Name: 체외 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 배우세요 성체 마우스 장신경총에서 신경세포와 신경교세포를 분리하는 세포 배양 방법입니다. 이 기술은 전기생리학 및 면역세포화학 분석을 통해 장-뇌 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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건강 그랜트 DA024009의 국립 연구소, DK046367 및 T32DA007027.

모든 동물 관리 및 실험 절차에 따라이었고, 버지니아 커먼 웰스 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인. 1. 24 잘 접시에 무균 폴리-D-라이신과 라미닌 코팅 유리 coverslips를 준비 <ol><li> 1 단계의 모든 절차는 무균 조건에서 수행되며, 후드, 멸균 시약. 유리 coverslips를 두 번 탈 이온수 (DDH 2 O)은 사전에 소독해야한다. 접시의 준비는 신경 세포의 분리 2 주 전에까지 수행 할 수 있습니다. </li><li> 후드 아래, 24 - 웰 플레이트의 12 우물 멸균 유리 coverslips는을 배치 멸균 집게를 사용합니다. </li><li> 미리 폴리 - D - 라이신 재고를 준비합니다. 5 MG 폴리 - D - 라이신에 멸균 ddH2O의 50 ML을 추가합니다. -20 ° C.에 소용돌이 3 ML의 분주에 저장 사용하기 전에 분주 해동. </li><li> 피펫 80 μL : 25cm 2 당 1 ML 폴리 - D - 라이신 주식의 최종 농도에 대한각 유리 coverslip을 (2cm 2)의 위에 폴리 - D - 라이신 주식. 솔루션은 10 분 동안 정착하자. </li><li> 폴리 - D - 라이신 사용하여 진공을 제거하고 살균 DDH 2 O와 배의 coverslips을 씻어 </li><li> 플레이트 후드 아래에 적어도 2 시간 동안 건조하도록 허용합니다. </li><li> 접시는 4 ° C 또는에 저장 될 수있다 - 20 ° C 라미닌 코팅을 진행하기 전에. </li><li> 미리 라미닌 주식을 준비합니다. 얼음에 라미닌을 해동하고 사용하는 동안 얼음에 보관하십시오. 50 ㎍ / ㎖의 농도로 희석, 많은 농도에주의를 지불한다; 각이 많이 다릅니다. 부지의 농도에 따라 약 20 ML DDH 2 O는 라미닌의 각 유리 병에 추가됩니다. -80에서 나누어지는 (5 ML) 및 저장 ° C. 사용하기 전에 얼음에 분주 해동. </li><li> 5 ㎍ / cm 2 라미닌과 코트 coverslips는, 각 coverslip에 대한 라미닌 주식의 피펫 200 μL. </li><li> 1 시간 동안의 coverslips에 라미닌 솔루션을 품어. </li><li> 나머지 라미닌 솔루션을 기음과 한 번 coverslips를 씻어DDH 2 O coverslips는 표면을 긁어하지 마십시오. </li><li> 최대 2 주 4 ° C에서 보관 플레이트. </li></ol> 2. 신경 분리 솔루션의 사전 준비 <ol><li> (: 118 염화나트륨, 4.6 KCl을 1.3 2 PO 4, 1.2 황산 마그네슘, 25 NaHCO3를 11 포도당, 2.5 염화칼슘 NaH를 mm 단위) 크렙스 솔루션을 준비합니다. 장소 13.79 g 염화나트륨 (FW 58.44) 0.686 g KCl을 (FW 74.55) 0.312 g의 NaH 2 PO 4 (FW 120), 0.289 g 황산 마그네슘 (FW 120.4), 4.20 g NaHCO3를 (FW 84.01), 3.96 g 포도당 (FW 180.2), 2 L DDH 2 0 0.555 g 염화칼슘 (FW 111). 4 ° C.에 진정 </li><li> 미디어 (10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 항진균 / 항생제 F12 미디어) 씻어 준비 : F12 매체의 500 ML 병으로, 50 ML FBS 및 항진균 / 항생제 100X 액체 (GIBCO) 5 ㎖를 추가합니다. </li><li> 장내 신경 미디어 (Neurobasal B-27와 미디어, 2 mM의 L-글루타민, 1 % FBS, 10 NG / ML, 아교 파생 Neurotr 준비ophic 인자 (GDNF) 및 항진균 / 항생제 100X 액체). GDNF 주식을 만들려면 -80 ° C.에 10 μg의 GDNF에 1 ML ddH2O을 추가하고 50 μl를 분주, 가게에 다시 동결 완전한 신경 세포 미디어 50 ML 유리 병의 경우, 47.5 ML Neurobasal 미디어 1 ML B-27 (50X), 500 μL FBS, 500 μl의 200 mM의 L-글루타민 (GIBCO) 50 μL GDNF 재고, 500 μL 항생제 / 결합 항진균 100X 액체. 미디어 GDNF의 신선도를 보장하기 위해이 비싼 휴대 미디어 혼합물의 대량의 오염을 방지하기 위해 작은 50 ML 일괄 처리에서 이루어집니다. </li></ol> 3. 마우스에서 수확 세로 근육 / Myenteric 신경총 (LMMP) 준비 <ol><li> 동물 실험을 수행하기 전에 해당 국가 및 기관의 윤리 장소에 있어야합니다. 25g (일반적으로 나이 8 주 이상)에 무게 어른 스위스 웹스터 마우스는 이전의 실험 6 그룹으로 보관되어 있습니다. 두 쥐의 조직은 회장 장내 뉴런과 교세포의 분리에 사용되는 세 생쥐에 사용됩니다대장 세포의 분리. </li><li> 수술 영역을 준비합니다. 작은 외과 가위, 직각 집게, 면봉, 3 개의 200 mL 유리 비커와 유리 / 플라스틱 막대 (붓) 수집합니다. 모든 전원이 완전히 세척하고 오염을 최소화하기 위해 사용하기 전에 세척되어 있는지 확인합니다. 이 단계는 실험 하루 전에 수행 할 수 있습니다. </li><li> 산도를 안정화하기 위해 적어도 30 분 동안 carbogen (95 % 산소, 5 % CO 2)에 얼음과 거품에 크렙스 솔루션을 배치합니다. </li><li> 원하는 온도에서 안정화하기 위해 다양한 장비와 따뜻한 화학 물질을 켭니다; 37 열 수조 (들) ° 4 ° C, 장소 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 물 목욕에 0.5 % 트립신 (37 ° C에 C, 차가운 원심 분리기 ). 완전한 신경 세포 미디어와 린스 미디어 냉장 유지해야한다. </li><li> 장소 150 ML 얼음 추위 &#39;더러운&#39;, &#39;깨끗한&#39;및 &#39;LMMP&#39;라는 3 개의 200 ML 유리 비커에 크렙스 포입. 거품 비커 carbogen와 &#39;LMMP&#39;로 분류. </li><li> 윤리위원회, 안락사 m의 승인에 따라자궁 경부 전위 또는 CO 2 질식하여 여러개. </li><li> 70 % 에탄올로 수술 표면에 깨끗한 피부에 지느러미 드러 누움에 마우스를 놓고 집게를 사용하여 복부 피부를 들어 올립니다. 가위, 오픈 복강 내부 소화 기관을 공개 사용. </li><li> 회장의 섹션을 리프팅과 장간막를 공개하여 위장관의 길이를 제거합니다. 가위로 장간막을 통해 싹둑 부드럽게 제거하고 회장 / 결장의 장간막을 끌어 않도록주의하면서, 회장 및 결장을 해명한다. </li><li> 소장의 전체 길이가 풀어 후에는 소장을 통해 맹장에 위 원위부와 근위부 절단하여 회장을 제거합니다. 참고 :이 절차는 근위부에 맹장 원위부에서 결장을 제거하여 대장 조직을 수행 할 수 있습니다 항문. </li><li> 조직은 더욱 근위 및 원위 결장, 그리고 jejenum 및 회장 사이에 나눌 수 있습니다. 이 절차의 나머지는 회장의 분리를 참조합니다; t그 절차는 대장 LMMP의 분리에 대해 동일합니다. 차가운 얼음 크렙스는 &#39;더러운&#39;표시와 함께 유리 용기에 전체 회장을 놓습니다. </li><li> 회장을 청소하는 도구를 작성하고 제출 돌을 사용하여 무딘 큰 20 G 바늘 얼음 차가운 크렙스을 포함하는 큰 주사기 (10 ㎖)에 연결합니다. </li><li> 세 개 이상의 대형 조각으로 회장을 절개하여 회장에서 찌꺼기를 청소합니다. 커에서 회장 섹션을 제거하고 회장 조각의 끝으로 무딘 바늘을 배치합니다. </li><li> 모든 배설물은 별도의 폐기물 용기에 제거 될 때까지 조심스럽게 용기 섹션을 크렙스를 실행합니다. &#39;깨끗한&#39;표시 크렙스의 용기에 세척 섹션을 배치합니다. 전체 회장이 정리 될 때까지 반복합니다. </li><li> LMMP를 제거하려면 약 2 작은 세그먼트로 회장을 잘라 - 4cm입니다. 플라스틱이나 유리 막대에 회장의 세그먼트를 배치, 회장은 snuggly 히 적합하지만 (1 ~ 2 ㎜) 느슨하거나 팽팽해서는 안됩니다. 부드럽게 장간막의 비트를 제거하여 LMMP의 제거를 시작하기는 여전히 첨부집게를 사용하여 위장 (GI) 요로 에드. 부드럽게 엄지 손가락을 사용하여로드에 튜브를 고정하여 막대 주위에 회전하는 GI 기관을 방지합니다. </li><li> 기본 원형 근육에서 LMMP을 분리, 먼저 부드럽게 부드럽게 세로 근육의 차이를 만드는, 정상에서 세그먼트의 아래로 장간막이 붙어 있던 전체 라인을 따라 포셉의 가장자리를 문질러. 그런 다음 부드럽게 크렙스 적신 면봉을 사용하여 세로 근육을 멀리 애타게. </li><li> 세로 근육 갭의 상단에서 시작하고 길이 근육은 단지 원형 근육에서 분리 시작할 때까지 매우 가벼운 압력을 적용하는 동안 가벼운 수평 스트로크를 사용하여 멀리 애타게, 장간막 부착 점을 따라 전체 지구 아래이 작업을 수행합니다. </li><li> 그런 다음 부드럽게 GI 관 해결하기 시작, 세로 근육이 서서히 관의 주위에 원형 근육에서 모든 방법을 분리로 처음부터 끝까지 다시 이동. 완료되면,LMMP 자연스럽게 GI 관의 나머지를 올 것이다. </li><li> &#39;LMMP&#39;표시 비커 세로 근육의 결과 얇은 스트립을 배치합니다. 모든 세그먼트에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> LMMP의 모든 지구가 하나의 마우스에서 수집 한 후, 사용중인 다른 마우스에 대해 절차를 반복합니다. 철저하게 다시 사용하기 전에 &#39;더러운&#39;와 &#39;깨끗한&#39;비커를 씻어. </li><li> 생물학적 오염을 제거하기 위해 배 LMMP을 씻어. 차가운 얼음 크렙스 세 개의 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브를 채 웁니다. 원심 분리기 356 XG에 30 초 동안 첫 번째 튜브와 스핀 LMMP 스트립을 배치 4 ° C로 냉각 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 다음 깨끗한 크렙스 채워진 튜브에 LMMP 스트립을 이동합니다. 나머지 각 튜브에 대해이 절차를 반복합니다. </li></ol> 4. 다이제스트 LMMP <ol><li> 10 ㎖ carbogen - 버블 크렙스 용액에 13 밀리그램 콜라 2 형 및 3 MG BSA를 배치하여 소화 솔루션을 준비합니다. </li><li> 소화 용액을 사용 SCIS에 헹궈 LMMP 장소 세그먼트미안하다이 작은 조각으로 LMMP을 싹둑. </li><li> ° C 물 목욕 셰이커 37 60 분 가볍게 carbogen 함께 부풀어 오른되는 동안의 다이제스트 LMMP. </li><li> 소화가 완료된 후, 원심 분리기 356 XG에서 13 분 동안 원심 분리하여 세포를 수집 4 ° C로 냉각 </li><li> 이 시점에서 모든 절차는 세포 배양 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야합니다! 모든 시약 및 컨테이너를 사용하기 전에 소독해야한다. </li><li> 원심 분리하는 동안, 1 mL를 배치하여 0.05 %의 트립신 용액을 제조 0.25 % 트립신을 따뜻하게하고 4 ML은 멸균 50 ML의 세포 배양 관에 HBSS를 따뜻하게. </li><li> 원심 분리 후 제거하고 상층 액을 버린다. 진공 청소기를 사용하지 마십시오,이 가능성이 낮은 원심 분리 속도에 의한 세포 펠렛을 빨아 것입니다. 조심스럽게 0.05 % 트립신 용액 5ml와 깨​​끗한 튜브에 세포 펠렛과 장소를 제거합니다. </li><li> 37 7 분간 흔들어 ° C의 물을 욕조에 0.05 % 트립신 용액에 세포를 소화. 7 마일을 초과하지 않도록N 총 트립신 치료 나 신경의 멸망. </li><li> 트립신 처리의 7 분 후 차가운 린스 미디어 10 mL로 트립신을 중화. </li><li> 356 X g에서 13 분 동안 세포를 원심 분리기. 제거하고 용지를 버리십시오. </li><li> 원심 분리하는 동안 멸균 15 ML의 세포 배양 튜브의 상단에 살균 Nitex 메쉬 부분을 균형. </li><li> 원심 분리 후 제거하고 상층 액을 버린다. 3 ML 완전한 신경 세포 미디어 triturating으로 부드럽게을 Resuspend 세포 혼합물. 이 단계 세포 혼합물이 분쇄되는 미래의 모든 단계에서 기포가 발생하지 않도록. 모든 triturations 매우 조심스럽게 수행해야합니다. 깨끗한 15 ML 세포 배양 튜브에 Nitex 메쉬를 필터링 셀 솔루션입니다. </li><li> 옵션 : 모자 세포 배양 튜브와 30 분 동안 온화한 회전 및 기울이기와 냉장 훌라 믹서 장소 (또는 회전을 제공하는 믹서). 이 단계는 선택 사항이지만 권장됩니다. </li><li> 선택 사항 : 훌라 믹서 한 후, 세포를 씻어 2 ML 차가운 린스 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 원심 분리하여 세포를 (8 분 356 XG) 수집합니다. 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> 1,200 μL 완전한 신경 미디어 세포를 resuspend을. 부드럽게 1 ML 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 세포를 씹다. 공기 방울을 생성하지 않습니다. 대부분의 덩어리가 깨진되고 세포가 액체로 중단 될 때까지 천천히 부드럽게 피펫. </li><li> 미리 코팅 된 유리 커버 슬립을 포함하는 12 우물 각각에 완전한 매체 750 μl를 추가하고 분쇄​​ 세포 용액 100 μL를 추가합니다. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에서 뉴런을 배양한다. </li><li> 전지 매체 2 일 간격의 절반을 변경합니다. </li><li> 뉴런은 1 일 이후에 전기 생리학 레코딩을위한 준비 - 문화 2 일. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 큰 경쟁 관심이 없는지 선언합니다.

사용 동물 이 프로토콜은 스위스 웹스터 마우스에 최적화되어 있습니다. 그러나,이 방법은 쥐와 같은 다른 작은 포유 동물과 생쥐의 다른 변종에 쉽게 적응할 수있다. 우리는 성공적으로 C57 마우스 및 μ-아편 수용체 녹아웃으로 예비 고립감을 수행했습니다. 그러나 생쥐의 다른 변종 GI 기관의 형태 학적 변화로 인해 문제가 될 수있는 것도 가능하다. 또한, 최종 분리의 뉴런의 결과 혼합에 영향을 미칠 수 LMMP 준비 13 일의 신경 회로에서 마우스 변종 사이의 알려진 차이 (대 글루 Balb / C C57BL / 6)가있다. 또한, 연령이 방법을 사용하면 연령과 관련된 신경 세포의 손실은 콜린성 뉴런과 해당 아교 세포에 특정한 myenteric 신경 얼기에서 발생, 고려되어야하며, 14 세 12 개월 빠르면 볼 수 있습니다. 마지막으로, 다른 시험편이 프로토콜을 채택 할 때동물의 ES는주의 myenteric 신경 얼기 오히려 원형 근육에 붙어 ...

장용 신경계 (ENS)는 신경 및 위장 (GI) 요로의 전체 길이를 실행하는 아교 세포의 광대 한 네트워크이다. ENS는 기능적으로 연동, 액체 흡수 / 분비, 자극의 감각 등 (검토를 위해 1 참조) 등의 소화의 모든 측면을 제어합니다. 그것은 척수에있는 이상 만 500 개 이상의 뉴런을 포함하고 뇌에서 발견 된 모든 신경 전달 물질의 클래스가 포함되어 있습니다. 또한, ENS는 중추 신경계 2에서 입력없이 반사적으로 작동 할 수 있다는 점에서 독특합니다. ENS의 이해는 정상적인 생리적 역할을 이해하지만, (의 히 르츠 프룽 질환), 인수 (샤 가스), 질병 상태 (당뇨병 위 마비)에 보조 약 선천성 할 수 있습니다 신경 병증의 다양한의 참여를 이해하기 위해뿐만 아니라 중요하다 유도 (아편 대장 증후군), 부상 (수술 후 장폐색) 1 때문이다. 또한, 장내 뉴런은 다시 할 수 있습니다바이러스 감염 (수두 대상 포진) 3 servoir. 때문에 뇌와 창자에있는 세로토닌의 높은 수준의 유사성, 중추 신경 계통의 결함을 치료 목적으로 약물은 종종 ENS 2 원치 않는 부작용이 있습니다. 그것은 알츠하이머 질환과 파킨슨 병 등 많은 신경 병증은 ENS 이러한 질병 4의 병인을 연구하는 접근 모델을 만들고, 중앙 신경에있는 자신의 모습 오래 전에 장내 신경 세포에서 유사한 세포 변화를 보여주는 것 또한 주목할 만하다. 따라서 ENS의 철저한 이해는 질병 상태를 이해하고 약물 부작용을 예방 / 예측 필요성이다. ENS의 뉴런은 전통적으로 8월 5일에서 7일까지 또는 양식 뉴런 wholemount 준비를 사용하여 기니 돼지에서 공부하고 있습니다. 뉴런이 큰 동물에서 연구 될 수있는 용이함에도 불구하고,이 모델 등 많은 한계가있다유전자 변형 종자,이 종의 특정 시약의 부족, 그리고 이러한 주제를 주문과 주택과 관련된 높은 비용의 부족. 쥐 장용 신경계 모델의 개발 시스템, 세포 배양 기술과 함께 사용할 수있는 다른 설치 방법의 광대 한 배열, 그리고 기니 돼지 모델에 대한 유효성 검사를 제공하는 기능 중 다양한 노크의 고유 한 장점을 가지고 . 창자의 연동 작업을 주로 담당하는 외부 myenteric 신경 얼기 (경도와 원형 근육 사이)뿐만 아니라, 점막과 점막 플렉시 (: ENS는 위장관의 길이를 실행하는 세 가지 플렉시으로 구성되어 있습니다 주로 액체 흡수 / 분비 자극 1의 검출을 제어 점막, 각각) 아래에서 발견. 이 방법은 필링으로 세로 근육 / myenteric 신경 얼기 (LMMP) 준비의 격리로 시작GI 기관의 외부 근육 층 호텔 전문가. 이 극적으로 점막 층이 분리에 관여 할 때 발생하는 오염 문제에 아래로 잘라냅니다. 결과적으로,이 과정은 오히려 ENS의 분비 활동보다 운동성 신경 제어의 연구에 이상적입니다. 방법은 여기에 장내 뉴런과 교세포의 혼합 배양 결과를 발표했다. 뉴런의 적어도 두 가지 유형이 존재 이전의 전기 생리 및 면역 세포 관찰 9를 기준으로합니다. 아교 세포의 존재는 그들이 자신의 권리 연구하는 중요한 세포 유형뿐만 아니라이기 때문에 매우 유익하지만 그들은 장내 신경 (10)의 생존에 기여하고 신경 세포 표면에 11 고유 수용체의 발현을 유지한다. 또한, 장내 아교 세포의 결함은 &#39;신경 gliopathies&#39;12 만들어 낸 이상한 위장 운동성 질환 상태로 이어질 수 있습니다. 따라서 ENS 문화는 여기에 제시된 연구조사 익은 여러 가지 세포 유형의 esults. 이 방법론의 장점은 격리, 저렴한 도구 요구 사항 및 경험 실험실 요원에 의해 기술을 마스터하는 짧은 시간의 용이성이다. 방법의 한계는 전반적으로 낮은 세포 높은 조직 볼륨에서 수율 및 점막 및 점막하 플렉시에서 ENS 뉴런의 배제를 이용하실 수 있습니다. 이 절차는 전기 생리학, 면역, 단일 셀 PCR 및 기타 방법론 전문 학자에 매우 유용 할 것입니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>폴리-D-라이신</td><td>시그마</td><td>P6407- 5 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24-웰 세포 배양 플레이트</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td>어떤 브랜드든 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences</td><td>354 232</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>실험실에서 준비할 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml 멸균 원심분리기 튜브</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>모든 브랜드</td></tr>의 <tr><td>50 ml 멸균 원심분리기 튜브</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>모든 브랜드</td></tr>의 <tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-212</td><td>MW 58.44</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>MW 74.55</td></tr><tr><td>NaH2PO4 .2H2O</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S369-3</td><td>MW137.99</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>MW 120.4</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-5KG</td><td>MW 84.01</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td>MW 180.16</td></tr><tr><td>CaCl22H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>MW 147.02</td></tr><tr><td>F12 미디어</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>품질 생물학 Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>어떤 브랜드의</td></tr><tr><td>항생제/항진균제를 사용할 수 있습니다. 100x 액체</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Neurobasal A 매체</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>200 mM L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>신경교세포 유래 신경영양인자(GDNF)</td><td>신경학</td><td>PR27022</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sharp-Pointed 해부 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td> 어떤 브랜드의 해<td></td></tr><tr><td>부 조직 집게</td>를 사용할 수 있습니다 <td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>어떤 브랜드의</td></tr><tr><td>Cotton-Tipped Applicators</td>를 사용할 수 있습니다 <td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>어떤 브랜드도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>250 ml 졸업 유리 비커</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td>어떤 브랜드를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>2 L 유리 Erlenmyer 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-500-2000</td><td>모든 브랜드를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>플라스틱 막대 (어린이용 페인트 브러시)</td><td>Crayola</td><td>05 3516</td><td>모든 브랜드를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN 3156</td><td>5% CO2</sub</td></tr><tr><td>>10 ml Leur-lock 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td>모든 브랜드를 사용할 수</td></tr><tr><td>있습니다. 21 G x 1 1/2 in. 하이포더믹 니들</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>어떤 브랜드든지 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Collagenase type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>미국 생물 분석</td><td>AB00440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2 ml 마이크로 원심분리기 Eppendorf 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-864-252</td><td></td></tr><tr><td>Nitrex Mesh 500 &micro; M</td><td>Elko Filtering Co</td><td>100560</td><td>모든 브랜드를 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>피펫 세트</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-377-328</td><td>모든 브랜드를 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Sharpeining Stone</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9681212</td><td>모든 브랜드를</td></tr><tr> 사용할 수 있습니다<td colspan="4">Equipment</strong</td></tr><tr><td>>LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood)</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 브랜드</td></tr><tr><td>10 L 쉐이킹 워터배스</td><td>Edvotek</td><td>5027</td><td>어떤 브랜드의</td></tr><tr><td>마이크로센트리퓨즈를 사용할 수 있습니다. 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td>은 <td>크기의 어댑터를 가진 단일 대형 원심분리기를 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Allegra 6 시리즈 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>어떤 브랜드의</td></tr><tr><td>HuluMixer Sample Mixer</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td>를</td></tr> 사용할 수 있습니다.<tr><td>AutoFlow 워터 재킷 CO2 인큐베이터</td><td>Nuiare</td><td>NU-4750</td><td>모든 브랜드를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>저울 Mettler Toledo</td><td>XS104</td><td>모든 브랜드를 사용할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

<em&gt; 체외</em성인 마우스 myenteric 신경총에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의&gt; 준비

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

장용 신경계의 기능적 위장 운동성을 제어 위장관의 길이를 실행하는 뉴런과 교세포의 광대 한 네트워크입니다. myenteric 신경 얼기의 신경 세포와 교세포의 혼합 인구의 분리 및 문화에 대한 절차를 설명합니다. 차 문화는 뉴런과 교세포 사이에 개발 연결을 7 일 이상 유지 될 수 있습니다. 첨부 myenteric 신경 얼기와 세로 근육의 스트립 마우스 회장 또는 결장의 기본 원형 근육에서 제거하고 소화 효소를 받게됩니다. 무균 조건에서 분리 된 신경 세포 및 교세포 인구는 펠릿 다음 원심 분리 내에 보존되어 coverslips를에 도금. 24-48 시간 내, 신경 돌기의 가지가 발생하고 신경이 팬의 연결을 마커로 식별 할 수 있습니다. 문화 이틀, 고립 된 뉴런 화재 활동 전위는 패치 클램프 연구에 의해 관찰했다. 또한, 장내 아교 세포는 지문을 확인해 될 수 있습니다GFAP 염색에 의해 IED. 가까운 동격의 뉴런과 교세포의 네트워크는 5 일 안에 형성 - 뛰기. 장내 뉴런은 개별적이어야하며 직접적 면역, 전기 생리학, 칼슘 이미징, 및 단일 세포 PCR 등의 방법을 사용하여 연구 할 수 있습니다. 또한이 절차는 유전자 변형 동물에서 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 수행하는 간단하고 저렴합니다. 우리는 더 나은 정상과 질병 상태에있는 ENS의 기능을 발견 할 수 있도록 전반적으로,이 프로토콜은 쉽게 조작 방식 장용 신경계의 구성 요소를 노출합니다.

<html> LMMP - 유래 세포, 뉴런과 다른 세포 유형의 직후 격리 쉽게 분명하지 않습니다. 생활은 불명료 한 표현형의 원형 세포뿐만 아니라 불완전하게 소화 조직 조각과 결합 조직에서 조직 암성로 볼 수 있습니다. 이 표류가없는 관심과 크게 이틀 첫 번째 미디어의 변화와 함께 제거됩니다. 건강한, 생존 세포도 제거되므로이 전에 슬라이드를 청소하지 마십시오. 문화 한 하루 후, 뉴런은 신경 돌기 가지를 표시하기 시작합니다. 뉴런의 특정 식별 여전히이 시간에 불명료 할 수 있습니다. 세포 실험 챔버로 전송하기에 충분한 접착을 제공, 그들은 문화 중 하나 하루 전기 생리학 연구를위한 준비가 될 것입니다. 5 - 그러나, 세포는 약 일 2 ~ 문화와 기능 연구를위한 이상적인 (전기 생리학, 칼슘 이미징)의 두 일 후에 더 자기편이다. ENT &quot;&gt; 신경 세포의 형태 학적 특징은 문화에서 약 일주일 (그림 1) 이후 뚜렷한됩니다. ...

우리는 장용 신경계의 신경 세포 및 교세포 구성 요소의 직접적인 연구를위한 세포 배양 프로토콜을 보여줍니다. coverslips는에 신경 / glia의 혼합 문화, 면역 전기 생리학, 개별 신경 세포와 아교 세포 기능을 검사 할 수있는 기능을 제공하는 성인 마우스 myenteric 신경 얼기에서 준비가되어 있습니다<em&gt; 등</em&gt;.

<em&gt; 체외</em성인 마우스 Myenteric 신경총에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의&gt; 준비

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

이 절차의 전반적인 목표는 성체 마우스의 근층신경총(myenteric plexus)으로부터 기능적으로 생존 가능한 뉴런과 CLIA를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 멸균된 세포 배양 표면을 polylysine과 laminin으로 코팅함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 근층신경총 분리를 위한 용액과 수술 부위를 준비하는 것입니다.다음으로, 위장관을 제거하고 원하는 구간을 분리하여 종단근 신경절하 신경총(longitudinal muscle myenteric plexus, LMMP) 표본을 제작합니다. 마지막 단계로 LMMP를 콜라게나아제와 트립신으로 순차적으로 소화시킨 후, 코드가 부여된 세포 배양 표면에 세포를 도말합니다. 최종적으로 전기생리학, 면역세포화학 및 단일 세포 PCR을 통해 장 신경세포, 글리아세포 또는 이 두 세포 유형 간의 상호작용 효과를 연구할 수 있습니다.본 절차의 시연은 모든 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Trisha Har Smith가 진행하며, 모든 실험실의 박사 과정 후보자인 Joy Gombe가 보조합니다. 기존 기술과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 뉴런과 글리아(glia)가 성체 마우스에서 유래한다는 점입니다. 이를 통해 완전한 기능을 갖춘 뉴런과 글리아를 얻을 수 있으며, 이는 잠재적으로 유전자 변형 동물로부터 유래될 수 있습니다.이 방법은 뉴런의 전기적 특성에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 면역 세포 화학, 단일 세포 PCR 및 실시간 칼슘 이미징과 같은 다른 방법론에도 적용될 수 있습니다. 안락사시킨 마우스를 수술대 위에 등으로 누운 자세로 배치하여 이 절차를 시작하십시오.다음으로, 70% ethanol로 복부 피부를 세척합니다. 그런 다음 핀셋으로 피부를 들어 올리고 가위로 복강을 절개하여 내부 소화 기관이 드러나게 합니다. 그 후, 회장(ileum)의 일부를 들어 올려 장간막을 노출시킵니다.위장관을 제거하고 가위로 장간막을 자릅니다. 그런 다음 회장과 결장을 조심스럽게 분리하여 풉니다. 전체 장의 길이가 다 풀린 후에는 회장과 결장에서 장간막이 당겨지지 않도록 주의하십시오.위의 원위부와 맹장의 근위부 사이의 장을 절단하여 회장을 제거합니다. 이 과정은 맹장의 원위부부터 항문의 근위부까지 결장을 제거하여 결장 조직으로도 수행할 수 있습니다. 다음으로 회장을 세 개 이상의 큰 조각으로 절단합니다.모든 분변 물질이 별도의 폐기물 용기로 제거될 때까지 장 섹션에 Krebs 용액을 묻혀 부드럽게 문지릅니다. 세척된 섹션을 'clean'이라고 표시된 Krebs 용액 용기에 넣고, 회장 전체가 세척될 때까지 이 과정을 반복합니다. LMMP를 제거하기 위해, 회장을 2~4cm 길이의 작은 분절로 자릅니다.그 후, 회장 분절을 플라스틱 또는 유리 막대에 배치합니다. 회장은 헐겁거나 팽팽하지 않게 막대에 딱 맞게 고정되어야 합니다. 엄지손가락으로 튜브를 막대에 살짝 눌러 고정하여 위장관이 막대 주변에서 회전하는 것을 방지하십시오.그런 다음 핀셋을 사용하여 위장관에 여전히 붙어 있는 장간막 조각들을 조심스럽게 제거합니다. 그 후, 분절의 상단에서 하단까지 장간막이 부착되어 있던 전체 라인을 따라 핀셋의 끝부분으로 부드럽게 문질러 LMMP를 하부의 환상근으로부터 분리합니다.그 다음, 종주근에 조심스럽게 틈을 만듭니다. 그런 다음 Crebs 용액을 적신 면봉을 사용하여 틈의 상단부터 종주근을 부드럽게 떼어냅니다. 이때 매우 가벼운 압력을 가하면서 아주 가볍게 수평으로 긁어내어 종주근이 환상근에서 막 분리되기 시작하도록 합니다. 이 과정을 장간막 부착점을 따라 스트립 전체 길이에 대해 수행합니다.다음으로, 위에서 아래로 그리고 다시 위로 이동하며 GI tube 주변을 조심스럽게 작업합니다. 이렇게 하면 longitudinal muscle이 tube 전체 둘레에 걸쳐 circular muscle로부터 천천히 분리됩니다. 작업이 완료되면, LMMP가 남은 GI tube에서 자연스럽게 떨어져 나옵니다.그런 다음 결과물인 세로 근육(longitudinal muscle)의 얇은 조각을 LMMP라고 표시된 비커에 넣고, 이 절차의 모든 세그먼트에 대해 동일한 과정을 반복합니다. 세척된 LMMP 세그먼트들을 소화액에 넣습니다. 그 후 가위를 사용하여 LMMP를 아주 작은 조각으로 자릅니다.다음으로, 60분 동안 소화시킵니다. 쉐이커가 장착된 37 °C 항온수조에서 카보젠(carbogen)을 부드럽게 버블링하며 진행합니다. 소화가 완료되면, 원심분리기를 사용하여 356 Gs에서 8분 동안 원심분리하여 세포를 회수하고, 4 °C로 냉각합니다.그동안 세포 배양 후드 내에서 멸균된 50 mL 세포 배양 튜브에 가온된 0.25% trypsin 1 mL과 가온된 HBSS 4 mL을 첨가하여 0.05% trypsin 용액을 준비합니다. 원심분리 후 상층액을 버리고 세포 펠릿을 조심스럽게 제거하여 0.05% trypsin 용액 5 mL이 들어 있는 깨끗한 튜브에 옮깁니다. 다음으로, 37 °C 항온수조에서 7분 동안 흔들어주며 0.05% trypsin 용액으로 세포를 처리하고, 10 mL의 차가운 세척 배지로 trypsin을 중화합니다.트립신 처리를 7분간 수행한 후, 356 gs에서 8분 동안 세포를 원심 분리합니다. 그동안 멸균된 15 ml 세포 배양 튜브 상단에 멸균된 TX 메쉬 부분을 균형 있게 배치합니다. 원심 분리가 끝나면 상층액을 제거하고, 3 ml의 용액으로 가볍게 팅킹하여 세포 혼합물을 재현탁합니다.완전 뉴런 배지. 기포 생성을 방지하기 위해 모든 조작은 매우 부드럽게 수행해야 하며, 그 후 세포 용액을 NYX 메쉬로 여과하여 15 milliliter의 깨끗한 세포 배양 튜브에 옮깁니다. 356 gs에서 8분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.그 후, 상층액을 제거하여 버립니다. 세포를 1200 µL의 완전 신경세포 배지(complete neuron media)에 다시 부유시킵니다. 다음으로, 1 mL 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 세포를 부드럽게 파이펫팅합니다.기포가 생기지 않도록 주의하며, 대부분의 덩어리가 부서지고 세포가 액체에 부유할 때까지 천천히 그리고 부드럽게 피펫팅하십시오. 이제 코드가 표시된 유리 커버슬립이 들어 있는 12개의 웰 각각에 완전 배지 750 µL를 추가합니다. 그런 다음 정해진 농도의 세포 용액 100 µL를 추가하십시오.뉴런을 37°C, 5% 이산화탄소 조건의 세포 배양 인큐베이터에서 배양합니다. 이틀마다 배양액의 절반을 교체합니다. 배양 후 1~2일이 지나면 뉴런의 전기생리학적 기록이 가능합니다.여기에는 장 신경세포의 면역조직화학적 특성 분석 결과가 제시되어 있습니다. 마우스에서 분리한 회장 종주근의 전층 표본을 공초점 현미경으로 관찰하여, 신경세포 특이적 beta three tubulin 염색 양상을 확인하였습니다.이들은 LMMP 조제물에서 분리된 세포들로, cal binding에 양성 반응을 보인 뉴런을 포함하고 있으며, 여기에 제시된 글리아 세포는 글리아 특이적 마커인 GFAP로 시각화되었습니다. 그러나 1차 항체를 생략했을 때는 염색이 나타나지 않았습니다. 여기 마우스 종단근에서 분리되어 서로 밀접하게 인접하여 성장하고 있는 뉴런과 글리아가 있습니다.공초점 현미경 이미지는 녹색 뉴런과 빨간색 ggl이 서로 인접하여 쉽게 성장하며, in vitro에서 상호작용하는 것으로 보임을 나타냅니다. 이 그림은 전류 클램프 모드에서 배양된 장 뉴런과 CLIA의 전기생리학적 특성을 보여줍니다. 모든 뉴런은 전류 주입 시 활동 전위를 나타냈습니다.CLIA는 활동 전위를 생성하지 않지만, 전류 주입에 반응하여 큰 전기적 전위(electrotonic potentials)를 나타냅니다. 마우스 회장에서 배양된 뉴런은 전기생리학적으로 불균일한 집단입니다. 전류 클램프 모드에서 뉴런에 0.09 nano amps의 전류를 주입하면 활동 전위가 발생합니다.A HP 음성 뉴런은 자극 후 즉시 휴지 막전위로 돌아갑니다. 반면 A HP 양성 뉴런은 자극 후 휴지 막전위가 기선 아래로 떨어졌다가 서서히 초기 값으로 돌아오는 A HP를 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 4시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 실험 절차를 수행할 때, 유리 기구와 수술 도구를 최대한 깨끗하게 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 본 절차 이후에는 세포를 부드럽게 반복적으로 세척하고 기포를 제거하며, 2일마다 세포 배양 배지의 절반을 교체하십시오. 장내 이온 채널이 약물 처리에 어떻게 반응하는지와 같은 추가적인 질문에 답하거나, 뉴런과 글리아의 단백질 발현 및 발달 후 다양한 처리에 의해 이 두 세포 유형의 상호작용이 어떻게 변화하는지 알아내기 위해 전기생리학 및 면역세포화학적 방법들을 수행할 수 있습니다.이 기술은 신경생물학 분야의 연구자들이 유전자 변형 동물을 통해 신경병증의 기본 기능과 장 신경계의 신경병증을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 성체 마우스 장 신경계의 TER 신경절에서 뉴런과 글리아를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

척수에서 마우스 배아 motoneurons를 분리의 대체 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 계정에 렉틴은 낮은 친화 신경 성장 인자 수용체 p75NTR에 바인딩할 수있다는 사실이 걸립니다. 이 렉틴과 기반 preplating는 p75NTR에 대한 특정 항체와 비슷한 정화 수 있습니다.

마우스 배아의 Motoneurons의 렉틴 기반 격리와 문화

이 비디오는 쥐 장의 점막하 및 판막에서 장 신경교세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 점막하 및 얇은 판 propria 조직을 추출하고, 장 신경교세포를 분리하고, 코팅된 웰 플레이트에서 세포를 배양하여 장 신경교세포 배양을 확립하는 단계를 간략하게 설명합니다.

쥐의 점막하부(submucosa and lamina propria)에서 장 신경교세포(enteric glial cells)를 분리(isorating enteric glial cells from the submucosa and lamina propria of a mouse)

근육 감각 신경은 proprioceptor 신호에 참여하고 또한 신진 대사 상태 및 상해 관련 이벤트를보고있다. 우리는 스트레치 활성화 근육의 심성에 대한 연구를위한 체외 근육 - 신경 준비 성인 마우스를 설명합니다.

체외 성인 마우스 근육 - 신경 준비

이 비디오는 시험관 내 마우스 결장직장 신경 제제에서 단일 섬유 전기생리학적 기록을 수행하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

마우스 대장 수입 성의 엔딩의 생체 기능 특성에

장 신경계(ENS)는 장 반사를 제어하는 장 벽에 위치한 뉴런과 신경교세포의 네트워크입니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 이미징을 사용하여 ENS의 실시간 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 기록하는 방법을 설명합니다.

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

장 신경계는 장에서 증식하고 이동하고 군체화하는 신경능선세포에 의해 형성됩니다. 신경능선세포(neural crest cell)는 신경전달물질 표현형에 특이적인 마커를 가진 뉴런으로 분화합니다. 이 프로토콜은 장 신경계 신경전달물질 발현을 시각화하기 위해 쥐 배아 위장관을 해부, 고정 및 면역 염색하는 기술을 설명합니다.

쥐 장내 신경 시스템 개발을 시각화하는 면역 염색

여기, 우리 장 submucosa 순차적 EDTA 외피를 사용 하 여 divalent 양이온 그리고 외피 비 효소 세포 복구 솔루션에 킬레이트 하에서 장 glial 세포의 설명. 폴 리-D-리 신과 laminin에 결과 세포 현 탁 액을 도금 기능 분석을 위한 submucosal glial 세포의 매우 풍부한 문화에 발생 합니다.

Submucosa 및 성인 마우스의 Lamina Propria 장의 Glial 세포의 고립

여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

여기에서는 마우스 CNS로부터 다중 신경교 세포 집단의 시험관 내 분리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 국소 미세아교세포, 희소돌기아교세포 전구체 세포 및 성상세포를 분리하여 다양한 배양 시스템에서 각각의 표현형을 연구할 수 있습니다.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

이 프로토콜은 성체 마우스 척수에서 정제된 성상교세포와 미세아교세포를 분리하여 RNA 분석 및 세포 배양과 같은 후속 응용 분야를 용이하게 합니다. 여기에는 분리된 세포의 품질과 수율을 모두 향상시키기 위해 고안된 상세한 세포 해리 방법 및 절차가 포함됩니다.

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies( 체외 분석 및 전사체 연구를 위한 성인 마우스 척수에서 순수 성상교세포 및 미세아교세포의 분리)

배우세요 성체 마우스 장신경총에서 신경세포와 신경교세포를 분리하는 세포 배양 방법입니다. 이 기술은 전기생리학 및 면역세포화학 분석을 통해 장-뇌 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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