체외 준비

이 절차의 전반적인 목표는 성체 마우스 myenteric plexus에서 기능적으로 생존 가능한 뉴런과 CLIA를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 멸균 세포 배양 표면을 폴리리신과 라미닌으로 코팅하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 myenteric plexus isolation을 위한 용액과 수술 부위를 준비하는 것입니다.

다음으로, 위장관을 제거하고 원하는 부분을 분리하여 종단 근육 장신경총 준비를 만듭니다. 마지막 단계는 콜라겐 분해 효소와 트립신에서 LMMP를 순차적으로 분해한 다음 사전 코딩된 세포 배양 표면에 세포를 도금하는 것입니다. 궁극적으로 전기생리학, 면역세포화학(immuno cyto chemistry) 및 단세포 PCR을 사용하여 장 뉴런, 신경교세포(glia) 또는 이 두 세포 유형 간의 상호 작용의 영향을 연구할 수 있습니다.

절차를 시연하는 것은 모든 실험실의 박사후 연구원인 Trisha Har Smith 박사가 맡을 것이며, 모든 실험실의 박사 과정 학생인 Joy Gombe가 그녀를 도울 것입니다. 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 뉴런과 신경교세포가 성체 쥐에서 나온다는 것입니다. 이것은 잠재적으로 유전자 변형 동물에서 올 수 있는 완전한 기능의 뉴런과 신경교세포를 허용합니다.

이 방법은 뉴런의 전기적 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 면역 세포 화학, 단일 세포 PCR 및 실시간 칼슘 이미징과 같은 다른 방법론에도 적용할 수 있습니다. 안락사된 쥐를 수술 표면의 등쪽 누워 있는 상태로 놓는 것으로 이 절차를 시작합니다.

다음으로 70% 에탄올로 복부 피부를 청소합니다. 그런 다음 한 쌍의 집게로 들어 올리고 가위로 복강을 열어 내부 소화 기관을 드러냅니다. 그 후, 회장의 일부를 들어 올려 mesentary를 드러냅니다.

위장관을 제거하고 가위로 장간막을 잘라냅니다. 그런 다음 회장과 결장을 부드럽게 제거하고 풀어줍니다. 전장 장이 풀린 후 회장과 결장에서 장간막을 당기지 않도록 주의하십시오.

장 원위부와 맹장 근위부에 있는 장을 절단하여 회장을 제거합니다. 이 절차는 또한 결장을 원위에서 맹장으로, 근위부에서 항문으로 제거하여 결장 조직으로 수행할 수 있습니다. 다음으로 회장을 세 개 이상의 큰 조각으로 나눕니다.

모든 배설물이 별도의 쓰레기 용기에 제거될 때까지 장 부분을 통해 크렙 용액을 부드럽게 문지릅니다. 깨끗하다고 표시된 크렙스 용기에 세척 부분을 넣고 회장 전체가 세척될 때까지 절차를 반복합니다. LMMP를 제거하려면 회장을 2-4cm의 작은 분절로 자릅니다.

그런 다음 플라스틱 또는 유리 막대에 회장 조각을 놓습니다. 회장은 꼭 맞아야 하지만 헐렁하거나 팽팽하지 않아야 합니다. 엄지 손가락으로 튜브를 막대에 부드럽게 고정하여 위장관이 막대 주위에서 회전하는 것을 방지합니다.

그런 다음 집게로 위장관에 아직 붙어있는 장간막 조각을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 아래에 있는 원형 근육에서 LMMP를 분리합니다. 먼저 장간막이 부착된 전체 선을 따라 겸자의 가장자리를 세그먼트의 위에서 아래로 부드럽게 문지릅니다.

그런 다음 세로 근육에 부드럽게 틈을 만듭니다. 그런 다음 틈새의 맨 위에서 시작하여 틈새를 끼운 면봉을 사용하여 세로 근육이 원형 근육에서 분리되기 시작할 때까지 매우 가벼운 압력을 가하면서 가장 가벼운 수평 스트로크를 사용하여 세로 근육을 부드럽게 괴롭힙니다. mesentary 부착 지점을 따라 전체 스트립을 따라 이 작업을 수행합니다.

다음으로, 위에서 아래로, 뒤로 움직여 위장관 주위를 부드럽게 움직입니다. 종근이 관 주위의 원형 근육에서 천천히 분리되기 때문입니다. 완료되면 LMMP는 나머지 위장관에서 자연스럽게 떨어져 나옵니다.

그런 다음 LMMP라고 표시된 비커에 세로 근육의 얇은 스트립을 놓고 이 절차의 모든 세그먼트에 대해 절차를 반복합니다. LMMP 세그먼트에 대한 헹굼을 분해 용액에 놓습니다. 그런 다음 가위로 LMMP를 작은 조각으로 자릅니다.

그런 다음 60분 동안 소화시킵니다. 섭씨 37도의 수조에서 셰이커를 사용하여 발탄제로 부드럽게 거품을 냅니다. 분해가 완료된 후 원심분리기에서 356Gs로 8분 동안 원심분리하여 세포를 모으고 섭씨 4도로 냉각합니다.

그 동안 멸균된 50ml 세포 배양 튜브에 1ml의 따뜻한 0.25%트립신과 4ml의 데워진 HBSS를 첨가하여 세포 배양 후드에 0.05%트립신 용액을 준비합니다. 원심분리 후 상등액을 조심스럽게 버리고 세포 펠릿을 제거한 다음 0.05% tryin 용액 5ml가 담긴 깨끗한 튜브에 넣습니다. 다음으로, 섭씨 37도의 수조에서 0.05% tryin 용액에 담긴 세포를 7분 동안 흔들면서 분해하고 10ml의 냉간 헹굼 매체로 tryin을 중화합니다.

트립신 치료 7분 후, 356gs에서 8분 동안 세포를 원심분리한다. 그 동안, 멸균된 TX 메쉬의 균형 부분은 멸균 15ml 세포 배양 튜브 위에 있습니다. 원심분리 후, 상등액을 버리고 세포 혼합물을 3밀리리터로 트리거하여 부드럽게 재현탁합니다.

완전한 뉴런 매체. 모든 변경은 기포가 생성되지 않도록 매우 조심스럽게 수행해야 하며, NYX 메쉬를 통해 세포 용액을 15ml의 깨끗한 세포 배양 튜브로 여과해야 합니다. 356gs에서 8분 동안 원심분리를 통해 세포를 모읍니다.

그 후 상층액을 제거하고 버리십시오. 1200 마이크로리터의 완전한 뉴런 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 1 밀리리터의 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 세포를 부드럽게 t하십시오.

대부분의 덩어리가 부서지고 세포가 액체에 현탁될 때까지 기포 피펫이 천천히 부드럽게 생성되지 않도록 주의하십시오. 이제 750마이크로리터의 전체 매체를 사전 코딩된 유리 커버 슬립이 포함된 12개의 웰 각각에 추가합니다. 그런 다음 정격 셀 용액 100마이크로리터를 추가합니다.

세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도의 이산화탄소 변화로 뉴런을 배양합니다. 이틀에 한 번씩 세포 배지의 절반을 투여합니다. 뉴런은 배양에서 하루에서 이틀 후에 전기생리학적 기록을 할 준비가 됩니다.

여기에 표시된 것은 장 뉴런의 면역조직화학적 특성화입니다. Lea는 마우스로부터 격리되었습니다. 종방향 근육 컨포칼 현미경 검사는 마우스의 전체 산 회장 종단 근육 제제에서 뉴런 특이적 베타 3 튜불린 염색을 밝혔습니다.

그리고 이들은 LMMP 제제에서 분리된 세포이며, 여기에는 cal 결합에 대해 양성으로 염색된 뉴런이 포함되어 있으며 여기에 표시된 Retin glia 세포는 glia 특이적 마커 GFAP로 시각화되었습니다. 그러나 1차 항체를 생략했을 때 염색은 나타나지 않았습니다. 다음은 마우스의 종방향 근육에서 분리된 뉴런과 신경교세포가 서로 가깝게 자라는 것입니다.

컨포칼 현미경 이미지는 녹색 뉴런과 빨간색 ggl이 서로 쉽게 인접하게 성장하고 체외에서 상호 작용하는 것으로 보입니다. 이 그림은 현재 클램프 모드에서 배양된 장 뉴런과 CLIA의 전기생리학을 보여줍니다. 모든 뉴런은 현재 주입 시 활동 전위를 나타냈습니다.

CLIA는 활동 전위가 없지만 전류 주입에 대한 반응으로 큰 전기 전위를 나타냅니다. 마우스 회장에서 배양된 뉴런은 전기생리학적으로 이질적인 집단입니다. 전류 클램프 모드에서 0.09나노 암페어의 전류를 뉴런에 주입하면 활동 전위가 발생합니다.

HP 음성 뉴런은 자극 후 즉시 휴지막 전위로 돌아갑니다. HP 양성 뉴런은 자극 후 휴지 막 전위가 기준선 이하로 떨어지고 천천히 초기 값으로 돌아가는 A HP를 표시합니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때 유리 제품과 수술 기구를 가능한 한 깨끗하게 유지하는 것이 중요합니다. 또한 세포를 부드럽게 반복하고 버블링하고 이 절차에 따라 2일마다 세포 배양 배지의 절반을 교체합니다. 전기생리학 및 면역 세포 화학과 같은 방법을 수행하여 약물 치료에 대한 장내 이온 채널이 어떻게 반응하는지, 뉴런과 lia에서 단백질의 발현에 대해 배우고, 이 두 세포 유형의 상호 작용이 개발 후 다양한 치료에 의해 어떻게 변경되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 기술은 신경생물학 분야의 연구자들이 유전자 변형 동물에서 장 신경계의 신경병증 및 신경병증의 기본 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 성인 마우스 장 신경계의 TER 신경총에서 뉴런과 신경교세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.