Name: 공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-08T19:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 학습하세요 공초점 빛 시트 현미경을 이용하여 전체 마우스 두뇌를 마이크론 규모 해상도로 광학 단층 촬영하는 방법을. 이 기법은 신경과학 연구에서 뉴런 분포를 정밀 분석하는 데 활용됩니다.

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이러한 결과로 이어지는 연구는 N 부여 계약에 따라 유럽 연합의 제 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)로부터 자금을 받았다. 228334과 241526. 이 연구 프로젝트는 인간 프론티어 과학 프로그램의 연구 보조금 (RGP0027/2009)에서 지원하고있다 플래그십 프로젝트 Nanomax의 프레임 워크의 교육, 대학과 연구 이탈리아 교육부와의 틀에서 건강 이탈리아 교육부 &quot;줄기 세포는 제안에 대해 전화&quot;. 이 연구는 &quot;접대 카사 디 Risparmio 디 피렌체&quot;에서 지원 ICON 재단의 연구 활동의 프레임 워크에서 수행되었습니다.

1. 조직의 제조 및 저장 <ol><li> 0.01 M PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 100 ㎖ 다음에 20 ml의 0.01 M 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 솔루션, 표준 transcardial 관류 (13)를 통해 마우스의 뇌를 수정. 조심스럽게 7.6 두 솔루션의 pH를 조정한다 : pH가 약간 낮은 값은 EGFP의 형광을 해소 할 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에서 파​​라 포름 알데히드 4 %에서 하룻밤을 절제 뇌를 사후 수정 </li><li> 4 ° C에서 0.01 M PBS에 0.​​01 M PBS 및 저장에 두 번 (30 분마다)를 씻어 </li></ol> 2. 탈수 및 지우기 참고 :. 탈수 및 삭제를위한 프로토콜은 밀접하게 베커 등 (10)에 의해 설명 된 다음 <ol><li> 강력하게 채도를 사용하여 기본 활성 산화 알루미늄 (활동 등급 브록 I, THF 약 250g / L)와 XFP 형광, 필터 THF를 해소 탈수 용매 (테트라 하이드로 퓨란, THF)에서 과산화물을 제거하려면열 그래피 참조. 과산화물 제거를 줄일 수있는 열 균열 마십시오. </li><li> THF 이미 여과 전에 안정화 된 경우에도, 최종 용액에 안정제 (부틸 화 히드 록시 톨루엔, 250 ㎎ / L)를 첨가. 안정제없이 THF 과산화물 많은 양의 개발 수 있으며, 폭발 위험 할 수 있습니다 안정제는 산화 알루미늄에 의해 유지 사실이다. </li><li> 다음, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 96 %, 100 %, 1 시간마다, 100 % 밤새 : 전체 마우스 순수 THF의 등급 시리즈 뇌 탈수. 회전하는 바퀴에 샘플 병을 놓습니다. 빛의 노출을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 감싸줍니다. </li><li> 산화 알루미늄과 청산 용매 (디 벤질 에테르, DBE)를 필터 (활성화 기본, 활동 성적 브록 I, DBE의 약 250 G / L) 필터링 깔때기를 사용하여. </li><li> 100 % DBE에서 샘플을 취소합니다. 3, 6 시간 후 솔루션을 변경합니다. </li></ol> 3. 설치 표본 <ol><li> 뇌는 눈 (전형적으로 투명하게 보이는 경우두 번째 DBE 변경 후 으로 1 시간), 다음 방법 중 하나를 사용하여 흘린 이미징 플레이트에 마운트 : </li><li><ol><li> 직접 설치는 - 조심스럽게 조언 중 하나 (그림 3a)에 샘플을 뛰어. </li><li> 아가 디스크 - 팁에 6 % 아가로 오스 겔로 만들어진 디스크를 플 런지. 부드럽게 아크릴 접착제를 가진 아가로 오스 디스크에 샘플을 고정합니다 (그림 3B). 치료를 위해 약 1 분을 기다립니다. </li><li> 아가로 오스 비커 - 팁에 3 % 아가로 오스 겔 만든 비커 플 런지. 부드럽게 비커의 바닥 (그림 3C)에 샘플을 놓습니다. </li></ol></li></ol> 주 1 :이 그 전체 샘플을 이미징 중요한 경우 아가 비이커에 실장하는 것은 바람직 할 수 있어야하지만, 시험편을 둘러싼 아가 로스 겔은 이미지 품질에 유해 할 수있는 추가적인 광 산란을 발생시킨다. 샘플의 작은 부분이 촬상 대상에서 제외 될 수있는 경우, 투기를 탑재 낫다아가로 오스 디스크에 직접 끝에 imen. 전자의 방법은 가장 (후각 전구의 일부를 이미징 또는 척수 제외) 수직 뇌를 유지하기 위해 수평 뇌 (뇌의 복부 나 등의 부분을 이미징 제외)​​, 후자를 유지하기에 적합합니다. 주 2 : 그것은 분명 투명 보이는 때까지 아가 로스 젤 (50 % 및 100 % 4 시간마다) THF와 탈수, 물을 준비하고 DBE 100 % 클리어 4 시간 동안이나해야한다. <ol start="3"><li> 이전의 방법 중 하나를 아래의 시험편을 장착 한 후, 핀셋을 이용하여 시료 챔버 내부 이미징 플레이트를 위치. 솔루션을 삭제와 챔버를 입력합니다. </li></ol> 4. 단층 촬영 준비 <ol><li> 가능한 한 많은 형광을 수집하는 슬릿을 제거합니다. </li><li> 광표백을 방지하기 위해 낮은 레이저 파워를 이용하여 시료를 조명. </li><li> 소프트웨어 기반의 마이크로 위치 syste을을 사용하여 세 방향에서 샘플을 이동m. 각 방향에 대한 샘플이 조명과 카메라 (그림 4a)의 시야 내에되는 최소 및 최대 좌표를 확인합니다. </li><li> &#39;사전 단층 촬영&#39;서브 루틴에 대한 매개 변수로 위의 좌표를 삽입합니다. 또한 단층 촬영에 사용될 인접한 스택 사이의 거리이고, z 방향의 전 단층 샘플링 단계를 지정. </li><li> (4.4)에 지정된 Z 샘플링과 모든 스택의 이미지를 수집하는 전 단층 촬영을 시작합니다. </li></ol> 주 : 수집 된 이미지는 시험편 형상 및 위치의 거친지도의 촬상 시간을 감소시키고, 따라서 photobleaching에, 실제로 시료에 의해 ​​점유 부피 단층 획득 제한 수 (도 4b)를 준비하는 소프트웨어에 의해 사용된다. 5. 단층 촬영 취득 <ol><li> 마이크로 위치 시스템을 이용하여 광 시트의 외부 시료를 이동. </li><li> Inc의rease 레이저 파워와 시야의 중심에만 고정 회선을 조명하기 위하여, 모든 주사 시스템의 동작을 멈춘다. </li><li> 슬릿을 장착하고 청소 솔루션에서 자기 형광 신호를 사용하여 정렬합니다. 당신은 명확하게보기의 필드의 중앙에 슬릿 라인을 볼 수 있습니다. </li><li> 주사 시스템을 다시 활성화하는 레이저 파워를 줄이고 마이크로 위치 시스템을 이용하여 광 시트 내부에 샘플을 이동. 슬릿 사용한 레이저 파워는, 빛의 공간 필터 블록시기 무시할 분획없이 사용 된 것보다 더 높을 것이다 유의. </li><li> 이미지가 명확하고 밝게 보일 때까지의 진폭을 조정하고 제어 소프트웨어와 함께 스캐닝 및 레드 스캐닝 시스템의 오프셋. </li><li> 실험에 적합한 Z 단계를 설정 한 후, 단층 수집 소프트웨어를 실행합니다. 볼륨은 많은 병렬, 부분 오버랩 스택 (도 5a)에 결상되고, 이미지는 저장됩니다계층 적 폴더 구조. </li></ol> 6. 바느질 및 시각화 <ol><li> 자동화 된 소프트웨어 (그림 4C)를 사용하여 합성 블랙 이미지와 함께 (수집의 동일한 유형 및 크기의 예 이미지들 -하지만 영 강도) 획득 볼륨을 작성합니다. 이 단계는 전체 체적 다루는 스티칭 소프트웨어 위해 필수적이다. </li><li> 시작 Vaa3D 소프트웨어 (자유에서 다운로드 <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> TeraStitcher 및 TeraManager 설치된 플러그인과 함께). </li><li> TeraStitcher 플러그인을로드합니다. 이미지가 볼륨이 들어있는 디렉토리를 선택 (참조에 대한 좌표계를 오른 손잡이) 축의 상대적 방향을 표시하고 복셀 크기. </li><li> 바느질의 첫 번째 부분을 실행합니다. 이 소프트웨어는 스택의 부부 사이의 상대 변위를 계산하고, 전체 최적의 placem를 찾을 것입니다모두 함께 스택에 대한 ENT (그림 5B). </li><li> 단일 해상도 또는 다중 해상도 형식으로 스티치 볼륨을 저장하기 위해 선택합니다. 후자는 TeraManager 플러그인으로 다중 해상도 시각화 할 수 있습니다. 높은 해상도 이미지는 수 기가 바이트보다 클 경우 두 경우 모두, 또한 양상에 저장 멀티 스택을 선택하고 개별 substacks의 크기를 지정한다. 이는 저장된 데이터에 효율적으로 액세스 할 수있게됩니다. </li><li> 바느질의 두 번째 부분을 실행합니다. 이 소프트웨어는 정렬 된 스택을 병합하고, 하나의 단일 또는 다중 스택 모드 (그림 5C 및 5D)에 저장됩니다. 끝에서 TeraStitcher 플러그인을 닫습니다. </li><li> TeraManager 플러그인을로드합니다. 다중 스택 다중 해상도 볼륨 폴더를 선택하고 복셀 크기를 표시하고 방향을 축. 볼륨이 최소 해상도로로드됩니다. </li><li> 높은 해상도로 확대하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭 modalit를 사용하여 랜드 마크를 선택Vaa3D의 Y를 선택한 후, 마우스 스크롤을 사용하여 확대. 또는 당신은 직접 마우스 오른쪽 클릭으로 확대 할 투자 수익 (ROI)을 선택하거나, 그 볼륨의 좌표를 지정할 수 있습니다. </li><li> 낮은 해상도로 확대하려면 마우스 스크롤을 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

화학 청소와 결합 CLSM은 형광 프로브, 단백질 중 하나 또는 합성 염료로 표지 전체 마우스 뇌의 신경 해부학을 연구 할 수있는 강력한 도구를 나타냅니다. 초점면 외부에서 방출 된 빛이 물리적 공간 필터에 의해 차단되어 있기 때문에 빛 시트 건축의 전형적인 높은 프레임 속도를 유지하면서, 고 대비 영상은, 두꺼운 표본 수있다. 설명 된 방법을 사용하는 경우를 처리하는 주요 문제는 대비의 극대화이다. 실제로, 가능 신호는 화학 및 광학 요소에 의해 모두 감소된다. 뷰의 화학적 관점에서, 유기 용매를 기반으로 소거 절차는 형광 단백질 및 다른 형광 염료 (7)로부터 방출 급냉있다. 베커 등. 10에서 설명한 바와 같이 용매의 여과, 과산화물을 제거하고, 용매 맑게 조직에서도 형광의 양호한 수준을 유지한다. 게시전체 쥐의 뇌를 처리 할 때 ED 물 기반의 청소 방법 (14)은 적어도 선형 광학 기술과, 형광 효율을 줄일 수 있지만, 가난한 투명성을 초래하지 않습니다. 한편, 순간 고 굴절률 (N ≈ 1.56) 사용한 해법을 맑게 보정 긴 작동 거리를 갖는 상업적인 목적은 없다. 따라서, 샘플이 침지되는 매체와 대물 설계 한 간의 굴절율 부정합이 강한 구면 수차를 일으킨다. 현미경의 해상도를 감소시키는 것 외에도, 이러한 수차는 광이 넓은 영역에 확산되어 있기 때문에, 이미지 세기 및 콘트라스트의 저하가 발생할. 이 문제에 대한 가능한 해결 방법은 적응 광학 (15) 및 / 또는 정적 비구면 보정기의 사용을 포함한다. 의 짧은 이후 이미지 콘트라스트와 강도의 모든 개선은 쉽게, 또한 영상의 속도에 영향을 미치는이미지 당 tegration 시간을 선택할 수 있습니다. 순간 CLSM은 100 밀리 초 (9)의 카메라의 노출 시간에 따라, 대략 106 μm의 3 / 초의 촬상 속도를 수득 할 수있다. 이 속도로 샘플 크기에 따라 1-3 일에서 이미지에 전체 마우스의 두뇌를 사용합니다. 이미지 품질에 큰 저하는 대부분 빛 때문에 시트 조명 (6)의 고유 저 광표백 같은 긴 영상 세션에 걸쳐 관찰되지 않지만, 오랜 시간이 하나의 마우스의 두뇌가 실제로 CLSM의 적용 가능성을 줄일 수있는 이미지를 필요로했다. 검출을위한 고속 카메라를 이용하여 결합 된 시스템 효율이 10 배 증가는, 기재된 프로토콜의 일상적인 사용을 허용하는, 몇 시간에 촬상 시간을 줄이는 것이다. 모든 상기의 제한에도 불구하고, 이하 마이크론 규모의 해상도로 전체 마우스 두뇌를 재구성하기 위해 조직의 허가 화학 청산에 결합 CLSM 영상주. 전체 뇌 영상에 대한 다른 광학 방법은 CLSM보다 더 높은 해상도를 여유가 있지만, 더 이상 준비 및 / 또는 영상 시간 2 ~ 4의 가격, 또는 스파 스 Z 샘플링 5. 이 문서에서 설명하는 방법은 형광 표지에 대해 서로 다른 전략과 함께 이용 될 수있다 : 형질 전환 동물 등 선택의 연결 부분 집합, 바이러스 성 형질 전환, 뇌실질 내 염료 주입, 형광 단백질을 표현 실제로, 동물 희생을 앞의 모든 염색 전략 CLSM과 호환 . , 염색의 그런 종류가 가까운 미래에 가능하면 어쨌든, CLSM으로 재구성 할 수있는 표본의 수는 훨씬 더 될 것입니다, 사실, 전체 마우스 두뇌의 사후 형광 라벨은 지금까지 입증되지 않은 잠재적으로 인간 뇌 조직 등. 결론적으로, 광 시트 공 초점 현미경은 TIS와 병용고소 개간 및 다중 해상도의 데이터 관리 연구원은 대부분의 실험실의 손에 잘있다 기술적 노력, 마이크론 규모의 해상도로 거시적 인 표본을 재구성하고 분석 할 수 있습니다. CLSM의 잠재적 인 응용 프로그램은 신경 과학에 국한되지 물론이지만, 16, 17 및 작은 동물 (18)의 해부학 배아로, 빛 시트 현미경은 이미 사용 된 모든 연구 분야에 걸쳐있다.

분자 및 세포 기전 뇌 기능에 대한 우리의 이해에 비해, 미세 신경 해부학에 대한 우리의 지식은 초기 단계 1에 여전히 보인다. 사실, 우리는 여전히 뇌 전반에 걸쳐 신경 인 somata 또는 장거리 돌기의 위치의 포괄적 인지도를 부족합니다. 사실, 많은 기술적 노력이 현미경 해상도로 마우스의 두뇌를 재구성하기 위해 헌신하고 있습니다. 수지 내장 샘플의 일련 절편에 따라 광학 방법 칼날 스캐닝 현미경 (KESM)로 2, 마이크로 광학 단면 단층 촬영 (MOST) 3 형광 MOST (fMOST) 4, 서브 마이크론 입체 해상도에게 제공 할 수 있습니다 전체 마우스 뇌의 영상. 그러나, 하나의 샘플의 제조와 촬상에 필요한 전체 시간은 이러한 방법의 실제적 적용을 제한하는 여러 주의 순서이다. 직렬 절편에 따라 또 다른 기술 (그러나 수지 포함시키지 않고), 시리얼 두광자 단층 촬영 (STP) 5, 높은 입체 이미지를 해상도 수 있습니다. 그러나,이 기술은 1 섹션마다 50 ㎛ 5를 수집, 단지 매우 드문 드문 샘플링 전체 마우스의 뇌에서 설명하고 있으며, 우리의 지식 STP는 아직 쥐의 뇌의 전체 샘플링 재건을 생산하지 않았습니다. 고속으로 세 가지 차원에서 전체 표본을 재구성하는 최첨단 광학 방법은 빛 시트 현미경 6입니다. 이 광학 방식에서 샘플을 빛의 얇은 시트를 조명하고, 형광 방출은 조명 평면에 수직 축을 따라 수집됩니다. 이러한 방식에만 포커스에 형광체는 흥분하고 높은 프레임 속도를 보장 넓은 필드 구성의 광학 절편을 달성하는 것이 가능하다. 굴절률 정합 액 7 물 대신에 기반 프로토콜을 취소에 결합 할 때, 빛 시트 현미경에 적용되었습니다전체 마우스 두뇌 8과 같은 거시적 인 표본. 그러나, 획득 된 영상을 흐리게 전체를 추가 - 초점 형광의 여기로 이어지는 빛 시트를 저하도 삭제 표본에 영향을 미치는 빛의 산란을 표본 유도. 만을 선택적 포커스에있는 광자를 수집하기 위해, 우리는 최근에 공 초점 검출 방식 9 빛 시트의 조명을 결합. 공 초점 빛 시트 현미경 (CLSM)에서 포커스 아웃 흩어져 광자가 선형 공간 필터 (슬릿) 사전 탐지 (그림 1)에 의해 거부됩니다. 광 시트 구조의 촛점 작동을 달성하기 위해, 조도는 주사선에 의해 생성 및 검출 경로 레드 스캐닝 시스템은 슬릿의 위치에 여진 주사선의 정지 화상을 작성한다. 셋째 스캐닝 시스템은 카메라 센서에 2 차원 화상을 재구성한다. CLSM 클리어 마우스의 100 % 대비 향상을 준다종래의 광 시트 현미경에 대하여 뇌, 10Hz의 프레임 속도를 유지하면서. CLSM으로는 Z 2 XY μm의 9 μM의 해상도로 전체 마우스 두뇌를 재구성하고, 하나의 형광 표지 된 신경 세포를 식별 할 수있는 충분한 대비가 가능합니다. 이 문서에서 우리는 CLSM와 마우스의 뇌를 재구성하는 실험 파이프 라인에 대해 설명합니다. 알데히드 고정 마우스의 뇌가 과산화없는 테트라 하이드로 퓨란의 등급 일련의 탈수 및 이후 베커 등. 10 클리어 표본에 의해 개발 된 프로토콜에 따라 과산화수소없는 디 벤질 에테르 (그림 2)에서 삭제하는 것은 조심스럽게 흘린에 장착 플레이트와 주문품 공 초점 빛 시트 현미경의 영상 실에 위치. 대안은 삭제 아가 로스 젤의 디스크 (그림에 접착 할 수 있으며, 샘플은 직접 플레이트 (그림 3a)의 선단에 급락하여 장착 할 수 있습니다3B) 또는 삭제 아가로 오스 겔 (그림 3C)으로 만든 비커의 캐비티에 배치. 많은 병렬 인접 스택이 모두 뇌 용적 (그림 4)을 충당하기 위해 취득으로 전체 뇌의 광학 단층 촬영은 다음을 수행합니다. 표본 위치 및 모양의 거친지도를 생성 사전 단층 샘플링은, 촬상에만 시료가 차지하는 부피에서 수행되도록 보장한다. 단층 촬영 스택은 이후 주문품 소프트웨어와 함께 스티치와 다중 해상도 계층 구조 (11)에 저장됩니다. 마우스의 뇌는 결국 프로토 타입 다중 해상도 구글지도처럼 시각화 소프트웨어를 탐색 할 수 있습니다. 이 두 소프트웨어 악기는 오픈 소스 플랫폼 Vaa3D 12 플러그인으로 통합되어 있습니다. 우리는 마침내 좋은 쥐 neuroanatom 공부에 설명 된 실험 파이프 라인의 기능을 설명하기 위해 마우스 두뇌의 대표 이미지를 보여예.

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수 정제</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4417_100TAB</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>한천 Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>과산화물이 없는 테트라하이드로푸란</td><td>시그마-알드리치</td><td>186562</td><td></td></tr><tr><td>산화알루미늄 활성화, 기본, Brockmann I</td><td>시그마-알드리치</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>디벤질 에테르</td><td>시그마-알드리치</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>부틸화 하이드록시톨루엔</td><td>시그마-알드리치</td><td>W218405</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 유형 III-A, 높은 EEO</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 접착제</td><td>Bostik</td><td>D2498</td><td></td></tr><tr><td>Vaa3D 소프트웨어</td><td>오픈 소스</td><td></td><td>자유롭게 다운로드 <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td></tr></tbody></table>

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

단일 셀 해상도에서 포유 동물의 뇌의 구조를 이해하는 것은 신경 과학의 주요 이슈 중 하나입니다. 그러나, 뇌 전체에 걸쳐 신경 소마와 전망을 매핑 여전히 이미징 및 데이터 관리 기술에 대한 도전입니다. 사실, 거시적 인 볼륨은 테라 바이트 범위의 데이터 세트를 생산, 적당한 시간에 높은 해상도와 콘트라스트 재구성 될 필요가있다. 우리는 최근 광학 방법 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)로 표지 전체 마우스 뇌의 마이크론 규모의 재건을 얻을 수 (공 초점 빛 시트 현미경, CLSM)를 보여 주었다. 빛 시트 조명 및 공 초점 검출을 결합, CLSM 고 대비 및 속도 거시적 삭제 표본 내부 깊은 영상을 수 있습니다. 여기에서 우리는 형광 단백질로 표지 전체 마우스 두뇌의 포괄적이고 사람이 읽을 수있는 이미지를 얻기 위해 실험을 할 파이프 라인을 설명합니다. 청산 장착 Procedures 함께 많은 병렬 인접 스택을 획득하여 전체 볼륨에 광학 단층 촬영을 수행하는 단계를 설명합니다. 우리는 여러 스택 및 다중 해상도 데이터 탐색의 스티치 있도록 오픈 소스 주문품 소프트웨어 도구의 사용을 보여 주었다. 모든 조롱박 세포가 선택적으로 표시되는 L7-GFP 유전자 변형 마우스, 및 임의의 스파 스의 연결 라벨을 특징으로하는 thy1-GFP-M 마우스에서 전체 뇌에서 소뇌 : 마지막으로, 우리는 뇌지도의 일부 예를 보여줍니다.

기술 된 프로토콜은 물리적 단면 처리를 필요로하지 않고, 마이크론 - 스케일 해상도 전체 쥐 뇌 또는 절제 부 하나와 함께 재구성하기 위해 사용될 수있다. 대표적인 결과로, 그림 6에서 L7-GFP 마우스 (산후 10 일)의 전체 소뇌가 표시됩니다. 이 동물의 모든 조롱박 신경은 EGFP으로 표시되어 있습니다. 우리는 확대하는 경우, 소뇌 피질의 전형적인 층상 구조는 (그림 7) 볼 수 있습니다. 또한 줌인 명확하게 각각의 조롱박 세포 소마 (그림 8)를 구별 할 수 있습니다. 설명 프로토콜은 이렇게 다양한 신경 발달 연구에서 신경 세포의 공간 조직을 선별하는 데 사용할 수 있습니다. 두 번째 대표적인 결과로, 우리는 성인 thy1-GFP-M 마우스의 unsectioned 뇌에서 이미지를 제시한다. 이 형질 전환 동물에서 EGFP는 임의의 스파 스의 연결 부분 집합으로 표현된다. 뇌의 오른쪽 절반은 그림 9에 표시됩니다. 로 우리더욱이 확대 및 추가 (10, 11 피규어), 신경 프로세스는 구별된다. 이 결과는 설명 프로토콜은 신경 퇴행성 질환의 마우스 모델에서 세포 해상도에서 전체 뇌 해부학을 공부의 가능성을 열어, 전체 성인 마우스 두뇌에서 마이크론 규모의 해상도의 영상을 수 있다는 점을 보여줍니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> 그림 1. 여기 경로를 보여주는 장치의 공 초점 빛 시트 현미경 (CLSM)의 광학 방식. () 상위 뷰. 488 nm의 다이오드 펌프 고체 (DPSS) 레이저에서 레이저 방출은 제 망원경으로 확장 및 시준 한 후, 빔의 강도를 조절하는 음향 광학 가변 필터 (AOTF)를 입력합니다. 이어서, 제 망원경은 또한 빔을 확장한다. (Y를 따라) 수직 갈보 거울은 수 검사<html> 검출 경로를 나타내는 장치의 시료 챔버 내부 렌즈에 의해 집광되어 오전. (b) 측면보기. 검출 목적에 의해 수집 된 광은 수직 갈보 미러에 의해 descanned 및 이동 여진 라인의 정착 화상의 제조, 렌즈에 의해 집광된다. 정착 화상의 위치에서 선형 공간 필터 (슬릿) 배치된다. 슬릿 후, 4F 렌즈계 안에 배치 갈보 미러는 전자 승산 전하 결합 소자 (CCD-EM)의 칩 상에 2-dimentional 화상을 재구성한다. 형광 대역 통과 필터는 검출 전에 여기 길잃은 빛을 제거합니다. 여기 검색, 밴드 패스 필터링 검출 빛의 대표 광선은 각각 파란색, 밝은 파란색과 녹색 광선에 의해 묘사된다. 실제로 현미경에 사용 된 모든 렌즈의 초점 거리가 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;jove_content 항상 &quot;&gt; <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> 그림 2. 표본을 취소합니다. 포름 알데히드 고정 마우스의 뇌, 4 ° C에서 PBS 0.1 M에 저장됩니다 (A), ((THF는, B) 및 이후 100 %의 디 벤질 에테르에 삭제 테트라 하이드로 퓨란의 등급 일련의 탈수 DBE , C). 탈수 단계는 일부 조직의 수축이 발생합니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> 그림 3. 표본 CLSM 이미징 설치. 삭제 뇌는 직접 (), 클리어 아가로 오스 디스크 (B)에 접착, 또는 삭제 아가로 오스 비커 (c)에 삽입 된 팁 장착 판에 뛰어들 수있다. 그림 4. 단층 취득. 사전 단층 루틴 샘플 뇌 (a) 화상에 모든 시료를 필요한 병렬 인접한 스택의 개수 및 길이를 정의하기 위해 함유 직방체 (b). 단층 촬영 후, 검은 색 이미지가 평행으로 가상 획득 볼륨을 완료하기 위해 생성된다 (C). <img alt="그림 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> 그림 5. 볼륨 바느질. 수집 이미지는 부분적 TeraStitcher 플러그인 (b)과의 정확한 정렬을 허용 (a) 서로간에 중첩 스택. 플러그인은 단일 스택 (C) 또는 다중 역 중 하나에 정렬 된 스택을 병합CKED (d) 다중 해상도 표현. <img alt="그림 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> 그림 6. 모든 조롱박 신경이 EGFP. 스케일 바, 1mm으로 표시되는 P10 L7-GFP 마우스, 전체 소뇌. <img alt="그림 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> 그림 7. 소뇌 피질. 스케일 바, 500 μM의 전형적인 층상 구조를 나타낸도 6에 도시 된 소뇌 부분의 줌인. <img alt="그림 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> 그림 8. 도 6에 도시 된 소뇌 부의 또한 줌 기능이. 조롱박 세포 소마 명확하게 구별 될 수있다ED. 스케일 바, 200 μm의. <img alt="그림 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> 그림 9. 스파 스 불특정 신경 EGFP 라벨. 스케일 바, 1mm 특징 성인 thy1-GFP-M 마우스에서 뇌의 오른쪽 절반. <img alt="그림 10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> 그림 10. 확대 - 그림 9의 절반 뇌의 일부를. 스케일 바, 200 μm의 해마와 피질의 일부를 표시합니다. <img alt="그림 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> 그림 11. 피질도 9에 도시 된 하프 뇌의 일부분의 또 줌인. 몇몇 신경 돌기 깨끗이 구별 될 수있다. 스케일 바, 50 ㎛.

이 문서에서 우리는 높은 해상도, 형광 표지 된 마우스의 뇌의 미세 뇌 해부학과, 재구성하는 전체 실험 절차를 설명합니다. 설명 프로토콜은 샘플 준비 및 청소, 영상, 데이터 후 처리 및 다중 스케일의 시각화를 위해 설치 표본이 포함되어 있습니다.

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 뇌 전체를 마이크론 수준의 해상도로 재구성하고 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 고정된 마우스 뇌의 tetrahedran 시리즈를 탈수시킵니다. 두 번째 단계는 Benzyl Ether를 사용하여 시료를 투명화하는 것입니다.다음으로, 공초점 라이트 시트 현미경을 사용하여 뇌를 촬영합니다. 마지막 단계는 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지 스택을 정렬하고 접합하는 것입니다. 최종적으로, 다중 해상도 시각화 도구를 사용하여 재구성된 이미지 볼륨을 탐색할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 공초점 현미경이나 광시트 현미경과 같은 다른 방법들에 비해 단 며칠 만에 마우스 뇌의 전체 부피를 영상화할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 뇌 전체에 걸친 다양한 신경세포 유형의 분포와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법이 뇌의 미세한 해부학적 구조에 대한 통찰력을 제공할 수 있을까요?이 방법은 생쥐 배아 또는 초파리에도 적용할 수 있으며, 이는 해당 절차가 재현 가능함을 입증합니다. 저희 실험실의 대학원생이 수행하였습니다. 이 프로토콜을 시작하려면, 경심장 관류를 통해 생쥐 뇌를 표준 고정하고, 탈수 및 투명화 작업을 수행하기 전에 하룻밤 동안 후고정하십시오.탈수 용매인 THF는 XFP 형광을 강하게 소광시키므로, 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 염기성 활성 산화알루미늄으로 과산화물을 제거하는 여과 과정을 수행하십시오. 이때 컬럼에 균열이 생기지 않도록 주의하여, 최종 용액의 안정제에 의한 과산화물 제거 효율이 떨어지는 것을 방지하십시오. 여과 전에 THF가 이미 안정화되어 있었더라도, 안정제는 산화알루미늄에 의해 제거됩니다. 안정제가 없는 THF는 다량의 과산화물을 생성할 수 있으며, 폭발 위험이 있어 위험하다는 점에 유의하십시오.다음으로, 순수한 물에서 THF 통합 시리즈의 전체 마우스 뇌를 탈수합니다. 그다음 샘플이 담긴 바이알을 회전 휠에 올려 빛에 노출되지 않도록 합니다. 바이알을 알루미늄 호일로 감쌉니다.마지막으로, 여과 깔때기를 사용하여 알루미늄 옥사이드로 투명화 용매를 여과합니다. 그런 다음 100% DBE에서 시료를 투명화하며, 뇌가 투명해 보이면 3시간과 6시간 후에 용액을 교체합니다. 일반적으로 두 번째 DBE 교체 1시간 후, 본 영상에서 제시한 방법 중 하나를 사용하여 기울어진 이미징 플레이트에 시료를 고정합니다.Agros 디스크를 이용한 직접 마운팅 또는 agro 스피커를 이용한 마운팅의 경우, 직접 마운팅을 위해 샘플을 팁 중 하나에 조심스럽게 플런지(plunge)하여 aros 디스크 플런지를 사용합니다. 6% aros 겔로 제작된 디스크를 팁 위에 올립니다. 그런 다음 아크릴 접착제로 샘플을 agros 디스크에 조심스럽게 고정하고, 마운팅을 위해 약 1분 동안 경화될 때까지 기다립니다.agros 비커 플런저를 사용하여 3% agros 겔로 제작된 비커를 팁 위에 올립니다. 그런 다음 샘플을 비커 바닥에 조심스럽게 배치합니다. 이러한 방법 중 하나를 사용하여 시료를 고정한 후, 핀셋을 사용하여 시료 챔버 내부에 이미징 플레이트를 위치시킵니다.그런 다음 챔버를 투명화 용액으로 채웁니다. 다음으로 토모그래피를 준비합니다. 먼저, 가능한 많은 형광을 수집하기 위해 슬릿을 제거한 후, 낮은 레이저 출력으로 시료를 조사합니다.광퇴색을 방지하기 위해 소프트웨어 제어 마이크로 포지셔닝 시스템을 사용하여 시료를 x, y, z 세 방향으로 이동시킵니다. 각 방향에 대해 시료가 카메라의 시야 내에 있으면서 조명되는 최소 및 최대 좌표를 확인합니다. 그런 다음 결정된 좌표를 프리 토모그래피 서브루틴의 파라미터로 입력합니다.또한 토모그래피에 사용할 인접 스택 간의 거리와 Z축 방향의 프리 토모그래피 샘플링 단계를 지정하십시오. 마지막으로, 이전 단계에서 지정한 Z 샘플링 파라미터에 따라 모든 스택의 이미지를 수집하는 프리 토모그래피를 시작하십시오. 획득을 시작하려면 먼저 마이크로 포지셔닝 시스템을 사용하여 샘플을 라이트 시트 외부로 이동시키십시오.그런 다음 레이저 출력을 높이고 모든 스캐닝 시스템의 움직임을 멈추어 시야 중심의 고정된 라인만 조명되도록 합니다. 다음으로 슬릿을 장착하고 투명화 용액의 자가형광 신호를 이용하여 정렬합니다. 이제 시야 중심에 슬릿 라인이 명확하게 보여야 합니다.이제 스캐닝 시스템을 다시 활성화하십시오. 레이저 출력을 낮추고 마이크로 포지셔닝 시스템을 사용하여 샘플을 라이트 시트 내부로 이동시킵니다. 슬릿을 사용할 때의 레이저 출력은 슬릿을 사용하지 않을 때보다 더 높게 설정됨에 유의하십시오.공간 필터가 상당한 양의 빛을 차단하므로, 이미지가 선명하고 밝게 보일 때까지 제어 소프트웨어를 사용하여 scanning 및 d scanning 시스템의 진폭과 오프셋을 조정하십시오. 그런 다음 실험에 적절한 Z step을 설정하고 토모그래피 획득 소프트웨어를 실행하십시오. 볼륨은 부분적으로 겹치는 여러 개의 병렬 스택으로 이미징되며, 이미지는 계층적 폴더 구조로 저장됩니다.스티칭 소프트웨어가 완전한 입방체 볼륨으로 작동할 수 있도록, 자동화 소프트웨어를 사용하여 수집된 이미지와 동일한 유형 및 크기를 가지면서 강도는 0인 합성 블랙 이미지로 획득된 볼륨을 채웁니다. 다음으로 Terra, Stitcher, tarly 플러그인이 설치된 VA A 3D 소프트웨어를 실행하고 Terra Stitcher 플러그인을 로드합니다. 이미지가 포함된 볼륨 디렉토리를 선택하고, 기준 오른손 좌표계에 대한 축의 상대적 방향과 복셀 크기를 지정합니다.이제 스티칭(stitching)의 첫 번째 단계를 실행하십시오. 소프트웨어가 스택 쌍 간의 상대적 변위를 계산하여 모든 스택에 대한 최적의 전체 배치를 찾게 됩니다. 스티칭된 볼륨을 단일 해상도 또는 다중 해상도 형식으로 저장하도록 선택하십시오. 후자를 선택하면 tarly 플러그인을 통해 다중 해상도 시각화가 가능합니다.두 경우 모두, 고해상도 이미지가 수 GB보다 큰 경우 멀티 스택(multi-stack) 저장 방식을 선택하고 개별 서브 스택의 크기를 지정하십시오. 이렇게 하면 저장된 데이터에 효율적으로 접근할 수 있습니다. 이제 스티칭(stitching)의 두 번째 단계를 시작하십시오.소프트웨어가 정렬된 스택을 병합하여 단일 스택 또는 멀티 스택 모드로 저장합니다. 완료되면 Terra Stitcher 플러그인을 닫으십시오. 다음으로 terra fly 플러그인을 로드하십시오.멀티 스택 멀티 해상도 볼륨이 포함된 폴더를 선택하고 폭스홀 크기와 축 방향을 지정하십시오. 볼륨은 최저 해상도로 로드됩니다. 더 높은 해상도로 확대하려면 마우스 휠을 사용하십시오.또는 이미지의 특정 지점을 더블 클릭하거나, 기존 랜드마크 주변을 확대하도록 선택하거나, 관심 영역의 좌표를 직접 지정할 수도 있습니다. 해상도를 다시 낮추어 확대 취소를 하려면 마우스 휠을 사용하십시오. 설명된 프로토콜을 통해 물리적 절편 제작 없이도 마우스 뇌 전체 또는 적출된 일부 영역을 마이크론 단위 해상도로 재구성할 수 있습니다.대표적인 결과로서, 생후 10일 된 L7-GFP 마우스의 소뇌 전체 모습이 이 동물에서 보여집니다. 모든 퍼킨(Perkin) 유전자 뉴런은 EGFP로 표지되어 있습니다. 확대하면 소뇌 피질의 전형적인 엽상 구조를 볼 수 있으며, 더 확대하면 각각의 푸르키네(Purkinje) 세포 세포체를 명확하게 구별할 수 있습니다.따라서 기술된 프로토콜은 다양한 신경발달 연구에서 뉴런의 공간적 조직화를 스크리닝하는 데 사용될 수 있습니다. 두 번째 대표적인 결과로, 여기 GFPM 마우스인 성체 흉부의 UN 절단 뇌 이미지를 볼 수 있습니다. 이 형질전환 동물에서는 EGFP가 무작위의 희소한 뉴런 하위 집합에서 발현됩니다.여기 뇌의 우반구가 표시되어 있습니다. 더욱 확대함에 따라 신경세포 돌기가 구분되어 나타납니다. 이 결과는 기술된 프로토콜을 통해 성체 마우스 뇌 전체에서 마이크론 단위의 해상도로 이미징이 가능하며, 이는 세포 수준의 해상도로 뇌 전체의 해부학적 구조를 연구할 수 있는 가능성을 열어준다는 것을 입증합니다.신경퇴행성 질환의 마우스 모델에서, 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3~4일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, GFP 형광을 보존하기 위해 탈수 및 세척 용액을 적절히 필터링하는 것이 중요합니다. 본 문서에서 제시하는 다중 해상도 시각화 도구는 마이크로 광학 단면 토모그래피와 같은 다른 기술로 얻은 매우 큰 데이터 세트를 탐색하는 데에도 사용할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 고정된 마우스 뇌의 염색, 투명화 및 제거 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 공초점 시트 현미경으로 이미지를 촬영하고, Tely 플러그인을 이용해 VR 3D로 재구성된 볼륨을 시각화하는 방법을 학습합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

전체 마우스 기관의 Multiphoton 현미경은 광학 이미징 전에 장기를 삭제하면 가능하지만, 모든 프로토콜은 형광 단백질의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다. 에탄올 기반의 탈수 및 벤질 알코올 광학 개간 방법 사용 : 벤질 벤조산의 개간을, 우리는 전체 마우스 두뇌가 YFP을 표현의 고해상도 multiphoton 이미지를 보여줍니다.

YFP를 표현 잡습니다 마우스 뇌의 Multiphoton 현미경

출처: Etienne, F. et al. 급성 뇌 절편에서 ATP 또는 세로토닌에 대한 미세아교세포 과정의 인력에 대한 이광자 이미징. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 이광자 현미경을 사용하여 뇌 절편에 주입된 화합물에 대한 미세아교세포의 인력을 연구하는 방법을 보여줍니다. 쥐의 뇌 절편을 준비하고, 화학유인제 테스트 화합물을 주입하고, 형광 표지된 미세아교세포를 이미징하여 반응을 시각화하는 방법에 대한 개요를 제공합니다.

쥐 뇌 절편의 화합물에 대한 미세아교세포 돌기 인력을 연구하기 위한 이광자 현미경

출처: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY 조직 투명화를 통한 온전한 신경 수상돌기의 이미징 및 정량화. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오에서는 컨포칼 현미경 및 3D 재구성 기술을 사용하여 수지상 가지, 척추 형태 및 신경 분포를 조사하기 위해 제거된 마우스 뇌의 준비, 이미징 및 분석을 보여줍니다.

Confocal Microscopy Imaging of intact dendritic arbors and spine morphology in a cleared mouse brain(투명화된 쥐 뇌에서 온전한 수지상 가지와 척추 형태에 대한 컨포칼 현미경 이미징)

여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.

모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

우리는 조직 변형 및 염색의 새로운 발전과 축 방향 스캔 라이트 시트 현미경의 개발을 결합하여 전체 마우스 심장의 메조스코픽 재구성 방법을 보고합니다.

전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징

이 프로토콜은 iDISCO+를 사용하여 온전한 마우스 뇌의 자기 공명 영상, 제거 및 면역 표지를 수행하는 방법을 설명한 다음, 라이트 시트 현미경을 사용한 이미징 및 NuMorph를 사용한 다운스트림 분석에 대한 자세한 설명을 설명합니다.

MRI, 조직 투명화 및 라이트 시트 현미경을 사용한 온전한 신생아 마우스 뇌의 전뇌 단일 세포 이미징 및 분석

본 프로토콜은 (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging(대규모 인간 뇌 영상에서 광시트 형광 현미경을 위한 광학 투명화 및 라벨링)

우리는 광학 다층 간섭 단층촬영(OMLIT)이라는 새로운 영상 기술을 도입했는데, 이는 뇌 표본의 모든 세포를 중간 규모에서 편향 없이 촬영할 수 있게 하며, 동일한 샘플에 대한 테이프 기반 직렬 주사 전자현미경의 영상 워크플로우에 원활하게 통합할 수 있게 합니다.

중간경적 전세포 뇌 지도화를 위한 주사 전자현미경 호환 광학 영상 방법

이 프로토콜은 형광 스티렌 미세구를 이용한 생 체 내 2광자 현미경 영상에 최적화된 만성 두개골 창문 및 미세혈관 색전증 마우스 모델에 대한 단계별 접근법을 상세히 설명하고 있습니다.

형광 폴리스티렌 미세구를 이용한 생체 내 2광자 현미경용 미세혈관 색전증 마우스 모델

학습하세요 공초점 빛 시트 현미경을 이용하여 전체 마우스 두뇌를 마이크론 규모 해상도로 광학 단층 촬영하는 방법을. 이 기법은 신경과학 연구에서 뉴런 분포를 정밀 분석하는 데 활용됩니다.

공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

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