공 초점 빛 시트 현미경 전체 마우스 두뇌의 마이크론 규모의 해상도 광학 단층 촬영

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 뇌 전체를 마이크론 수준의 해상도로 재구성하고 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 고정된 마우스 뇌의 tetrahedran 시리즈를 탈수시킵니다. 두 번째 단계는 Benzyl Ether를 사용하여 시료를 투명화하는 것입니다.

다음으로, 공초점 라이트 시트 현미경을 사용하여 뇌를 촬영합니다. 마지막 단계는 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지 스택을 정렬하고 접합하는 것입니다. 최종적으로, 다중 해상도 시각화 도구를 사용하여 재구성된 이미지 볼륨을 탐색할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 공초점 현미경이나 광시트 현미경과 같은 다른 방법들에 비해 단 며칠 만에 마우스 뇌의 전체 부피를 영상화할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 뇌 전체에 걸친 다양한 신경세포 유형의 분포와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법이 뇌의 미세한 해부학적 구조에 대한 통찰력을 제공할 수 있을까요?

이 방법은 생쥐 배아 또는 초파리에도 적용할 수 있으며, 이는 해당 절차가 재현 가능함을 입증합니다. 저희 실험실의 대학원생이 수행하였습니다. 이 프로토콜을 시작하려면, 경심장 관류를 통해 생쥐 뇌를 표준 고정하고, 탈수 및 투명화 작업을 수행하기 전에 하룻밤 동안 후고정하십시오.

탈수 용매인 THF는 XFP 형광을 강하게 소광시키므로, 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 염기성 활성 산화알루미늄으로 과산화물을 제거하는 여과 과정을 수행하십시오. 이때 컬럼에 균열이 생기지 않도록 주의하여, 최종 용액의 안정제에 의한 과산화물 제거 효율이 떨어지는 것을 방지하십시오. 여과 전에 THF가 이미 안정화되어 있었더라도, 안정제는 산화알루미늄에 의해 제거됩니다. 안정제가 없는 THF는 다량의 과산화물을 생성할 수 있으며, 폭발 위험이 있어 위험하다는 점에 유의하십시오.

다음으로, 순수한 물에서 THF 통합 시리즈의 전체 마우스 뇌를 탈수합니다. 그다음 샘플이 담긴 바이알을 회전 휠에 올려 빛에 노출되지 않도록 합니다. 바이알을 알루미늄 호일로 감쌉니다.

마지막으로, 여과 깔때기를 사용하여 알루미늄 옥사이드로 투명화 용매를 여과합니다. 그런 다음 100% DBE에서 시료를 투명화하며, 뇌가 투명해 보이면 3시간과 6시간 후에 용액을 교체합니다. 일반적으로 두 번째 DBE 교체 1시간 후, 본 영상에서 제시한 방법 중 하나를 사용하여 기울어진 이미징 플레이트에 시료를 고정합니다.

Agros 디스크를 이용한 직접 마운팅 또는 agro 스피커를 이용한 마운팅의 경우, 직접 마운팅을 위해 샘플을 팁 중 하나에 조심스럽게 플런지(plunge)하여 aros 디스크 플런지를 사용합니다. 6% aros 겔로 제작된 디스크를 팁 위에 올립니다. 그런 다음 아크릴 접착제로 샘플을 agros 디스크에 조심스럽게 고정하고, 마운팅을 위해 약 1분 동안 경화될 때까지 기다립니다.

agros 비커 플런저를 사용하여 3% agros 겔로 제작된 비커를 팁 위에 올립니다. 그런 다음 샘플을 비커 바닥에 조심스럽게 배치합니다. 이러한 방법 중 하나를 사용하여 시료를 고정한 후, 핀셋을 사용하여 시료 챔버 내부에 이미징 플레이트를 위치시킵니다.

그런 다음 챔버를 투명화 용액으로 채웁니다. 다음으로 토모그래피를 준비합니다. 먼저, 가능한 많은 형광을 수집하기 위해 슬릿을 제거한 후, 낮은 레이저 출력으로 시료를 조사합니다.

광퇴색을 방지하기 위해 소프트웨어 제어 마이크로 포지셔닝 시스템을 사용하여 시료를 x, y, z 세 방향으로 이동시킵니다. 각 방향에 대해 시료가 카메라의 시야 내에 있으면서 조명되는 최소 및 최대 좌표를 확인합니다. 그런 다음 결정된 좌표를 프리 토모그래피 서브루틴의 파라미터로 입력합니다.

또한 토모그래피에 사용할 인접 스택 간의 거리와 Z축 방향의 프리 토모그래피 샘플링 단계를 지정하십시오. 마지막으로, 이전 단계에서 지정한 Z 샘플링 파라미터에 따라 모든 스택의 이미지를 수집하는 프리 토모그래피를 시작하십시오. 획득을 시작하려면 먼저 마이크로 포지셔닝 시스템을 사용하여 샘플을 라이트 시트 외부로 이동시키십시오.

그런 다음 레이저 출력을 높이고 모든 스캐닝 시스템의 움직임을 멈추어 시야 중심의 고정된 라인만 조명되도록 합니다. 다음으로 슬릿을 장착하고 투명화 용액의 자가형광 신호를 이용하여 정렬합니다. 이제 시야 중심에 슬릿 라인이 명확하게 보여야 합니다.

이제 스캐닝 시스템을 다시 활성화하십시오. 레이저 출력을 낮추고 마이크로 포지셔닝 시스템을 사용하여 샘플을 라이트 시트 내부로 이동시킵니다. 슬릿을 사용할 때의 레이저 출력은 슬릿을 사용하지 않을 때보다 더 높게 설정됨에 유의하십시오.

공간 필터가 상당한 양의 빛을 차단하므로, 이미지가 선명하고 밝게 보일 때까지 제어 소프트웨어를 사용하여 scanning 및 d scanning 시스템의 진폭과 오프셋을 조정하십시오. 그런 다음 실험에 적절한 Z step을 설정하고 토모그래피 획득 소프트웨어를 실행하십시오. 볼륨은 부분적으로 겹치는 여러 개의 병렬 스택으로 이미징되며, 이미지는 계층적 폴더 구조로 저장됩니다.

스티칭 소프트웨어가 완전한 입방체 볼륨으로 작동할 수 있도록, 자동화 소프트웨어를 사용하여 수집된 이미지와 동일한 유형 및 크기를 가지면서 강도는 0인 합성 블랙 이미지로 획득된 볼륨을 채웁니다. 다음으로 Terra, Stitcher, tarly 플러그인이 설치된 VA A 3D 소프트웨어를 실행하고 Terra Stitcher 플러그인을 로드합니다. 이미지가 포함된 볼륨 디렉토리를 선택하고, 기준 오른손 좌표계에 대한 축의 상대적 방향과 복셀 크기를 지정합니다.

이제 스티칭(stitching)의 첫 번째 단계를 실행하십시오. 소프트웨어가 스택 쌍 간의 상대적 변위를 계산하여 모든 스택에 대한 최적의 전체 배치를 찾게 됩니다. 스티칭된 볼륨을 단일 해상도 또는 다중 해상도 형식으로 저장하도록 선택하십시오. 후자를 선택하면 tarly 플러그인을 통해 다중 해상도 시각화가 가능합니다.

두 경우 모두, 고해상도 이미지가 수 GB보다 큰 경우 멀티 스택(multi-stack) 저장 방식을 선택하고 개별 서브 스택의 크기를 지정하십시오. 이렇게 하면 저장된 데이터에 효율적으로 접근할 수 있습니다. 이제 스티칭(stitching)의 두 번째 단계를 시작하십시오.

소프트웨어가 정렬된 스택을 병합하여 단일 스택 또는 멀티 스택 모드로 저장합니다. 완료되면 Terra Stitcher 플러그인을 닫으십시오. 다음으로 terra fly 플러그인을 로드하십시오.

멀티 스택 멀티 해상도 볼륨이 포함된 폴더를 선택하고 폭스홀 크기와 축 방향을 지정하십시오. 볼륨은 최저 해상도로 로드됩니다. 더 높은 해상도로 확대하려면 마우스 휠을 사용하십시오.

또는 이미지의 특정 지점을 더블 클릭하거나, 기존 랜드마크 주변을 확대하도록 선택하거나, 관심 영역의 좌표를 직접 지정할 수도 있습니다. 해상도를 다시 낮추어 확대 취소를 하려면 마우스 휠을 사용하십시오. 설명된 프로토콜을 통해 물리적 절편 제작 없이도 마우스 뇌 전체 또는 적출된 일부 영역을 마이크론 단위 해상도로 재구성할 수 있습니다.

대표적인 결과로서, 생후 10일 된 L7-GFP 마우스의 소뇌 전체 모습이 이 동물에서 보여집니다. 모든 퍼킨(Perkin) 유전자 뉴런은 EGFP로 표지되어 있습니다. 확대하면 소뇌 피질의 전형적인 엽상 구조를 볼 수 있으며, 더 확대하면 각각의 푸르키네(Purkinje) 세포 세포체를 명확하게 구별할 수 있습니다.

따라서 기술된 프로토콜은 다양한 신경발달 연구에서 뉴런의 공간적 조직화를 스크리닝하는 데 사용될 수 있습니다. 두 번째 대표적인 결과로, 여기 GFPM 마우스인 성체 흉부의 UN 절단 뇌 이미지를 볼 수 있습니다. 이 형질전환 동물에서는 EGFP가 무작위의 희소한 뉴런 하위 집합에서 발현됩니다.

여기 뇌의 우반구가 표시되어 있습니다. 더욱 확대함에 따라 신경세포 돌기가 구분되어 나타납니다. 이 결과는 기술된 프로토콜을 통해 성체 마우스 뇌 전체에서 마이크론 단위의 해상도로 이미징이 가능하며, 이는 세포 수준의 해상도로 뇌 전체의 해부학적 구조를 연구할 수 있는 가능성을 열어준다는 것을 입증합니다.

신경퇴행성 질환의 마우스 모델에서, 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3~4일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, GFP 형광을 보존하기 위해 탈수 및 세척 용액을 적절히 필터링하는 것이 중요합니다. 본 문서에서 제시하는 다중 해상도 시각화 도구는 마이크로 광학 단면 토모그래피와 같은 다른 기술로 얻은 매우 큰 데이터 세트를 탐색하는 데에도 사용할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 고정된 마우스 뇌의 염색, 투명화 및 제거 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 공초점 시트 현미경으로 이미지를 촬영하고, Tely 플러그인을 이용해 VR 3D로 재구성된 볼륨을 시각화하는 방법을 학습합니다.