Name: 대규모 SNP 유전자형 응용 프로그램에 대한 Infinium 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: 배우세요 Illumina Infinium 분석을 활용한 대규모 SNP 유전자형 분석 방법입니다. DNA 증폭, 하이브리드화, 스캐닝 단계를 통해 수백 개의 샘플을 3일 내에 신뢰성 있게 분석할 수 있습니다.

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대형 유전자형 어플리케이션은 더 많은 인간 질병의 기초 유전 메커니즘을 이해하기 위해 사용되어왔다. 게놈 넓은 협회 분석을 통해 의미있는 변형의 발견은 추가 연구를 위해 후보 지역에 플래그를 할 수 있습니다. 또, 유전자형 데이터 시퀀싱 프로젝트의 품질 관리를위한 좋은 도구이다. 시료 처리량을 극대화하기 위해, 여러 개의 샘플 플레이트 증폭 단편적인, 재 부유 상태로 저장 될 수있다. 여덟 판은 여러 일괄 처리를위한 프로토콜의 첫 번째 24 시간을 결합하고 칩의 처리 ~ 2-8일에 대한 충분한 자료를 제공하고, 하루에 증폭 될 수있다. 증폭 된 플레이트를 미리 비축하고, 새로운 샘플을 스캐닝이 이전 실행에서 시작 직후 칩에 혼성화되는 경우, 처리는 추가적인 샘플 준비 동안 정지 할 필요없이 연속적으로 실행할 수있는 경우. 따라서, 비록 샘플 전체를 받아야하는 3 일 정도 걸릴 것입니다분석 데이터는 매일 발생 될 수있다. Assuming24 칩이 매일 처리되고, 5 일 근무제는 12 샘플 비드 칩에서 실행되는 1,000 이상 DNA 샘플 수 있습니다. 모든 단계 또는 시약이 실패하면 어떤 보정을 적용 할 수 있습니다 전에 그러나, 여러 일괄 처리 성능 저하에 대한 위험이있을 수 있습니다. 배열 스캔하거나 분석 할 때까지 오류 통지를 벗어날 수도, 처리량이 최대화되어있는 경우 따라서, 프로토콜의 다양한 단계에있는 수백 개의 샘플이 이미 발견시 같은 결함이 치료를 받고 있습니다. 분실 된 시약 및 데이터가 복구 될 수 없으므로, 사용자는 가속 플로에 대한 필요성에 대해 이러한 위험을 계량한다. GenomeStudio 분석 소프트웨어 진정 유전자형 프로세스의 성공을 측정하는 제 기회이다. 규범 세타 강도 플롯 대 규격-R이 제대로 클러스터 된 경우이 값이 SLI 다르지만, 샘플의 평균 통화 비율 (전체의 SNP %가 성공적으로 입력), 99 %를 접근해야ghtly 배열 유형에 따라 다릅니다. 85-90%보다 낮은 전화 요금과 함께 모든 샘플의 데이터는 신뢰할 수없는 폐기해야합니다. 품질 관리 목적으로, 결과는 가능한 이전에 공지 된 유전자형마다에 비교되어야한다. 이러한 데이터가 존재하지 않는 경우는, 의도적 샘플 중복 판 또는 배열 게재 위치를 확인하는 유용한 도구입니다. 이러한 중복 쌍은 별도의 칩, 접시, 배치, 또는 프로젝트에 배치해야합니다, 그들의 유전자형 세대에 확인. 특정 QC 제약 연구자의 취향에 따라 다양하지만, 일반적인 SNP 제약은 샘플 호출 성공, 하디 - 와인버그 평형, 또는 케이스 및 컨트롤 사이 missingness을 기반으로하는 일반적인 샘플 제약은 전화 요금, 멘델의 불일치, 또는 상호 참조를 기반으로하면서 임상 성 데이터에 대한 X-염색체의 이형 접합의 [13]. 어떤 문제가 발생하면, 분석 제품군에있는 컨트롤 대시 보드는에 제출 될 수있다원인을 확인하기 위해 회사. 이러한 컨트롤은 종종 확률이 높은 단계 또는 시약 실패 문제를 좁힐 수 있습니다. 그 중 하나의 SNP가 Infinium의 유전자형 실험을 통해 발견하는 경우, 자신의 강도 플롯 재확인 추가 연구가 수행되기 전에 클러스터링 오류 GenomeStudio에 있어야합니다. 실패 Infinium의 유전자형 실험으로 인해 인간의 처리 오류 또는 품질이 낮은 입력 DNA 가능성이있다. 샘플 정량화 정확하고 정확해야합니다. 최상의 결과를 위해, 모든 시약은 시료에 추가 또는 칩은 프로토콜에 의해 볼륨 세트에 분배해야합니다. 피펫은 올바르게 조정해야합니다. 시약 만료 후 실행할 수 없습니다 한 번 해동 다시 냉동하지 말아야 RA1 시약 저장. 가능한 염색 및 확장 오류를 최소화하기 위하여, 포름 아미드 / EDTA 혼합물을 매월 신선한 준비되어야한다. 모두 -20 ° C 시약은 수동 제상 냉동고에 보관해야합니다. 명세서에 사용 된 모든 실험기구aining, 프로토콜의 확장 및 세척 부분은 즉시 폐기에 물과 중성 세제로 깨끗이 세척해야한다. HYB 실 가습 저수지 테스트 튜브 브러시와 중성 세제로 세정해야한다. 일주일에 한 번, 자신의 사용 설명서의 지시에 따라 유리 슬라이드는 10 % 표백제로 세척해야한다.

단일 염기 다형성 (SNP를)를 입력하면 질환과 관련된 위험 변종을 식별하는 중요한 방법입니다. 역사적으로, 유전자형 실험의 범위는 가능한 기술에 의해 제한되었습니다. 겔 전기 영동 기반 유전자형 방법은 샘플 및 SNP 처리량으로 제한된다 [1]. 이러한 분석을 개발하는 것은 종종 최적화를위한 변형 주변 지역의 구성과 구조에 의존하는 노동 집약적 일 수있다 [1]. 생명 기술에 의해 개발의 TaqMan 유전자형 분석은, 신속하고 최소 기술자 개입 많은 샘플을 실행할 수있다 [2]하지만 SNP 멀티플렉싱 제한 일당 아니라 아래 백만 [3,4에 유전자형의 총 수를 제한하는 것을 계속 ]. 미만 백 SNP를 함께 다중화 될 수 Sequenom의 IPLEX 플랫폼은 또한, 한 번에 많은 샘플을 실행할 수 있지만, 처리량이 전체의 비교적 낮은 [5]. 베크만 쿨터의 SNP 스트림 기술이론적으로는 하루에 3 백만 유전자형을 생성 할 수 있지만, 반응 당 마흔 여덟의 SNP 최대이 기술의 한계 프로젝트 범위 [4,6]. GoldenGate는 분석은 샘플 당 SNP를 수백 또는 수천에 매일 거의 이백 DNA 샘플을 처리 할 수 있지만 한 번 [4,7에서 삼천의 SNP를 입력 할 때, 유전자형 당 가격은 고급, 매우 높은 처리량 기술과 경쟁하지 않습니다 ]. 하루 수백만 유전자형을 처리하기 위해 대규모 게놈 - 와이드 관련 연구에 필요한 치수는 어레이 혼성화 분석법은 시장에서 가장 비용 효율적인 옵션이되었다. 하이브리드 어레이의 어피 메트릭스의 라인과 Infinium 기반 배열의 Illumina의 라인은 샘플의 잠재적으로 수백 개의 병렬 [4,8]에서 SNP를 수천 또는 수백만의 수백에 입력 할 수 있습니다. 이들의 SNP는 전 등 관심 지역에서 지역화, 전체 게놈에 분산 될 수있다OMES, 또는 사용자의 취향에 맞게 사용자 정의. 이러한 배열은 정확하게 한 번에 샘플 당 만의 SNP 유전자형 할뿐만 아니라, 잠재적으로 발표 염색체 이상을 카피 수 변화를 측정 할 수있는 단지의 혜택이있다. Infinium 정렬 OMNI BeadChip 배열은 현재 하루에 약 백 개의 샘플에, 50 만 사용자 지정 궤적 등의 샘플 당 약 오백 만 마커까지 유전자형하는 기능이 있습니다. 대부분의 질환은 유전 적 요소를 가지고, 이러한 대규모 실험 질환과 관련된 유전자를 찾는 데 중요 할 수있다. 높은 처리량의 유전자형이 샘플의 효율적인 유전자형의 생성을 허용하는 것은 설득력 낮은 작은 대립 유전자 주파수에서 유전 연결을 감지하기에 충분히 큰 설정합니다. 전체 게놈 유전자형 프로젝트는 통계적으로 유의 한 환자 - 대조군의 대립 유전자 빈도 나 카피 수의 차이와 지역의 위치를 찾을 수 있습니다 [9,10,11]. 국가 인간 창에 따르면놈 연구소, 게놈 넓은 협회 연구는 P-1보다 작은 값 × 10 -5으로 8,283의 SNP의 발견에 따른 2008 년 11 월 25 일 및 2013년 1월 25일 사이에 1,490 별도의 서적을 주도 (http://를 참조 높이에서 게놈 전체 분석에 의해 제공 폭 넓은 접근 방식의 혜택 고환암에 이르기까지 조건을 연구 www.genome.gov/gwastudies/). 이러한 연구. 입력의 범위가 너무 제한적이었다 이러한 경우, 그 전체 지역 통지를 탈출 할 수 있습니다. 대규모 협회 분석에 따라서,, 게놈 전체의 유전자형 기술 선택의 기술입니다. Infinium 분석의 다양한 버전은 각각 특정 유형의 어레이로 사용하는 것을 목적으로 존재한다. 또는 24 샘플 어레이 칩 - 아래 깊이에서 논의 In​​finiumUltra 분석은, 많은 12에 적합합니다. 이들은 종종 DNA 샘플 당 십만 이상의 SNP를 유전자형과 t에 초점을이러한 엑솜 또는 사용자 정의 패널에 같은 argeted 지역. 다른 분석 버전은 전체 게놈 유전자형 배열과 같은 다른 칩 유형, 필요할 수 있습니다. 모든 Infinium 분석법은 공통 기준을 공유하고 주로 만 시약 이름, 시약 볼륨 또는 실 염색 시약 절차에 의해 다를 그러나 번 분석 버전에 완전히 기술들은 보편적으로 적용될 수있다. 이러한 메틸화 배열과 같은 다른 배열은 물론, 거의 - 동일한 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 케어 칩 유형 사용에 필요한 분석의 버전을 사용하는 경우에만주의해야한다. 이러한 유전자 발현 수준을 측정하는 것과 같은 일부 유형은, nonInfinium 프로토콜의 사용을 요구할 수있다. 샘플은 일괄 적으로 처리해야합니다. 예를 들어, InfiniumUltra 분석법으로, 예비 혼성화 시약 튜브는 96 샘플을 실행하기에 충분한 양을 포함하고, 튜브는 다시 냉동 될 수 없다. 따라서, 샘플은 한 번에 96 샘플의 일괄 처리로 실행해야합니다. 샘플은 전나무에 증폭 될 것이다T 날. benchwork 약 1 시간 후, 샘플 20 ~ 24 시간 동안 대류 오븐에서 가열되어야한다. 다음 날, 거의 4 시간이 침전하고, 샘플을 나중에 사용하기 위해 냉동 또는 칩에 하이브리드 될 수 있습니다 어느 시점에서 샘플을 재현 탁, 단편화를 소비한다. 칩을 넣기 샘플이 16 ~ 24 시간 동안 밤새 하이브리드 될 후, 약 2 시간 소요됩니다. 셋째 날, 염색 및 확장 단계 ~ 4 시간이 걸립니다. 추가 시간은 세척, 코팅, 그리고 칩을 건조 소요됩니다. 마지막으로, 배열은 사용 유형에 따라 15 ~ 60 분 / 칩에서 걸릴 수있는, 스캔됩니다. 표준 실험실의 안전과 청결주의 사항이 적용됩니다. 증폭 PCR 기반은 아니지만, 사전 및 postamplification 절차에 대해 별도의 워크 스테이션은 오염의 가능성을 최소화하기 위해 필요합니다. 사용중인 모든 장비 제공 시약의 식별 번호는 추적 시트에 로그온해야합니다. Reage국세청은 분배하기 전에 여러 번 사용하기 직전에 해동 반전해야한다. 입력되는 DNA는 표준 방법에 의해 단리 및 형광 분석기로 정량 고품질 게놈 DNA (280분의 260 1.6-2.0의 흡광도 비, 3.0 이하의 230분의 260 흡광도 비)이어야한다. DNA의 분해는 종종 낮은 품질의 분석 결과에 기여하는 요인이다. 이 금액은 어떤 칩 종류에 따라 다를 수 있지만 일반적으로 DNA 200 NG가 필요합니다. 테칸 액체 핸들링 로봇은 프로토콜의 여러 단계를 자동화하고 요인으로 인간의 오류를 최소화 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>소모품 또는 장비</td><td>제조업체</td><td>부품 번호</td><td>96개 샘플에 최소 필요</td></tr><tr><td>0.8 ml 딥 웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0765</td><td>1</td></tr><tr><td>플레이트 매트</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0674</td><td>2</td></tr><tr><td>시약 분지</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>9</td></tr><tr><td>열 밀봉 시트</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0559</td><td>1</td></tr><tr><td>플로우 스페이서</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9563984</td><td>6</td></tr><tr><td>피펫 팁 - 200 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>192</td></tr><tr><td>피펫 팁 - 10 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>16</td></tr><tr><td>피펫 팁 - 1,000 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td>16</td></tr><tr><td>DNA 현탁액 버퍼</td><td>Teknova</td><td>T0220</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>0.1 N NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12419-0010</td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>이소프로판올 (HPLC 등급)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>에탄올 (200-proof)</td><td>시그마-알드리치</td><td>459836</td><td>330 ml</td></tr><tr><td>포름아미드 (100%)</td><td>Thomas Scientific</td><td>C001K38</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>Amresco</td><td>E177</td><td>0.2 ml</td></tr><tr><td>10 &mu; l 8채널 피펫</td><td>Rainin</td><td>L8-10XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>200 &mu; l 8채널 피펫</td><td>Rainin</td><td>L8-200XLS</td><td>2</td></tr><tr><td>1,000 &mu; l 단일 채널 피펫</td><td>Rainin</td><td>L-1000XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>VWR</td><td>13500-890</td><td>1</td></tr><tr><td>냉장 마이크로플레이트 원심분리기</td><td>VWR</td><td>BK369434</td><td>1</td></tr><tr><td>혼성화 오븐</td><td>Illumina</td><td>SE-901-1001</td><td>1</td></tr><tr><td>Hybex 마이크로샘플 인큐베이터</td><td>SciGene</td><td>1057-30-0</td><td>1</td></tr><tr><td>Hybex MIDI 히트 블록 인서트</td><td>Illumina</td><td>BD-60-601</td><td>1</td></tr><tr><td>히트 실러</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0384</td><td>1</td></tr><tr><td>Hyb 챔버(인서트 및 매트 포함</td>) <td>Illumina</td><td>BD-60-402</td><td>2</td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-20</td><td>1</td></tr><tr><td>플로우 스루 어셈블리 부품</td><td>Illumina</td><td>WG-10-202</td><td>8</td></tr><tr><td>세척대 및 식기</td><td>Illumina</td><td>BD-60-450</td><td>1</td></tr> 개<tr><td>Genepaint 챔버 랙</td><td>Tecan</td><td>760-800</td><td>1</td></tr><tr><td>온도 프로브</td><td>Illumina</td><td>A1-99-109</td><td>1</td></tr><tr><td>염색 랙 및 접시</td><td>Illumina</td><td>WG-10-207</td><td>1</td></tr><tr><td>자동 폐쇄 핀셋</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>5374-NM</td><td>1</td></tr><tr><td>진공 매니폴드</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>2240</td><td>1</td></tr><tr><td>iScan 또는 HiScan</td><td>Illumina</td><td>- </td><td>1</td></tr></tbody></table> 개

대규모 snp 유전자형 응용 프로그램에 대한 infinium 분석

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

인간 게놈의 유전자형 변형 표현형과 유전 연결을 식별하는 효과적인 방법으로 입증되었습니다. 가족이나 집단 내의 변형의 분포는 질병의 유전 적 요인의 식별을 용이하게 할 수있다. 유전자형 BeadChips의 Illumina의의 패널 조사는 수천 또는 단일 염기 다형성의 수백만 (SNP를을) 유전자형하거나 DNA 샘플의 큰 숫자에서 같은 사본 수와 같은 다른 게놈 변이를 분석 할 수 있습니다. 이 SNP를 게놈으로 확산 될 가능성 발견을 극대화하기 위해 특정 지역에 타겟팅 할 수 있습니다. Infinium 분석 신속 고품질, 정확한 결과를 얻을 수 있도록 최적화되었다. 올바른 설정으로, 하나의 기술자가 배열의 종류에 따라, 주 수천에 DNA 샘플을 몇 백에서 처리 할 수​​ 있습니다. 이 분석은 게놈 DNA로 시작하고 배열의 스캔으로 끝나는, 모든 단계를 통해 사용자를 안내합니다. 타당성 reage 사용국세청은, 샘플을 증폭, 조각, 침전 재현 탁, 스테인드 단일 기본, 연장 칩에 하이브리드 및 이스 칸 또는 하이 스캔 고해상도 광학 이미징 시스템 중 하나에서 검색합니다. 한 하룻밤 단계는 DNA를 증폭하는 데 필요합니다. DNA 변성과 등온 전체 게놈 증폭에 의해 증폭되고, 따라서, PCR이 필요하지 않습니다. 샘플은 두 번째 밤새 단계에서 배열에 하이브리드된다. 셋째 날에 의해, 샘플을 스캔하고 분석 할 준비가 된 것입니다. 증폭 된 DNA는 비드 배열함으로써 처리량을 최대화 모든 요일을 처리 할 수​​ 있도록 다량 비축 될 수있다.

스캔하는 동안 제대로 처리 비드 칩은 밝고 뚜렷한 빨강과 녹색 레이저 광 강도를 표시해야합니다. 그림 6에서, 이스 칸 스캔 소프트웨어가 성공적으로 사용자 정의 패널 SNP 유전자형 배열에 하이브리드 표준 게놈 DNA 샘플을 표시합니다. 확장 및 염색 단계에서 부착 한 표지 뉴클레오티드는 두 레이저의 조명에서 형광. 이러한 뉴클레오티드는 선택적으로 단편화 DNA 가닥으로 혼성화 비드의 올리고 뉴클레오티드 사슬 연장, 및 올리고 뉴클레오티드 사슬이 변이체의 사이트에서 종료하도록 설계된대로, 얻어진 신호의 색상과 강도가 존재 대립 유전자를 결정하기 위하여 사용될 수있는 바와 같이 SNP 사이트. 회사로부터 직접 받아 chipID와 위치에 샘플 ID와 임상 정보와 일치하는 사용자가 생성 한 샘플 시트 및 배열 특정 SNP 매니페스트는 SCA를 가져 오려면 모두 필요하다nner 출력 파일 GenomeStudio 분석 소프트웨어로. 예를 들어 샘플 시트는 회사의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다. GenomeStudio 프로젝트가 건설되면, 유전자형은 소프트웨어에 의해 자동으로 생성 된 결과 강도 클러스터에서 얻을 수 있습니다. 다중 디스플레이 옵션이 존재하지만, 기본보기, 규범 시타 (대립 유전자 강도 비) 대 규격-R (정규화 된 강도 값), 종종 세 가지 클러스터를 구별하는 가장 쉬운 플롯이다. 대부분의 SNP는 마이너 대립 유전자 빈도에 따라 하나, 둘 또는 세 개의 클러스터를 표시한다. 세 개의 클러스터는 AA, AB, BB 또는 대립 유전자 (그림 7 참조)를 보여주는 샘플을 나타냅니다. 이 클러스터는 소프트웨어의 분석 도구 모음에서 &quot;모두의 SNP를 클러스터&quot;를 선택하여, 회사에서 직접 표준 클러스터링 위치 템플릿을 가져 와서, 또는 클릭하고 수동으로 EDI 강도 플롯의 색깔의 원형을 드래그하여 하나 유전자형을 할당 할 수 있습니다<html> t를 호출합니다. (빨간색, 보라색, 파란색) 강도 음모에 샘플의 색은 전화 (AA, AB, 또는 BB, 각각)을 나타내고, 검은 색은 전화를 나타냅니다. 소프트웨어의 전체 데이터 창에 표시 SNP를 스크롤함으로써, 각 SNP에 대한 클러스터링을 보거나 호출 할 수 있습니다. 클러스터가 만족 통화를 할당되면, 소프트웨어의 전체 데이터 창은 각각의 특정 SNP에 각각의 샘플에 대한 유전자형을 나열합니다. 테이블 위의 열 선택기 옵션은 데이터 형식을 전환 할 수 있습니다. 데이터에 대한 심층 분석을위한 분석 도구 모음을 통해 또는 직접 전체 데이터 테이블에서 하나를 내보낼 수 있습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> 그림 1. 개요 - Infinium 분석 프로토콜.683/50683fig1highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> 그림 2. 전체 그리고, Hyb 상공 회의소베이스와 매트 플러스 뚜껑. [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> 그림 3 Beadchip로드 -.. 입구 포트에서 샘플을 분배 [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">더 보려면 여기를 클릭하십시오</a><html> 이미지. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> 그림 4 Beadchip Coverseal을 제거 -.. 코너에 실을 잡고 부드럽게 대각선 껍질 [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> 그림 5. 전체 Beadchip 흐름을 통해 조립 - BeadChip는 스페이서 유리 슬라이드에서 분리 걸쇠에 바인딩됩니다.&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> 그림 6. 성공적인 BeadChip 스캔 - A) BeadChip는 모두 빨간색과 녹색의 레이저로 스캔, 스캔 소프트웨어 모두 표시 동시에. 강도 QC를 통과하는 부분은 왼쪽으로 BeadChip 디스플레이에 녹색을 강조 할 것입니다. 강도 QC 실패한 섹션 BeadChip 디스플레이에 적색 강조한다. B)를 스캔이 완료되면, 소프트웨어는 적색 및 녹색 디스플레이를 오버레이한다. 확대 된 이미지가 표시됩니다. 각 구슬의 색과 강도는 대립 유전자의 존재를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.wi얇은 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> 그림 7. NORM-THETA 클러스터 프로필 대 SNP NORM-R -. AA, AB, BB와 유전자형, 빨간색, 보라색, 파란색 B 색) SNP 요구하는 편집 기능을 나타내는 세 가지 클러스터와) 유효 SNP. 동형 접합 AB해야 중간 클러스터, 취소라고 남아 있습니다. BB 클러스터가 잘못 AB. C)별로 실적 SNP라고한다. 뚜렷한 클러스터가 존재하지 않기 때문에 어떤 유전자형이 강도 음모에서 얻을 수 없습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

프로토콜은 대규모 유전자형을 수행 Illumina 사 Infinium의 분석법을 사용하는 것이 기재되어있다. 이러한 분석은 안정적으로 사흘 만에 개인의 DNA 샘플의 수백에 걸쳐 수백만의 SNP 유전자형 수 있습니다. 일단 생성,이 유전자형이 다른 질병 또는 표현형의 다양한 연결을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

대규모 SNP 유전자형 응용 프로그램에 대한 Infinium 분석

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

본 절차의 전반적인 목표는 Infinium 분석법을 성공적으로 사용하여 유전자형 분석 비드 칩을 처리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 DNA를 증폭, 단편화 및 분리합니다. 두 번째 단계는 변성된 DNA 가닥을 어레이의 비드에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 것입니다.다음으로, 비드에 부착된 올리고뉴클레오타이드를 염색하고 하나의 염기를 선택적으로 연장합니다. 마지막 단계는 비드 칩을 스캔하여 표지된 뉴클레오타이드를 검출하는 것입니다. 최종적으로, 유전자형 분석 결과는 관심 부위에 존재하는 대립유전자를 결정하는 데 사용됩니다.벌 칩(bee chip)의 염색 및 로딩 단계 중 많은 부분이 학습하기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 여러 조작법은 다른 유전자형 분석 방법에서는 찾아볼 수 없으며, 많은 장비의 명칭이 서로 매우 유사합니다. 증폭 하루 전, DNA를 준비하여 딥웰 96 샘플 플레이트의 웰당 200 nanograms의 DNA를 분주하십시오.시약 낭비를 방지하기 위해 최소 96개의 샘플을 플레이트에 분주해야 합니다. 키트에서 제공된 바코드 스티커를 플레이트에 부착하고, 부피를 일정하게 맞추기 위해 원심분리합니다. 액체를 증발시키기 위해 샘플을 서랍이나 퓸 후드(fume hood)에 넣고 하룻밤 동안 둡니다.다음 날 아침에 먼지가 들어가지 않도록 플레이트를 덮개나 종이 타월로 느슨하게 덮어둡니다. 웰이 말라 있는지 확인한 후, 시약 저장조와 10 µL 8채널 피펫을 사용하여 각 웰에 4 µL의 DNA Resus 버퍼를 분주하여 샘플을 재수화합니다. 액체에 닿지 않도록 주의한다면, 각 컬럼 사이마다 피펫 팁을 교체할 필요는 없습니다.다음으로, 8채널 피펫과 새 시약 저장조를 사용하여 플레이트의 각 웰에 MA one 시약 20 µL를 분주합니다. 플레이트를 재사용 가능한 씰로 덮고, 짧게 원심분리한 후 마이크로플레이트 쉐이커에서 1600 RPM으로 1분간 볼텍싱하며 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다. 증폭을 위한 나머지 단계는 이 영상에서 보여주지 않으나, 해당 프로토콜은 함께 제공되는 원고에서 확인하실 수 있습니다.모든 시약을 첨가한 후, 37°C로 설정된 보정된 오븐에 플레이트를 넣고 20~24시간 동안 배양합니다. 증폭 후, DNA 샘플은 원고에 기술된 대로 단편화하고 고속 원심분리기를 사용하여 침전시킵니다. 플레이트를 뒤집지 않고 바닥면을 확인합니다.샘플이 푸른색 펠렛 형태로 침전되었는지 확인하려면, 덮개를 버리고 플레이트를 뒤집은 후 종이 타월이 깔린 실험대 위에 강하게 두드려 액체를 빠르게 제거하십시오. 플레이트를 한 번 뒤집었다면 다시 원래대로 되돌리지 않도록 주의하십시오. 액체가 남아 있는 동안에는 모든 액체가 제거될 때까지 플레이트를 실험대 위에 반복해서 두드리십시오.플레이트를 시험관 랙 위에 뒤집어 놓아 상온에서 1시간 동안 건조 배양합니다. 이후, 하이브리다이제이션 절차를 시작하기 위해 DNA를 재현탁합니다. 재현탁된 DNA가 담긴 96-웰 플레이트를 95 °C의 히트 블록에서 20분 동안 가열합니다.20분 후 DNA를 변성시키려면, 샘플 플레이트를 히트 블록에서 꺼내 실온에서 30분 동안 배양하십시오. 샘플 플레이트가 식는 동안 하이브 챔버를 준비합니다. 처리하는 벌 칩 4개당 하나의 챔버가 필요합니다. 하이브 챔버 베이스 상단에 고무 매트를 놓되, 더 큰 구멍이 베이스의 전면과 일치하도록 맞춥니다.베이스에 새겨진 바코드 기호가 여전히 보여야 합니다. 1000 µL 피펫을 사용하여 베이스에 파여 있는 8개의 가습 저장조 각각에 PB two 시약 400 µL를 분주하십시오. 베이스 위에 hi 챔버 뚜껑을 덮고, 대각선 방향의 양 끝에 두 개의 클램프를 끼워 고정하십시오.먼저 30분간의 냉각 시간이 끝나기 직전에, 사용하는 각 hi chamber당 네 개의 Hi chamber insert를 벤치 위에 놓습니다. 실버 비드 칩 팩을 개봉하십시오.비드를 건드리지 않고 투명 플라스틱 슬리브에서 칩을 꺼냅니다. 각 비드 칩을 하이 챔버 인서트(hi chamber insert) 위에 놓습니다. 이때 칩의 바코드가 인서트 상단 표면에 각인된 바코드 기호와 일치하도록 방향을 맞춥니다.다음 단계인 bee chip 로딩은 프로토콜에서 가장 중요한 단계일 수 있습니다. 이를 정확하게 수행하려면 DNA 플레이트에서 bee chip으로의 샘플 전송 과정을 미리 시각화해야 합니다. 샘플 플레이트의 덮개를 벗겨서 버립니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 칩에 액체를 분주할 수 있으나, 플레이트의 행 수가 칩의 행 수와 항상 일치하는 것은 아니므로 bee chip에 안전하게 배치할 수 있는 샘플 수만큼만 흡입하도록 주의 깊게 계획해야 합니다.샘플 플레이트에서 샘플 15 µL를 취하여 어레이의 입구에 천천히 분주합니다. 비드 칩의 순서에 맞춰 정확한 샘플을 정확한 비드 칩의 정확한 위치에 배치하도록 각별히 주의해야 합니다. 순서는 앞서 기록된 내용을 따릅니다.hi 챔버를 열고 가습 저장조 위에 인서트를 배치합니다. 칩의 바코드가 hive 챔버 바닥에 식각된 바코드 위에 오도록 배치해야 합니다. hive 챔버 커버를 덮고 대각선 방향의 클라스프부터 순서대로 총 4개의 클라스프를 모두 닫습니다.먼저, 하이브리다이제이션(hybridization)이 완료되면 hi 챔버를 48 °C 오븐에서 16~24시간 동안 배양합니다. 그 후 hi 챔버를 오븐에서 꺼내 실온에서 25분 동안 방치하여 식힙니다. hi 챔버가 식으면 챔버 하나를 엽니다. bee 칩의 커버 씰의 한쪽 모서리를 잡고 대각선 방향으로 조심스럽게 벗겨내어 제거합니다.실(seal)을 제거한 즉시 칩을 비드 칩 트레이에 놓고, 비드에 닿지 않도록 주의하며 PB 1에 담급니다. 트레이가 비드 칩으로 가득 찰 때까지 이 과정을 반복합니다. 이때 어떤 칩도 마르지 않도록 주의하십시오.트레이를 부드럽게 흔들어 기포를 제거하고 칩이 잠긴 상태로 1분 동안 둡니다. 트레이를 다시 한번 흔들어 줍니다. 꿀벌 칩이 담긴 트레이를 PB.One이 채워진 두 번째 세척 용기로 옮긴 후, 부드럽게 흔들어 1분 동안 세척합니다.그런 다음 액체 유동 조립 스테이션(liquid flow through assembly station)에서 다시 교반합니다. 홈에 검은색 플라스틱 유동 브레이스(flow through braces) 4개를 배치합니다. 액체가 8개의 조립 브래킷 높이에 거의 도달할 때까지 PB를 하나씩 스테이션에 채웁니다.트레이에서 비드 칩을 꺼내 플라스틱 유동 브레이스 위의 조립 스테이션에 배치하며, 칩 바코드가 조립 스테이션에 식각된 바코드 기호 위에 오도록 정렬해야 합니다. 네 개의 칩이 조립 스테이션에 배치되면, 각 비드 칩 위에 투명 플라스틱 스페이서를 올립니다. 스페이서의 바깥쪽 가장자리가 조립 스테이션 내부의 브래킷을 둘러싸야 합니다.플라스틱 조립 바를 홈에 맞춰 조립 스테이션에 배치합니다. 슬라이드의 뒷부분을 조립 바에 밀착시킨 후 앞부분을 액체 속으로 천천히 내려 플라스틱 스페이서 위에 유리 슬라이드를 조심스럽게 놓습니다. 슬라이드 상단의 홈이 칩의 바코드 바로 위에서 아래를 향하도록 하여, 바코드 끝부분에서 bee chip과 슬라이드 사이에 틈이 생기도록 합니다.칩과 슬라이드 사이에 기포가 없는지 확인한 후, 금속 클래스 두 개를 유리 주변에 끼웁니다. 하나는 바코드 쪽으로, 다른 하나는 뒷면 쪽으로 밀어 넣습니다. 플라스틱 클래스의 가장자리가 칩 아래의 플라스틱 플로우 스루 브레이스를 고정해야 합니다.이 그림은 전체 flow-through 조립 도식도를 보여줍니다. 모든 비드가 flow-through 조립체에 배치되면, 외과용 가위를 사용하여 스페이서의 양 끝을 유리 슬라이드에 최대한 가깝게 자릅니다. 챔버 랙이 44°가 되면, bee chip flow-through 조립체를 아래로 밀어 넣고 상단의 브레이스를 걸어 챔버 랙에 배치함으로써 이 절차를 시작합니다. bee chip의 뒷면이 챔버 랙에 닿아야 합니다.유리 슬라이드의 홈이 위로 향하게 하여 시약 저장소가 되도록 바깥쪽으로 배치해야 합니다. 모든 벌 칩 어셈블리를 챔버 랙에 배치한 후, 200 µL 피펫을 사용하여 플로우 스루 어셈블리에 RA one 시약 150 µL를 첨가합니다. 액체를 유리 저장소에 분주하면 시약이 슬라이드를 따라 자연스럽게 흘러 내려가 어셈블리 바닥으로 배출되며, 이를 통해 이후의 시약들을 저장소에 직접 넣을 수 있습니다.확장부 염색을 위한 나머지 단계는 생략합니다. 염색 및 확장 완료 후에는 동봉된 논문의 프로토콜을 참조하시기 바랍니다. 클램프와 브레이스 사이에 얇은 금속 막대를 삽입하여 플로우 스루 어셈블리를 분해하십시오.그다음 피벗팅 단계입니다. 유리 슬라이드를 따로 떼어 놓고 비드 칩을 즉시 제거하여 수직 비드 칩 트레이에 넣은 후 PB 1에 담급니다. 모든 플로우 스루 어셈블리에 대해 이 과정을 반복합니다. 이때 각 비드 칩이 모두 같은 방향을 향하도록 주의하고 공기 노출을 최소화하십시오.이후 본 절차를 완료합니다. 첨부된 텍스트의 프로토콜에 따라, 적절하게 처리된 비 칩(bee chip)을 스캔하면 밝고 뚜렷한 적색 및 녹색 레이저 빛 강도가 나타나야 하는데, 이는 신장 및 염색 단계에서 부착된 표지 뉴클레오타이드가 두 개의 레이저 광원 아래에서 형광을 발하기 때문입니다. 여기에는 커스텀 패널 SNP 유전자형 분석 어레이 섹션의 강도 통과 기준을 성공적으로 하이브리드화한 표준 게놈 DNA 샘플이 표시되어 있습니다.QC가 왼쪽 섹션의 bee chip 디스플레이에서 녹색으로 표시됩니다. 강도가 기준에 미달하는 경우, QC가 bee chip 디스플레이에서 빨간색으로 표시됩니다.스캐닝이 완료되면 빨간색과 녹색 디스플레이가 겹쳐지게 됩니다. 여기서 확대된 이미지를 보면, 뉴클레오타이드가 조각난 DNA 가닥에 하이브리드화된 비드의 올리고뉴클레오타이드 체인을 선택적으로 연장시키는 것을 확인할 수 있습니다. 뉴클레오타이드 체인은 변이 부위에서 종료되도록 설계되었으므로, 결과 신호의 색상과 강도를 통해 SNP 부위에 존재하는 대립유전자를 결정할 수 있습니다.스캐너 출력 파일은 Genome Studio Analysis 소프트웨어로 가져오며, 해당 소프트웨어는 클러스터 프로파일을 생성합니다. 이것은 aa, A, B 및 B, B 유전자형을 각각 빨간색, 보라색, 파란색으로 나타내는 세 개의 뚜렷한 클러스터가 있는 유효한 SNP의 예시입니다. 이 강도 플롯은 동형접합체여야 하는 검은색 중앙 클러스터를 편집해야 했던 SNP를 보여줍니다.AB는 호출되지 않은 상태로 남습니다. BB 클러스터는 ab로 잘못 호출되었습니다. 마지막 강도 플롯은 성능이 낮은 SNP를 보여줍니다.뚜렷한 클러스터가 존재하지 않으므로 이 강도 도표(intensity plot)에서는 유전자형을 얻을 수 없습니다. 이 절차를 수행할 때는 비 칩(bee chips)을 신속하게 처리해야 함을 기억하는 것이 중요합니다. 칩을 장시간 공기 중에 노출시키지 마십시오.

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