리트 키트 정상 염소 혈청 0.3 % 트윈 20을 포함하는 30 분 동안 섹션이 아닌 특정 항원을 차단 (키트를 VE). </li><li실온에서&gt; 품어 토끼에서 3.5 시간 동안 안티 - eGFP는 (1000 1) 섹션을 차단. </li><li> 실온에서 키트를 VE에서 다음 염소 항 - 토끼 이차 항체에 1 시간 동안 그들을 품어, 5 분 동안 섹션에게 PBS에 세 번 씻으십시오. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 키트를 VE에서 ABC 솔루션을 준비합니다. </li><li> 실온에서 키트를 VE에서 다음 ABC 용액에 1 시간 동안 그들을 반응, 5 분 동안 섹션에게 PBS에 세 번 씻으십시오. </li><li> 0.05 % DAB (3, 3&#39;-미노)와 0.015 %의 H 2 O 2를 포함, 10 분 동안 인산 버퍼에 절을 세 번 씻어 인산염 버퍼에 8 분, pH가 7.4에 대한 개발. </li><li> 등급 알코올 일련 마운트 SuperFrost 플러스 슬라이드 섹션 및 이들을 탈수 (70 %, 95 %, 100 %, 5 분마다 100 %). </li><li> 두 크실렌 세척 (5 분마다)를 통해 섹션을 취소하고 Permount 장착 매체와 슬라이드를 coverslip에. </li><li> 이미지 현미경에 장착 된 부분. DAB 반응 생성물 insid전자 세포는 갈색 나타납니다. 디지털화 된 이미지는 미세 공정을 강조 반전 색이 될 수 있습니다. </li></ol> PRV 추적에 의해 발견 된 뇌 영역으로 트레이서 사출 5. 수술 준비 <ol><li> (100 ㎎ / ㎏ 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진) 케타민 - 자일 라진의 근육 내 주사하여 전신 마취를 유도하고 이소 플루오 란을 사용하여 적절한 마취 평면을 유지한다. </li><li> 안과 연고와 각막을 보호합니다. </li><li> 적절한 정위 프레임에 머리를 고정합니다. </li><li> 머리를 트리밍과 교류 Betadine의 스크럽 70 % 알코올 (3 사이클의 최소)로 사이트를 소독하여 무균 기술에 따라 수술 부위를 준비합니다. </li><li> 두피 절개를 확인하고 관심있는 뇌 영역을 통해 피부를 철회. </li><li> 해당 정위 좌표에 작은 개두술을 수행합니다. 예를 들어, PRV는 추적을 식별 laryngeally 연결 운동 피질의 좌표N 성인 마우스는 1.2 mm의 측면과 브레 그마 0.2 mm의 주동이 있습니다. </li></ol> 뇌에 바이오틴 덱스 트란 아민 6. 주입 <ol><li> 멸균 생리 식염수 333 μL에서 BDA의 25 밀리그램 (10,000 MW)을 용해하여 7.5 % 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)를 준비합니다. </li><li> 계획 주사에 대한 충분한 BDA 솔루션 Nanoject II의 마이크로 피펫 시스템을로드합니다. </li><li> 천천히 죽은 공간을 취소하고 그 솔루션은 마이크로 피펫 팁을 종료되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마이크로 위치 정위 장치를 사용하는 것은주의 깊게 관심 뇌 영역에 마이크로 피펫 팁을 낮추고 BDA 천천히 주입. 영역의 크기에 따라 주사 속도가 표시되도록 조정한다. 예를 들어, 4.6 NL의 12 주사 떨어져 0.2 MM (rostro-꼬리 방향) 성인 쥐의 laryngeally 연결 운동 피질을 충당하기 위해 네 개의 다른 위치에있을 제작한다. 최종 주입 부피는 관심 뇌 영역의 크기에 따라 조정되어야레이블이 뇌 조직을 통해 레이블 뉴런의 과정을 따라 확산에 의해 주입 코어에서 확산 할 수 있음을 염두에두고. </li><li> 치과 용 시멘트를 이용하여 개두술을 밀봉하고 VetBond 조직 접착제를 이용하여 두피에 상처를 닫는다. </li><li> 흉골 드러 누움까지 동물을 모니터링하고 진통제, 음식, 물을 제공하고 기관 동물 사용 지침에서 요구하는 신경. </li></ol> 근육 콜레라 독소 B 서브 유닛의 사출 7. <ol><li> 멸균 생리 식염수 100 ㎕에 CTB 1mg을 용해시켜 1 % 콜레라 독소 B 서브 유닛 (CTB)를 준비한다. </li><li> 엿새 동안 뇌에 BDA 주입 한 후, 근육에 PRV 주사에 대해 상술 한 바와 같이, 수술 준비를 수행합니다. </li><li> 34 G 스테인리스 스틸 바늘을 부착, CTB 용액을 10 μL NanoFil의 마이크로 실린 체제를로드, 조심스럽게 정위 장치에 마운트. </li><li> 이전에 해제로 관심의 근육 (들)에 microinjections를 수행PRV에 대한 스 크라이 빙. </li><li> 흉골 드러 누움까지 동물을 모니터링하고 진통제, 음식, 물을 제공하고 기관 동물 사용 지침에서 요구하는 신경. </li><li> 사흘 CTB 주입 후, 펜토 바르 비탈 과다하여 동물을 희생하고, 0.1 M PBS에서 4 % 포름 알데히드 이어 0.9 % 염수로 transcardially 관류. </li><li> 제거하고 24 시간 동안 4 % 포름 알데히드의 뇌를 사후 수정. </li><li> 최소 48 시간 동안 30 %의 자당을 함유하는 인산염 버퍼에 뇌를 Cryoprotect. </li></ol> 같은 섹션에서 BDA와 CTB 8. 검출 <ol><li> 마이크로톰에 40 μm의에서 섹션을 잘라 0.1M PBS에 떠있는 부분을 저장합니다. </li><li> 빛으로부터 보호 PBS에서 0.3 % H 2 O 2에서 30 분 동안 섹션을 끄다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 키트를 VE에서 ABC 솔루션을 준비합니다. </li><li> 다음 실온에서 ABC 용액에 1 시간 동안 그들을 반응, 5 분 동안 PBS에 절을 세 번 씻으십시오. </리&gt; <li> 10 분 동안 인산염 완충액 섹션 세 번 씻고, 0.05 % DAB (3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘), 0.015 %의 H 2 O 2, 및 0.05 %의 염화 니켈을 함유하는 인산염 완충액에서 8 분, pH가 7.4에 대해 개발한다. 세포 내부의 DAB 반응 생성물은 검은 나타납니다. </li><li> VECTASTAIN 엘리트 키트 정상 토끼 혈청 트윈 20 0.3 %를 포함하는 PBS에서 30 분 동안 차단 섹션. </li><li> 실온에서 : 품어 염소에 2 시간 동안 안티 CTB (10,000 1) 섹션을 차단. </li><li> 실온에서 키트를 VE에서 다음 토끼 항 염소 이차 항체에 1 시간 동안 그들을 품어, 5 분 동안 PBS에 절을 세 번 씻으십시오. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 키트를 VE에서 ABC 솔루션을 준비합니다. </li><li> 다음 실온에서 ABC 용액에 30 분 동안 그들을 반응, 5 분 동안 PBS에 절을 세 번 씻으십시오. </li><li> 0.05 % DAB (3, 3을 포함, 10 분 동안 섹션을 인산염 완충액에 세 번 씻어 인산염 버퍼에 최대 8 분, pH가 7.4에 대한 개발&#39;-diaminobenzidine)와 0.015 %의 H 2 O 2. 세포 내부의 DAB 반응 생성물 갈색 나타납니다. </li><li> 등급 알코올 일련 마운트 SuperFrost 플러스 슬라이드 섹션 및 이들을 탈수 (70 %, 95 %, 100 %, 5 분마다 100 %). </li><li> 두 크실렌 세척 (5 분마다)를 통해 섹션을 취소하고 Permount 장착 매체와 슬라이드를 coverslip에. </li><li> 이미지 현미경에 장착 된 부분. </li></ol>

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이해 상충이 선언되지 않았습니다.

PRV152 4,21 이용한 실험을 계획 할 때 고려되어야 문제들이있다. 가장 중요한 것은, (僞) 바이러스는 치명적이다. 앞서 언급 한 바와 같이, 인간을 비롯한 영장류가 감염에 민감하지 않지만 적절한주의가 다른 동물을 보호하기를 기울여야한다. 성인 마우스는 일반적으로 5-7일 감쇠 PRV152 균주 접종 후 생존. 따라서, PRV152 1 주일 이상 생존 시간을 필요로 실험에 적합하지 않습니다. 또한, 감염된 동물은 일반적으로하여 정상적인 동작의 관찰을 필요로하는 실험 PRV152의 유용성을 제한, 생존 기간 동안 질병의 징후를 표시합니다. 또한, PRV152는 세포 독성 면역 반응 (22)을 트리거합니다. 바이러스의 복제 및 전송 시간에 따른 4 titer-하고 있기 때문에, 신경의 패턴 비라의 면역 검출에 의해 밝혀세포는 감염의 단계를 통해 진행으로 L 단백질 또는 eGFP는 리포터 유전자는 생존 기간의 과정을...

Transsynaptic 추적은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중앙 efferents를 분석하는 데 강력한 도구가되고있다. 이 방법은 가장 광범위 특히 약독 화 균주 PRV-Bartha은 1961에서 설명 돼지 병원체 (僞) 바이러스 (PRV)을 이용하여 쥐의 뇌에서 사용되어왔다 (12). 여기서는 특정 근육의 운동 피질 표현을 식별하기위한 프로토콜을 제시 또는 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는) 2 리포터 유전자 발현 (僞) 재조합 바이러스 균주 (PRV152)를 사용하여 근육 그룹. 한 방법은 간 시냅스가 기능 회로 3,4,13 내의 다른 신경 세포를 감염시킬 것을 전염성 자손을 생산 neurotropic 바이러스의 동작을 이용한다. PRV-Bartha과 동종이다 PRV152은 단지 거리에 감염 사이트 3,5 &lt;에서 역행 시냅스 연결의 계층 순서를 통해 시냅스를 교차/ SUP&gt;. 정확하게 감염의 외주 위치를 제어함으로써, 그 운동 뉴런의 특정 서브 세트를 통해 뇌에 바이러스의 침입을 제한 할 수있다. 바이러스 순차적으로 연결된 뉴런의 체인을 감염 같이, eGFP는 뇌 전반에 걸쳐 신호의 결과적인 패턴은 처음에 감염된 세포에 접속되어 신경 네트워크를 해결할 것이다. 신경 추적하는 바이러스를 사용하는 부가적인 이점은 감염된 세포 내에서 리포터 단백질 (이 경우 eGFP는)의 증폭이다. 이 신호 증폭에도 희소 돌기의 검출 감도의 허용 레벨을 제공한다. 예를 들면, 수염을 제어 안면 운동 뉴런에 vibrissa 모터 피질에서 희소 돌기 급속도로 표현 녹색 형광 단백질 (14)을 사용하여 래트에서 발견되었다; 이전의 연구는 리포터 유전자 증폭 11, 15 않고 고전 추적기를 사용하여이 투사를 찾지 못했습니다. 불행하게도많은 바이러스 추적 벡터는, 인용 된 연구에서 사용 된 것과 같은, 다중함으로써 시냅스 회로 추적을위한 이들의 사용을 제한하는, 시냅스 교차하지 않는다. 모터 회로에 참여하는 세포의 네트워크를 식별하기위한 고유 한 장점을 제시하고 있지만, transsynaptic의 분산 특성은 PRV-152 곤란 회로 내의 특정 연결을 해석하게하여 추적. 따라서, 우리는 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)와 콜레라 독소 B 서브 유닛 (CTB)를 사용하여 이중 라벨에 의해 PRV-152을 사용하여 식별 회로 내의 특정 연결을 검증하기위한 간단한 방법을 제시한다. BDA와 CTB의 병용은 신경 6-8,11의 특정 세트 사이의 연결을 추적하는 잘 확립 된 방법입니다. 함께 사용되는 경우, 이들 두 추적자 2 색 DAB (3,3&#39;- 디아 미노) 프로 시저 (16)를 사용하여 동일한 구역으로 시각화 될 수있다. 고 분자량 BDA (BDA10kDa)은이 프로토콜을 선택한 것이 Y 때문에신경 과정 6, 7의 상세한 라벨을 ields. BDA10kDa의 추가 장점은 다음과 같습니다 :이 우선적으로 선행 성 방향 6-8로 운송된다; 이는 이온 삼투압 또는 압입 6-8에 의해 전달 될 ​​수있다; 그것은 단순한 아비딘 - 바이오틴 HRP (ABC) 프로 시저 (17)에 의해 시각화 될 수있다; 그것은 빛 또는 전자 현미경 6,7,18에 의해 촬영 할 수 있습니다. 이 원위 수상 돌기 10,19 포함 세포 과정을 공개 효과적이기 때문에 퍼 옥시 다제 및 DAB와 CTB의 면역 화학적 검출의 motoneurons의 역행 라벨 선택되었다. 우리는 최근 생쥐의 보컬 모터 경로를 확인하고 이전에 20 부재로 가정 된 후두 운동 신경, 1 차 운동 피질에서 스파 스 연결을 나타 내기 위해이 방법을 사용했다.

<table><tbody><tr><td>시약/재료</td><td>회사</td> 이름 <td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>NanoFil microinjection system</td><td>World Precision Instruments</td><td>IO-Kit</td><td>34 G option</td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>슬라이딩 마이크로톰</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane (Forane)</td><td>Baxter&nbsp;</td><td></td><td></td>1001936060</tr><tr><td>Betadine 면봉 스틱</td><td>Cardinal Health</td><td>2130-01</td><td>200 카운트</td></tr><tr><td>Permount 마운팅 매체</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated dextran amines</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10,000 MW</td></tr><tr><td>Pseudorabies virus</td><td>Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td><td>PRV152</td><td>역가 >1 x 107</td></tr><tr><td>Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)</td><td>List Biological Laboratories</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin B Subunit</td><td>List Biological Laboratories</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP</td><td>Open Biosystems</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'-diaminobenzidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>10 mg 정제</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>E7023</td><td>200 증거</td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>F8775</td><td>4%과산화수소로 희석</td></tr> <tr><td></td><td>시그마-알드리치</td><td>H3410</td><td>30%</td></tr><tr><td>케타민 HCl & 자일라진 HCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>K4138</td><td>80 mg/ml & 6 mg/ml</td></tr><tr><td>니켈 클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3619</td><td>1.0 M; pH 7.4</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5493</td><td>10x; pH 7.4</td></tr><tr><td>펜토바르비탈</td><td>나트륨 시그마-알드리치</td><td>P3761</td><td>50 mg/ml 용량</td></tr><tr><td>자당</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>S9378</td><td></td></tr>, <tr><td>트윈 20</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>P1379</td><td></td></tr>, <tr><td>크실렌,</td><td>시그마-알드리치</td><td>, 534056</td><td>조직학적 등급</td></tr>, <tr><td>VECTASTAIN Elite, ABC 키트</td>, <td>Vector Laboratories</td>, <td>PK-6101 (토끼); PK-6105 (염소)</td><td></td></tr><tr><td>옵틱스케어 안과 연고</td><td>Vet Depot</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic 추적은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중앙 efferents를 분석하는 데 강력한 도구가되고있다. 이 접근법은 가장 광범위 돼지 병원체 (僞) 바이러스 (PRV) (1)을 이용하여 뇌에 사용되어왔다. PRV는 인간을 비롯한 영장류를 감염시키지 않으므로 가장 일반적으로 작은 포유류, 특히 설치류 연구에 사용된다. (僞) 균주 PRV152는 증강 된 녹색 형광성 단백질 (EGFP) 리포터 유전자를 발현하고 만 역행 떨어져 감염 부위에서 2,3- 시냅스 연결의 계층 순서를 기능적 시냅스 십자가. 기타 PRV 균주는 별개의 미생물 학적 특성을 가지고 두 방향 (PRV-베커와 PRV-카플란) 4,5에서 전송 될 수있다. 이 프로토콜은 PRV152 독점적으로 다룰 것이다. 근육과 같은 말초 부위에서 바이러스를 제공함으로써, t로 바이러스의 침입을 제한 할 수있다뉴런의 특정한 세트를 통해 그 뇌. eGFP는 뇌 전반에 걸쳐 신호의 결과적인 패턴은 처음에 감염된 세포에 연결된 뉴런을 해결. (僞) 바이러스와 transsynaptic 추적의 분산 특성이 어려운 식별 된 네트워크 내에서 특정 연결을 해석한다, 우리는 사용하여 식별 세포 사이의 연결을 확인하기위한 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)와 콜레라 독소 서브 유닛 B (CTB)를 사용하는 민감하고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다 PRV152. 그들은 말초 돌기 6-11 포함한 세포 과정을 계시하는데 효과적이기 때문에 옥시다아제 및 DAB (3,3&#39;- 디아 미노)와 BDA 및 CTB의 면역 검출을 선택 하였다.

eGFP는 위해 염색하는 것은 근육에 PRV152를 주입 한 후 일차 운동 뉴런에 약 72 시간을 약한 신호를 보여주는 시작해야한다. 복제 및 바이러스의 transsynaptic 교통 titer-과 시간에 따라 4입니다. 약 90 시간 주입 후, eGFP는 염색은 2 차 순서에 감염된 세포에 강력한 신호를 공개합니다. 긴 생존 시간은 3 차 및 고차 세포를 공개하지만 생존 시간은 약 오일 접종 후 PRV의 치사에 의해 제한됩니다. 그림 1a는 PRV152는 후두 운동 신경, 일곱 후두 근육의 두 가지로 PRV152의 주사 후 94 시간 주택 핵 ambiguus에 eGFP는 표현에 감염된 신경을 보여줍니다. 바이러스가 감염된 근육, 같은 설하 핵 다른 phonatory 운동 신경 풀을, 신경을 분포시키다 신경을 통해 뇌에 입력하기 때문에, eGFP는을 표명하지 아니합니다 (그...

Transsynaptic tracing은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중심 원심성을 분석하기 위한 강력한 도구가 되었습니다. 여기에서는 시냅스경이 횡단하는 광견병 바이러스를 활용하여 기능적인 뇌 회로를 식별하고 국소화하는 프로토콜을 제시한 다음, 식별된 뉴런 그룹 간의 회로에서 특정 연결을 검증하기 위한 고전적인 요로 추적 기술을 제시합니다.

Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

본 절차의 전반적인 목표는 특정 말초 표적에 영향을 미치는 분산된 세포들의 중심 전운동 네트워크를 발견하고, 이후 뇌 내에서 해당 세포들 간의 구체적인 연결성을 확인하는 것입니다. 이는 먼저 근육을 통해 말초로 전달되는 시냅스 간 바이러스 벡터를 사용하여 전운동 회로를 역행성 감염시킴으로써 수행됩니다. 본 절차의 두 번째 단계는 광형광 현미경을 통해 감염된 세포들을 시각화하는 것입니다.세 번째 단계는 프리모터 회로에서 이전에 확인된 노드를 표적으로 하는 단일 시냅스 추적자를 주입하여 뇌 내의 특정 연결을 확인하는 것입니다. 궁극적으로, 트랜스 시냅스 바이러스 추적과 전통적인 단일 시냅스 신경 해부학 기법의 조합을 통해 분산된 프리모터 네트워크의 세포들이 서로 어떻게 연결되어 있는지를 보여줄 수 있습니다. 전통적인 단일 시냅스 신경 추적과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 마취된 마우스에서 분산된 신경 네트워크의 노드를 식별하고 해당 네트워크 내 세포 간의 특정 연결을 분석할 수 있다는 점입니다.털을 깎고 Betadine과 70% alcohol로 최소 3회 교차 세척하여 피부를 소독함으로써 수술 부위를 준비합니다. 이제 목 부위의 피부를 절개하여 대상 근육을 노출시킵니다. 예를 들어, 윤상갑상근(cricothyroid laryngeal muscle)에 접근하려면 먼저 그 위에 덮여 있는흉골설골근(Sterno hyoid muscle) 부위를 제거해야 하며, 절단된 근육은 vet bond 조직 접착제로 밀봉합니다.다음으로, 갓 해동한 PR RV 용액을 10 µL nano fill 마이크로 시린지 시스템에 충전합니다. 데드 스페이스(dead space)를 천천히 제거하고 용액이 마이크로 시린지 팁 끝으로 나오는지 확인합니다. 배출된 액체는 생물학적 위험 폐기물로 처리하고, 시린지를 정위 고정 장치에 조심스럽게 장착합니다.마이크로 포지셔닝 장치를 사용하여 바늘 끝을 대상 근육에 조심스럽게 삽입합니다. 그 다음, 약간의 부기가 보일 때까지 근육에 천천히 채웁니다. 이제 주사기를 다음 대상 근육인 측윤상피열근으로 이동하여 이 과정을 반복합니다.주입 절차는 각 근육을 한 번만 천자합니다. 주입 속도는 근육의 크기와 주입할 부피에 따라 달라집니다. 예를 들어, 윤상갑상근을 채우기 위해서는 동일한 부위에 200 nanoliters씩 5회 주입하며, 주입 속도는 4 nanoliters/second로 하고 각 주입 간격은 1분으로 설정해야 합니다.마이크로 시린지를 뺀 후, vet bond 조직 접착제를 사용하여 근막의 파열 부위를 밀봉합니다. 모든 주입이 완료되면, vet bond 조직 접착제를 사용하여 상처 부위를 폐쇄합니다. 동물이 흉곽 복와위(sternal recumbent) 자세를 보일 때까지 관찰하십시오.그 후 기관의 동물 실험 가이드라인에 따라 필요한 진통제, 먹이, 물 및 관리를 제공하십시오. EGFP 발현 및 PRV 감염 뉴런을 분석하는 절차는 텍스트 프로토콜에 상세히 설명되어 있습니다.조직 처리 과정은 이 영상의 후반부에서 다루는 내용과 매우 유사합니다. 먼저 성체 마우스를 마취하고, 눈을 보호하며 머리 위치를 고정합니다. 그 다음, 이전에 설명한 대로 베타딘(Betadine)과 70% alcohol로 교대로 세척하여 수술 부위를 준비합니다.이제 두피를 절개하고 뇌 위로 두피를 견인합니다. 관심 영역입니다. 적절한 정위 좌표에서 드릴을 사용하여 소규모 개두술을 수행합니다.예를 들어, 성인 생쥐에서 PRV 추적으로 확인된 후두 연결 운동 피질의 좌표는 bgma 기준 외측으로 1.2 millimeters, 전방으로 0.2 millimeters입니다. 다음으로, 멸균수에 biotinylated dextran amines 7.5% 용액을 준비합니다. 그런 다음, 계획된 주입에 충분한 양의 BDA 용액을 nano jet two micro pipette 시스템에 채웁니다.데드 스페이스를 천천히 제거하고 마이크로 피펫 팁에서 용액이 배출되는지 확인합니다. 마이크로 포지셔닝 장치를 사용하여 마이크로 피펫 팁을 관심 뇌 영역으로 조심스럽게 내린 후, BDA 용액을 천천히 주입합니다. 표지할 영역의 크기에 따라 주입 속도를 조절하십시오.예를 들어, 성체 마우스의 후두 연결 운동 피질(laryngeal connected motor cortex)을 커버하기 위해 4곳의 서로 다른 위치에 4.6 nanoliters씩 12회 주입해야 합니다. 각 주입 위치는 0.2 millimeters 간격으로 합니다.최종 주입 부피는 관심 영역의 크기에 따라 조정해야 합니다. 표지자가 주입 중심부에서 뇌 조직을 통해 확산되거나 표지된 뉴런의 돌기를 따라 이동할 수 있음을 유의하십시오. 멸균 식염수로 두개골 절개 부위를 깨끗하게 씻어내고, vet bond 조직 접착제를 사용하여 두피 상처를 폐쇄합니다.동물이 흉곽 복와위(sternal recumbent) 상태가 될 때까지 관찰하십시오. 그 후 해당 기관의 동물 실험 가이드라인에 따라 진통제, 먹이, 물 및 필요한 관리를 제공하십시오.6일 후, 콜레라 독소 서브유닛 B를 동물의 근육에 주입할 수 있습니다. 그 후 3일이 지나면, 분석을 위해 동물을 희생시켜야 합니다. 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 40 micron 두께로 절편을 제작하고, 부유 절편을 0.1 molar PBS에 보관하십시오. PBS 내 0.3% hydrogen peroxide로 절편을 30분 동안 흔들어주며 빛을 차단한 상태에서 퀀칭(quench)하십시오.절편을 PBS로 5분씩 3회 세척합니다. 그 후 실온에서 갓 제조한 A b, C 용액으로 1시간 동안 반응시킵니다. 이제 인산 완충액(phosphate buffer)으로 10분씩 3회 세척합니다.그 다음, DAB, 과산화수소 및 염화니켈이 포함된 pH 7.4 인산염 완충액에서 8분 동안 교반하며 발색시킵니다. 세포 내부의 DAB 반응 생성물은 검은색으로 나타나야 합니다.다음으로, Vector Stain Elite 키트의 일반 토끼 혈청과 0.3% tween 20이 포함된 PBS에서 30분 동안 흔들어주며 절편을 블로킹합니다. 그 후, 블로킹된 절편을 goat anti CTB와 함께 실온에서 2시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 그런 다음, PBS에서 5분씩 세 차례 더 절편을 세척합니다.VE 키트의 토끼 항-G 이차 항체를 처리하고, 상온에서 흔들어주며 1시간 동안 절편을 배양합니다. PBS로 5분씩 3회 세척한 후, 새로 조제한 A, b, C 용액에서 상온으로 30분 동안 반응시킵니다. 인산 완충액으로 10분씩 3회 세척하고, 절편을 8분 동안 배양합니다.현상액 내에서 세포 안의 DAB 반응 생성물은 갈색으로 나타나야 합니다. 이제 절편을 super frosts plus 슬라이드 글라스에 부착하고, 단계별 알코올 계열로 조직을 탈수시킨 후 자일렌으로 두 번 투명화 세척을 수행합니다. 그런 다음 파라마운트로 커버슬립을 덮고 이미징을 진행합니다.EGFP 염색은 P RV 1 52 주입 72시간 후부터 일차 운동 신경세포에서 약한 신호를 보이기 시작하며, 90시간 후에는 염색이 뚜렷해집니다. 후두 운동 신경세포가 위치한 이 ambiguous nucleus는 7개의 후두근 중 2개에 P RV 1 52를 주입하고 94시간 후에 관찰됩니다. 이는 바이러스가 감염된 근육을 지배하는 신경세포를 통해 뇌로 진입했기 때문입니다.설하핵과 같은 다른 운동 신경원 풀에서는 90시간 후에 EGFP가 발현되지 않습니다. EGFP는 2차 세포에서 관찰될 수 있습니다. 이러한 뇌간 신경원들은 ambiguous nucleus의 1차 감염 이후에 염색되었습니다.주사는 일측성으로 이루어졌으며, 뇌줄기에서 나타난 표지 패턴은 동측 핵의 감염을 보여줍니다. 모호핵과 고독핵의 망상 신경세포 간뉴런 또한 감염되었으며 EGFP에 강하게 염색되었습니다. 이러한 간뉴런은 운동 신경세포 풀과 반대측 모호핵을 포함한 다양한 구조물들을 연결합니다.하지만 바이러스가 역행 방향으로만 확산되기 때문에 이들의 원심성 표적은 표지되지 않은 상태로 남습니다. PRV를 이용한 생존 시간은 제한적이지만, 운동 피질의 전운동 뉴런을 감염시킨 3차 및 그 이상의 고차 세포에서 EGFP 염색을 확인할 수 있으며, 말초 주입 부위의 반대측에서 EGFP가 발현되었습니다. 아마도 후두 근육의 운동 피질 표상을 구성하는 세포 집단만이 감염되었을 것으로 추정됩니다.화살표로 표시된 ambiguous nucleus 수준의 BDA 표지 축삭들이 갈색으로 보이는 후두근 주입을 통해 역행성 표지된 CTB 양성 운동 뉴런들과 접촉하고 있으며, 이 축삭들은 후두 운동 뉴런의 수지상 돌기 및 세포체 근처에서 정맥류(varicosities)와 추정 터미널 바톤(terminal batons)을 형성합니다. 이러한 정맥류가 시냅스를 나타내는지 확인하기 위해서는 전자 현미경이나 전기 생리학을 이용한 추가 실험이 필요합니다. 후두 연결 운동 피질에 양측 주입된 BDA는 검은색으로 나타나며, BDA는 방향 특이적이지 않으므로 구심성 및 원심성 연결이 모두 표지될 수 있습니다.예를 들어, 시상에서 순방향 표지 투사 영역과 역방향으로 표지된 세포체가 모두 관찰됩니다. 시상 세포는 화살표 머리로 표시하였으며, 방향 확인을 위해 내포를 표지하였습니다. 가성 광견병 바이러스와 DAB를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로 멸균과 같은 예방 조치를 반드시 준수하십시오.PRV 또는 DAB와 접촉한 모든 재료는 10% 표백액으로 소독하십시오. 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 소속 기관의 규정에 따라 생물학적 위험 고체 및 액체 폐기물을 적절하게 처리해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

synaptically 연결 뉴런을 추적하는 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 관심의 세포 인구가 유전자 정의 셀 유형에서 시냅스 입력을 받고 있는지 여부를 조사하기 위해 상류 세포의 TVA의 특이성을 사용합니다.

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

이진 유전 전략을 활용하여 Cre 매개 재조합 후 상보적 시냅스 경진 추적자를 발현하는 마우스의 신경 회로 추적을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 세포 특이적 추적자 생산은 유전적으로 암호화되기 때문에 당사의 실험적 접근 방식은 단일 세포 해상도에서 쥐 배아 뇌 발달 중 신경 회로의 형성 및 성숙을 연구하는 데 적합합니다.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

우리는 체외 준비를 사용하여 뇌의 핵에 선행 성 또는 역행 추적 주사를 통해 신경 세포와 그 프로세스 레이블을하는 기술에 대해 설명합니다. 우리는 내가 N 표시 정확도를 높이기 위해 유리의 형광 표지 된 마우스 돌연변이 및 기본 광학 기기를 복용하여 추적 전기를 체외의 기존 방법을 수정했습니다.

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

이 프로토콜은 수정 된 광견병 바이러스가 형광 마커를 표현, 독립, 편견 클러스터가 서로 다른 신경 세포의 서브 클래스 간의 형태 학적 통계의 종합적인 특성을 사용하는 것이 분석과 역 행성 감염 다음 레이블이 선택적 신경 인구의 대규모 복원에 대해 설명합니다.

형태 학적 지표를 바탕으로 대규모 재건과 독립, 편견 클러스터링은 선택적 인구에서 뉴런을 분류하기

여기, 선물이 효과적으로 상호 신경 통로 통해 방법 얼룩이 지기 형광으로 biotinylated dextran 아민 (BDA)를 공개 하는 세련 된 프로토콜. 그것은 미세 구조 분석 적합 BDA 라벨 및 다른 신경 요소 confocal 레이저 스캐닝 현미경 아래에서 구별의.

높은 분자량 Biotinylated Dextran 아민 Thalamocortical 프로젝션 쥐에 추적에 대 한 응용 프로그램 향상

우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

현재 프로토콜은 해마에 복부 테진 영역 (VTA) 글루타민트 프로젝션을 추적하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 VTA 글루타민단 단자가 생체 내에서 CA1 퍼티티 피라미드 발사 속도를 조절하는 방법을 보여주기 위해 CA1 레코딩과 결합되었습니다.

해마의 생체 내 해부학 및 기능적 추적

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

트랜스제닉 형광 마우스를 사용하여, 살아있는 동물에서 무손상 좌골 신경의 운동 및 감각 축삭 내 엔도솜 및 미토콘드리아의 신호전달의 생체내 축삭 수송을 평가하기 위해 상세한 프로토콜이 기술된다.

축삭 수송의 생체 내 이미징을위한 툴킷 확장

연속 이광자 단층촬영(STPT) 이미징은 이광자 이미징과 자동 스테이지 제어 및 마이크로톰 슬라이싱을 결합하여 조직 덩어리를 3차원 형태로 이미징하는 기술입니다. 여기에서는 마모셋 뇌가 구조적 특징을 더 잘 이해할 수 있도록 이를 구현하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

신경 해부학적 분석을 위한 전체 마모셋 뇌의 연속 이광자 단층촬영(Serial Two-Photon Tomography of the whole Marmoset Brain)

배우세요 콜레라 독소와 바이오틴 덱스트란 아민을 이용한 transsynaptic 추적법으로 주변 대상을 조절하는 중추 운동전 뉴런 회로를 분석하는 방법입니다. 이 기법은 분산된 신경망의 특정 연결을 식별하여 신경해부학 연구에 활용됩니다.

Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적

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